Un metodo per generare polmonare Neutrofilia Uso inalato Lipopolisaccaride

Descriviamo un metodo per indurre l'infiammazione polmonare neutrofila dalla sfida di lipopolysaccharide aerosol per nebulizzazione, per modellare danno polmonare acuto. Inoltre, sono anche descritti tecniche chirurgiche di base per l'isolamento del polmone, l'intubazione tracheale e lavaggio broncoalveolare.

L'obiettivo generale di questa procedura è generare neutrofilia delle vie aeree coerente e riproducibile mediante esposizione a LPS aerosolizzato. Ciò si ottiene caricando prima l'LPS sospeso in soluzione salina in un nebulizzatore collegato a una camera di esposizione. Successivamente, i topi vengono esposti all'LPS aerosolizzato e quindi viene raccolto il lavaggio broncoalveolare e vengono enumerate le cellule infiammatorie nel lavaggio.

Infine, il tessuto polmonare viene fissato, formalmente per l'inclusione e il sezionamento e l'analisi immunoistochimica. In definitiva, la conta totale e differenziale delle cellule del lavaggio broncoalveolare può essere utilizzata per valutare il reclutamento dei neutrofili nei polmoni. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la somministrazione intratracheale di LPS sono la distribuzione uniforme di LPS aerosolizzato in tutti i polmoni, la facilità di esecuzione e l'allenamento minimo richiesto per un'applicazione di successo Per generare un aerosol LPS utilizzando DPI adeguati e all'interno di una cappa ventilata di livello due a rischio biologico, iniziare inserendo un ingresso rosso in un nebulizzatore e quindi collegando il nebulizzatore all'aria ambiente pressurizzata tramite il tubo fornito dal fabbricante.

Quindi, utilizzare un filtro dell'aria per collegare l'uscita del nebulizzatore a un misuratore di portata massica, quindi collegare il misuratore di portata massica a un'alimentazione elettrica. Regolare il flusso d'aria a cinque litri al minuto, mantenendo la pressione a uno o due bar, quindi rimuovere il flussometro di massa e scollegare il flusso d'aria. Successivamente, collegare l'uscita del nebulizzatore a un tubo biforcatore da 15,9 millimetri collegato a scatole in plexiglass da 2 1 50 x 1 63 x 2 0 5 millimetri dotate di coperchi rimovibili.

Ogni scatola dovrebbe avere un foro di cinque millimetri sul lato opposto all'ingresso per evitare l'accumulo di pressione. Ora metti fino a cinque topi in ogni scatola e chiudi i coperchi. Quindi aprire il nebulizzatore.

Riempire l'inserto con quattro-otto millilitri di LPS disciolto in soluzione fisiologica o in solo veicolo salino e ricollegare l'ingresso all'alimentazione dell'aria. Lasciare fluire l'aerosol nelle scatole di plexiglass chiuse monitorando continuamente gli animali e assicurandosi che l'alimentazione d'aria rimanga ben fissata all'ingresso del nebulizzatore durante l'aerosolizzazione. Dopo 10 minuti, scollegare l'alimentazione dell'aria e lasciare gli animali nelle scatole di plexiglass per altri due minuti.

Quindi aprire i coperchi. Lasciare che l'aerosol si disperda e riportare i topi nelle loro gabbie al punto finale sperimentale Per ogni animale a turno, utilizzare prima le forbici per eseguire un singolo taglio anteriore posteriore per esporre il torace. Quindi, sollevare la gabbia toracica dalla punta anteriore dello sterno e perforare il diaframma nel punto più ventrale senza tagliare alcun tessuto polmonare.

Quindi aprire la gabbia toracica con due tagli che si incontrano sotto la mascella in direzione antero-posteriore. Una volta aperta la gabbia toracica, usa una pinza per separarla delicatamente e tagliare la trachea sotto la laringe. Ora solleva la trachea e taglia i legamenti che collegano i lobi polmonari alla cavità toracica.

Quindi tirare delicatamente i polmoni e la trachea verso l'alto e allontanarli dal tessuto adiposo e cardiaco e posizionarli su un pezzo di carta da siringa. Quindi, inserisci un tubo di polietilene da 0,965 millimetri nella trachea e fissalo con un filo di seta. Lega anche il multilobo con filo di seta, quindi inserisci un ago calibro 23 nel tubo di polietilene.

Quindi, per raccogliere il lavaggio broncoalveolare, utilizzare una siringa da un millilitro per iniettare lentamente 250 microlitri di ghiaccio chiamato PBS sterile nel singolo lobo, e per picchiettare con cura i polmoni e contro la superficie del banco di lavoro 30 volte aspirare lentamente il liquido nella siringa e raccoglierlo in un tubo dopo aver ripetuto la procedura con 200 microlitri di PBS fresco, Posizionare il lavaggio broncoalveolare sul ghiaccio per un'analisi successiva. Per fissare il tessuto polmonare per l'analisi istologica, rimuovere il multilobo e fare clic. Congelalo su ghiaccio secco.

Conservare il lobo a meno 80 gradi Celsius. Per fissare il tessuto per l'analisi istologica, montare una siringa da 60 millilitri senza stantuffo su un supporto metallico, insufflare il singolo lobo con formalina per cinque minuti. Quindi scollegare l'ago e tirare il filo di seta per rimuoverlo insieme al tubo di polietilene dalla trachea.

Contemporaneamente chiude la trachea e mantiene la pressione nel polmone. Quindi, immergere il lobo in Formin per 24 ore a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare il fazzoletto fissato tre volte per almeno 20 minuti ogni volta in etanolo al 70%.

Dopo aver incorporato il tessuto disidratato in para film, tagliare il lobo in sezioni da quattro a cinque micron e colorare le sezioni con ematina ed eoina per la valutazione istologica. Il numero totale di cellule nel liquido di lavaggio broncoalveolare dei topi esposti a un aerosol generato con il solo veicolo è tipicamente intorno o inferiore a 200.000 cellule. Le cellule sono costituite dal 95 al 100% da cellule mononucleate con solo pochi linfociti e nessun neutrofilo.

I topi sono stati sfidati con un milligrammo per millilitro di aerosol. LPS. Tuttavia, mostrano un aumento del numero totale di cellule nel liquido di lavaggio broncoalveolare, tipicamente superiore a 500.000 cellule dopo sei ore con infiltrati cellulari che rimangono alti dopo 24 ore e con un profilo cellulare spostato verso una predominanza di neutrofili. Un profilo cellulare infiammatorio e neutrofilia polmonare simili si osservano anche con una nebulizzazione di cinque milligrammi per millilitro di LPS.

I neutrofili sono stati osservati nella sottomucosa epiteliale e negli spazi circostanti le vie aeree conduttrici e i vasi sanguigni dopo sei e 24 ore di test di provocazione con LPS, ma non in controllo. Topi trattati con soluzione salina. Il contenuto proteico totale nel liquido di lavaggio broncoalveolare dei topi LPS challenge è aumentato rispetto ai topi esposti a soluzione salina e l'espressione delle chemochine chemio-attrattive dei neutrofili c, XCL uno e C XCL due è aumentata anche nei topi LPS challenge.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sull'infiammazione polmonare indotta da LP. Può anche essere applicato ad altri modelli di malattia come le infezioni batteriche o virali, poiché il vapore aerosolizzato può essere adattato per offrire molte sfide diverse.