Name: Un metodo per generare polmonare Neutrofilia Uso inalato Lipopolisaccaride (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Scopri un metodo per generare neutrofilia polmonare usando LPS aerosolizzato nei topi. Questa tecnica include nebulizzazione, lavaggio broncoalveolare e analisi istologica per studiare l'infiammazione acuta del polmone.

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Vorremmo ringraziare Kerstin Thim (AstraZeneca, Lund, Svezia), Benita Dahlberg e Dr. Anders Eklund (Karolinska Institutet, Stoccolma, Svezia) e Dr. Martin Stampfli (McMaster University, Hamilton, ON, Canada) per l&#39;assistenza abile e la consulenza di esperti.

Gli studi su animali sono state approvate dal comitato etico del benessere degli animali del nord di Stoccolma. Le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con il diritto svedese. 1. Creazione di un LPS Aerosol <ol><li> Sciogliere 0,5 g purificato P. aeruginosa LPS in 50 ml di soluzione fisiologica sterile e scuotendo con cautela e verificare la dissoluzione. Diluire 1 ml LPS disciolti in 9 ml salina sterile ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. Proteggere dalla luce con un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C. </li><li> Scongelare LPS solubilizzate al buio a temperatura ambiente e mescolare bene immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> In una cappa rischio biologico ventilata livello II, inserire un ingresso rosso in un nebulizzatore, e collegare il nebulizzatore ad aria ambiente pressurizzata attraverso il tubo fornito dal (regime revisione presentando i dispositivi sperimentali in figura 1) produttore. ATTENZIONE: attrezzature protettive adeguate, tra cui un mezzo facciale respirat riutilizzabileo con filtri antiparticolato, occhiali, guanti e indumenti protettivi dovrebbero essere utilizzati nel corso dell&#39;esposizione. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Rappresentazione schematica dei dispositivi sperimentali utilizzati per generare un aerosol L&#39;ingresso del nebulizzatore è collegato ad un&#39;alimentazione di aria. L&#39;uscita del nebulizzatore viene collegato a un flussometro attraverso un tubo di 15,9 millimetri e un filtro dell&#39;aria, e la fornitura di aria viene regolato a 5,0 L / m 2 a pressione kbar. L&#39;uscita è vicino collegato a una scatola in plexiglas dotato di coperchi rimovibili e fori da 5 mm per evitare l&#39;accumulo di pressione. <ol start="4"><li> Collegare l&#39;uscita del nebulizzatore ad un flussimetro di massa tramite un filtro dell&#39;aria. Collegare il flussimetro di massa ad un&#39;alimentazione elettrica. </li><li> Regolare l&#39;alimentazione di aria a 5 l / min, con una pressione rimanendo a 1,0-2,0 bar. </li><li> Rimuovere il misuratore di portata e di massascollegare l&#39;alimentazione dell&#39;aria. </li><li> Collegare l&#39;uscita del nebulizzatore ad un tubo 15,9 millimetri, che si biforca e si collega a due scatole plexiglas con le dimensioni: 150 x 163 x 205 mm, provvista di coperchi amovibili. Ogni scatola dovrebbe avere un foro 5 mm sul lato opposti l&#39;ingresso, per evitare l&#39;accumulo di pressione. </li><li> Luogo fino a 5 topi in ogni scatola di plexiglas e chiudere le palpebre. </li><li> Aprire il nebulizzatore e riempire l&#39;inserto con almeno 4 ml LPS disciolti in soluzione fisiologica sterile o solo veicolo (soluzione fisiologica sterile, il volume non dovrebbe superare 8 ml). Ri-collegare l&#39;ingresso per l&#39;aria di alimentazione. </li><li> Consentire l&#39;aerosol di fluire nelle caselle plexiglas chiuso per 10 min. Monitorare gli animali continua. Assicurarsi che l&#39;alimentazione dell&#39;aria rimane saldamente assicurato all&#39;ingresso del nebulizzatore. </li><li> Staccare l&#39;alimentazione dell&#39;aria. Con i coperchi chiuso, lasciare che gli animali rimangono nelle caselle plexiglas per 2 min. </li><li> Aprire i coperchi e consentire l&#39;aerosol a disperdere, e restituire agli animali di tlui gabbie. Se gli animali appaiono bagnati, posizionare le gabbie su una piastra elettrica impostato su fuoco basso, per evitare l&#39;ipotermia. </li><li> Monitorare gli animali in continuo per i primi 30 minuti, e successivamente ogni 2 ore per le prime 6 ore. Gli animali devono presentare alterazioni della respirazione normale e l&#39;attività durante e dopo la procedura di nebulizzazione. </li></ol> 2. lavaggio broncoalveolare (BAL) <ol><li> Al punto finale sperimentale, profondamente anestetizzare gli animali con isoflurano ad effetto come raccomandato dal personale veterinario del proprio istituto. Pizzica la zampa posteriore per controllare un riflesso di ritiro per garantire una sufficiente profondità dell&#39;anestesia per condurre interventi di chirurgia maggiore. Spray giù la pelliccia degli animali con il 70% di etanolo. </li><li> Aprire l&#39;addome con le forbici, e tagliare l&#39;aorta per Exsanguinate l&#39;animale. Posizionare un pezzo di tessuto sopra l&#39;addome per assorbire il sangue. </li><li> Follwing eutanasia, utilizzare un unico taglio antero-posteriore delle forbici peresporre il torace. Sollevare la gabbia toracica dalla punta anteriore dello sterno e usare le forbici per forare il diaframma nel punto più ventrale, senza intaccare alcun lobo polmonare. Aprire la gabbia toracica, facendo due tagli in direzione antero-posteriore (riunioni sotto la mascella). </li><li> Tirare delicatamente a parte la gabbia toracica con pinze, e tagliare la trachea sotto la laringe. </li><li> Sollevare la trachea con le pinze e rimuovere i polmoni tagliando i legamenti che collegano i lobi alla cavità toracica, e tirando delicatamente dal adiposo e tessuto cardiaco. </li><li> Inserire un tubo di polietilene (diametro interno: 0,58 millimetri; diametro esterno: 0,965 millimetri) nella trachea e fissare il tubo con una stringa di filo di seta. </li><li> Legare il multilobe (i quattro lobi del polmone destro) con filo di seta. </li><li> Inserire un ago calibro 23 nel tubo di polietilene e iniettare lentamente 250 ml di ghiaccio freddo PBS sterile nel singolo lobo con una siringa da 1 ml. </li><li> Toccare con attenzione i polmoni30 volte e raccogliere il liquido attraverso la siringa. Ripetere la procedura con 200 microlitri di PBS (circa 300 ml PBS deve essere recuperato dal singolo lobo dal volume totale iniettato 450 ml). </li><li> Tenere il liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL) su ghiaccio, o elencare immediatamente le cellule BAL. Contare le cellule con un heamocytometer, usando la soluzione Turk per colorare le cellule 11. Calcolare il numero totale di cellule moltiplicando il numero di cellule con il fattore di diluizione della soluzione colorante e il volume nel campo conteggiato del heamocytometer. </li><li> Preparare la conta cellulare differenziata dalle cellule cytocentrifuged come descritto altrove 11. </li></ol> 3. formalina Fissazione di tessuto polmonare per la valutazione istologica <ol><li> Rimuovere il multilobe e snap-freeze in ghiaccio secco. Conservare a -80 ° C. </li><li> Montare una siringa da 60 ml con lo stantuffo rimosso su un cavalletto di sostegno metallico. Riempire la siringa con il 10% di formalina perl&#39;altezza di 20 cm sopra il banco di laboratorio, in rappresentanza di 20 cm di pressione costante. </li><li> Collegare l&#39;ago calibro 23 fissata alla trachea alla siringa 60 ml con un tubo di plastica con una valvola per controllare il flusso di formalina. </li><li> Insufflare il lobo polmonare con formalina per 5 min. Scollegare l&#39;ago e rimuoverlo insieme al tubo di polietilene dalla trachea tirando sul filo di seta per chiudere la trachea e mantenere la pressione nel polmone. </li><li> Immergere il lobo polmonare in formalina e fissare per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare il tessuto fissato tre volte per almeno 20 min con 70% di etanolo, e disidratare a xilene attraverso il seguente schema (1 ora ciascuno): <ul><li> 3x 70% di etanolo </li><li> 3x 95% di etanolo </li><li> 3x 100% di etanolo </li><li> 3x xilene </li><li> 1x (liquido) paraffina </li></ul></li><li> Tessuto Incorpora disidratati in paraffina, tagliato a 4-5 micron sezioni, e macchia con ematossilina e eosina per consentire la valutazione istologica.</li>
</ol>

<ol><li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Pesci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+and+mediators+in+bronchial+lavage+of+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).</li>
<li>Hoogerwerf, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Inflammation+Induced+by+Lipoteichoic+Acid+or+Lipopolysaccharide+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung Inflammation Induced by Lipoteichoic Acid or Lipopolysaccharide in Humans.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178, 34-41 (2008).</li>
<li>Scheuchenzuber, W. J., Eskew, M. L., Zarkower, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+humoral+responses+to+Escherichia+coli+and+sheep+red+blood+cell+antigens+introduced+via+the+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative humoral responses to Escherichia coli and sheep red blood cell antigens introduced via the respiratory tract.</a> Exp Lung Res. 13, 97-112 (1987).</li>
<li>Asti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice.+I.+Concomitant+evaluation+of+inflammatory+cells+and+haemorrhagic+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced lung injury in mice. I. Concomitant evaluation of inflammatory cells and haemorrhagic lung damage.</a> Pulm Pharmacol Ther. 13, 61-69 (2000).</li>
<li>Brand, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+deposition+of+therapeutic+particles+during+spontaneous+and+controlled+inhalations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pharmaceutical+sciences%22%5BJournal%5D)">Total deposition of therapeutic particles during spontaneous and controlled inhalations.</a> Journal of pharmaceutical sciences. 89, 724-731 (2000).</li>
<li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trubel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats%3A+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li>
<li>Skerrett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+type+1+TNF+receptor+in+lung+inflammation+after+inhalation+of+endotoxin+or+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).</li>
<li>Roos, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial-C%2FEBPbeta+contributes+to+LPS-induced+inflammation+and+its+suppression+by+formoterol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial-C/EBPbeta contributes to LPS-induced inflammation and its suppression by formoterol.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423, 134-139 (2012).</li>
<li>Didon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein-beta+is+necessary+for+the+integrity+of+inflammatory+responses+to+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).</li>
<li>Silverpil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+on+IL-23+exerted+by+IL-17A+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation.</a> Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).</li>
<li>Mercer, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase-Activated+Receptor-1%2C+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li>
<li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li>
<li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Exacerbations+of+COPD%3A+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li>
<li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHurst%2C+JR+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22">Am. J. Respir. Crit. Care Med</a>. 173, 71-78 (2006).</li>
<li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%3A+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
</ol>

Abraham Roos ha ricevuto i diritti docente da Boehringer Ingelheim, borse viaggio da AstraZeneca R &amp; S e di un assegno di ricerca da AstraZeneca R &amp; S. Magnus Nord è un dipendente a tempo pieno di AstraZeneca R &amp; S e ha ricevuto assegni di ricerca da AstraZeneca R &amp; S. Johan Grunewald e Tove Berg sono co-ricercatori su un progetto di ricerca finanziato dalla correlato AstraZeneca R &amp; S.

Inalato LPS genera una risposta infiammatoria nelle vie aeree, caratterizzata dai neutrofili nella sottomucosa epiteliale, spazi circostanti vie aeree di conduzione, nonché gli spazi alveolari. Questo è, unitamente alla maggiore contenuto proteico totale BALF, indicative di perdite plasma, rappresentativo della patologia del danno polmonare acuto. Come LPS induce una infiammazione sterili, la reazione è indipendente della risposta immunitaria adattativa, e ci sono limitazioni alla rilevanza alle infezioni batteriche. La...

Lipopolisaccaride (LPS) è un componente della parete cellulare di batteri gram negativi 1. Sfida a LPS è un modello ben documentato di danno polmonare acuto, una sindrome caratterizzata da infiammazione neutrofila acuta e l&#39;edema 2. Inoltre, neutrofilia polmonare è anche un segno distintivo della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) 3, e LPS sfida negli esseri umani è stato utilizzato per modellare riacutizzazioni della BPCO 4. Così, modelli sperimentali di esposizione LPS sono clinicamente rilevanti e preziosi strumenti per comprendere la patologia umana. L&#39;obiettivo della consegna polmonare di LPS aerosol qui descritte è quello di generare una risposta infiammatoria neutrofili nella conduzione e vie respiratorie, senza coinvolgimento sistemico. Diverse tecniche di LPS sfida sono stati descritti in precedenza. Iniezione intra-venosa di LPS è il percorso più comunemente usato di somministrazione. Sebbene questa tecnica è facilmente accessibile, tche danno primario è all&#39;endotelio, distruzione secondaria dell&#39;epitelio polmonare conseguente migrazione dei neutrofili al polmone. Somministrazione intra-venosa induce anche l&#39;infiammazione sistemica 2, che può complicare il quadro clinico in modelli animali. Infiammazione sistemica è in contrasto non osservati con la somministrazione intra-tracheale. Questa tecnica, tuttavia, è laborioso e richiede anestetici e notevole formazione 5, 6. Inoltre, la deposizione polmonare da questa via di somministrazione dipende respirazione 7. Così, la deposizione polmonare è influenzato dalla profondità dell&#39;anestesia necessari per la somministrazione intra tracheale e la deposizione nelle vie aeree variabili possono essere osservate. Al contrario, la consegna polmonare con LPS aerosol richiede un addestramento minimo, e può essere facilmente realizzata su un gran numero di animali con poca o nessuna variazione tra individui 5, 8.Un recente studio conferma che la consegna aerosol è superiore al percorso intra-tracheale in materia di deposito, e che dosi più rilevanti di LPS induce infiammazione neutrofila con questo modello 8. Studi precedenti hanno dimostrato che sfida per aereosol Psuedomonas aeruginosa LPS genera una risposta infiammatoria marcato nel lume delle vie aeree e del parenchima polmonare, inclusi gli spazi alveolari 9, 10. L&#39;infiammazione è caratterizzata da una predominanza di neutrofili e presenza di edema polmonare, e può quindi essere utilizzato per affrontare patogenesi del danno polmonare acuto e acquisire ulteriori conoscenze dei meccanismi che contribuiscono alla patologia malattia.

<table><tbody><tr><td>LPS purificato da &lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Nocivo. Si raccomanda la purificazione. Si può utilizzare LPS purificato da altri batteri.</td></tr><tr><td>Nebulizzatore Pari LC sprint star</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>Flussimetro a massa TSI 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>È possibile utilizzare un prodotto alternativo dello stesso fornitore.</td></tr><tr><td>Tubo Tygon Saint-Gobain da 15,9 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>Marchio consigliato.</td></tr><tr><td>Scatole in plexiglas con coperchi rimovibili</td><td>Prodotto su misura</td><td>N/D</td><td>150 x 163 x 205 mm (con un foro da 2 mm sul lato).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Respiratore semimascherina riutilizzabile 3M</td><td>3M</td><td>7503</td><td>Marchio consigliato.</td></tr><tr><td>Filtri particolati avanzati 3M (P100)&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>Marchio consigliato.</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>Possono essere utilizzate le forbici preferite.</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>Possono essere utilizzate le pinze preferite.</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene Intramedic PE50</td><td>BD</td><td>427411</td><td>Marchio consigliato.</td></tr><tr><td>Filo di seta Perma-hand Ethicon 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>Marchio consigliato.</td></tr><tr><td>Ago da 26&amp;frac12; gauge</td><td></td><td></td><td>Esistono fornitori alternativi.</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml BD con punta liscia, non sterile</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>Esistono fornitori alternativi.</td></tr><tr><td>Siringa BD da 60 ml con connettore Luer-Lok, non sterile, in polipropilene</td><td>BD</td><td>301035</td><td>Esistono fornitori alternativi.</td></tr><tr><td>Ematossilina-eosina Fluka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>Esistono fornitori alternativi.</td></tr><tr><td>Soluzione di &amp;uuml;Türk</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td></td><td></td><td>Esistono produttori alternativi.</td></tr><tr><td>Citocentrifuga Cytospin 4</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>È possibile utilizzare una centrifuga alternativa.</td></tr><tr><td>Kit di colorazione HEMA-3 stat pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>Esistono kit di colorazione alternativi.</td></tr><tr><td>Soluzione di formalina neutra tampone al 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Esistono fornitori alternativi.</td></tr></tbody></table>

un metodo per generare polmonare neutrofilia uso inalato lipopolisaccaride

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Danno polmonare acuto (ALI) è una grave malattia caratterizzata da neutrofilia alveolare, con opzioni di trattamento limitate e alta mortalità. Modelli sperimentali di ALI sono fondamentali nel migliorare la nostra comprensione della patogenesi della malattia. Lipopolisaccaride (LPS) derivato da batteri Gram-positivi induce infiammazione neutrofila delle vie aeree e del parenchima polmonare dei topi. Consegna polmonare efficiente di composti quali LPS è tuttavia difficile da raggiungere. Nell&#39;approccio qui descritto, consegna polmonare nei topi si ottiene sfida di aerosol di Pseudomonas aeruginosa LPS. Disciolto LPS era aerosol da un nebulizzatore collegato ad aria compressa. I topi sono stati esposti a un flusso continuo di LPS aerosol in una scatola plexiglas per 10 minuti, seguito da 2 minuti condizionata, dopo l&#39;aerosol è stato interrotto. L&#39;intubazione tracheale e successivo lavaggio broncoalveolare, seguita da perfusione formalina è stata eseguita successiva, che consente caratterizzazione del p steriliinfiammazione ulmonary. Inalato LPS genera una infiammazione polmonare caratterizzata da neutrofilia alveolare, rilevata in lavaggio broncoalveolare e da una valutazione istologica. Questa tecnica può essere impostato ad un piccolo costo con pochi elettrodomestici, e richiede un minimo di formazione e competenza. Il sistema di esposizione può quindi essere eseguita di routine in qualsiasi laboratorio, con la possibilità di migliorare la nostra comprensione della patologia polmonare.

Sfida di aerosol P. aeruginosa LPS solito produce una risposta infiammatoria marcata nel lume delle vie aeree e lo spazio alveolare, caratterizzato da una predominanza di neutrofili in entrambi i punti temporali precoce e tardiva. Inalato LPS induce neutrofilia polmonare C57BL / 6BY e BALB / c topi sono stati esposti ad aerosol P. aeruginosa LPS o solo veicolo e neutrofili sono stati enumerati in BALF. Il numero totale di cellule in BALF di C57BL /...

Descriviamo un metodo per indurre l&#39;infiammazione polmonare neutrofila dalla sfida di lipopolysaccharide aerosol per nebulizzazione, per modellare danno polmonare acuto. Inoltre, sono anche descritti tecniche chirurgiche di base per l&#39;isolamento del polmone, l&#39;intubazione tracheale e lavaggio broncoalveolare.

Un metodo per generare polmonare Neutrofilia Uso inalato Lipopolisaccaride

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una neutrofilia delle vie aeree costante e riproducibile mediante esposizione a LPS aerosolizzato. Questo viene ottenuto caricando innanzitutto il LPS sospeso in soluzione fisiologica in un nebulizzatore collegato a una camera di esposizione. Successivamente, i topi vengono esposti al LPS aerosolizzato e quindi viene raccolto il lavaggio broncoalveolare ed enumerati i globuli infiammatori presenti nel campione.Infine, il tessuto polmonare viene fissato in formalina per l'inclusione, la sezionatura e l'analisi immunohistochimica. In definitiva, il conteggio totale e differenziale delle cellule nel lavaggio broncoalveolare può essere utilizzato per valutare il reclutamento dei neutrofili nei polmoni. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'amministrazione intratracheale di LPS, sono la distribuzione uniforme del LPS aerosolizzato in tutto il polmone, la facilità di esecuzione e la minima formazione necessaria per un'applicazione corretta. Per generare un aerosol di LPS utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati e all'interno di una cappa biologica di livello due ventilata, inserir

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Questo video descrive la procedura per generare una sacca d'aria nel tessuto sottocutaneo dei topi e raccogliere essudati infiammatori in risposta alla somministrazione di lipopolisaccaridi in vivo. Questo video copre anche l'analisi dell'infiltrazione di neutrofili nella sacca d'aria.

Un modello murino Air Pouch per la raccolta dell'essudato infiammatorio indotto da lipopolisaccaridi

La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Il presente lavoro illustra la convenienza dell'uso dell'immunoterapia sublinguale per aumentare la risposta immunitaria innata nei polmoni e conferire protezione contro la polmonite pneumococcica acuta nel topo.

L&#39;immunoterapia sublinguale come alternativa di indurre una protezione contro le infezioni respiratorie acute

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l'inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Topi esposti a LPS intraperitoneali secernono esosomi nel fluido di lavaggio (BAL) bronco-alveolare che sono confezionati con Mirna. Utilizzando un sistema di co-coltura, indichiamo che esosomi rilasciati nel liquido di BAL perturbare l'espressione delle proteine di giunzione stretta in cellule epiteliali bronchiali ed aumentano l'espressione delle citochine pro-infiammatorie che accentuano la ferita di polmone.

Il lavaggio broncoalveolare esosomi in lesioni polmonari settici Lipopolysaccharide indotta

Presentato qui è una procedura passo-passo per indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione lipopolysaccharide intracheale diretta ed eseguire l'analisi FACS di campioni di sangue, liquido di lavaggio bronchoalveolar e tessuto polmonare. La minima invasività, la manipolazione semplice, la buona riproducibilità e la titolazione della gravità della malattia sono vantaggi di questo approccio.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.

Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Scopri un metodo per generare neutrofilia polmonare usando LPS aerosolizzato nei topi. Questa tecnica include nebulizzazione, lavaggio broncoalveolare e analisi istologica per studiare l'infiammazione acuta del polmone.

Un metodo per generare polmonare Neutrofilia Uso inalato Lipopolisaccaride

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