Riproduzione e sviluppo embrionale dello zebrafish

Zebrafish Reproduction and Development

JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

Zebrafish Reproduction and Development

4.7: Development and Reproduction of the Laboratory Mouse

4.15: Zebrafish Microinjection Techniques

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08:07 min

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April 30, 2023

Overview

Il pesce zebra (Danio rerio) è diventato un modello popolare per lo studio della genetica e della biologia dello sviluppo. La trasparenza di questi animali nelle prime fasi dello sviluppo consente la visualizzazione diretta della morfogenesi tissutale a livello cellulare. Inoltre, i pesci zebra sono suscettibili di manipolazione genetica, consentendo ai ricercatori di determinare l’effetto dell’espressione genica sullo sviluppo di un vertebrato con un alto grado di somiglianza genetica con gli esseri umani.

Questo video fornisce una breve panoramica delle principali fasi dello sviluppo del pesce zebra, con particolare attenzione alle prime 24 ore dopo la fecondazione (hpf). La discussione inizia con uno zigote costituito da una singola cellula, o blastomero, in cima a una grande palla di tuorlo. La scissione del blastomero viene quindi mostrata per produrre un embrione contenente migliaia di cellule nel giro di poche ore. Successivamente, vengono spiegati i drammatici movimenti cellulari noti come epiboly e gastrulazione, rivelando come contribuiscono a rimodellare una massa di cellule in un embrione in movimento con un cuore che batte in solo 1 giorno. La presentazione segue lo sviluppo degli embrioni attraverso la fase di schiusa, quando diventano nuotatori, nutrendo le larve. Sono incorporate importanti considerazioni per la cura delle larve, inclusa una breve rassegna di come i pesci vengono allevati fino all’età adulta in una struttura dedicata nota come vivaio. Infine, il video si conclude con alcune tecniche comuni utilizzate per studiare lo sviluppo degli embrioni, dimostrando come i pesci zebra vengono utilizzati per aiutarci a comprendere meglio lo sviluppo umano e le malattie.

Procedure

Gli embrioni di zebrafish hanno molte caratteristiche che li rendono un modello preferito tra i biologi dello sviluppo. Il loro rapido sviluppo esterno e la loro trasparenza li rendono particolarmente adatti alla visualizzazione. Inoltre, gli embrioni sono suscettibili di manipolazioni sia fisiche che genetiche, consentendo ai ricercatori di separare i segnali che controllano i processi di sviluppo. Questo video esaminerà il ciclo di vita del pesce zebra, le prime fasi dello sviluppo dell’embrione, l’allevamento di pesci fino all’età adulta ed evidenzierà alcune tecniche che sfruttano lo sviluppo di embrioni di zebrafish.

Per prima cosa, esaminiamo i passaggi di base nello sviluppo del pesce zebra.

Il ciclo di vita del pesce zebra è diviso in quattro periodi principali: embrione, larva, giovane e adulto. L’intero ciclo di vita dall’uovo fecondato all’adulto è di soli 90 giorni.

Lo sviluppo precoce avviene a un ritmo rapido, ma prevedibile quando gli embrioni vengono allevati a 28 °C. Di conseguenza, le fasi possono essere definite come il numero di ore o giorni dopo la fecondazione (più comunemente abbreviato in hpf o dpf). Tuttavia, se la temperatura di incubazione è aumentata o diminuita, gli stadi possono essere identificati con maggiore precisione dalle caratteristiche morfologiche. Con questo metodo, le prime 24 ore sono divise in cinque fasi: zigote, scissione, blastula, gastrula e segmentazione. La fase di faringola comprende le successive 24 ore fino a quando gli embrioni si schiudono in larve.

Ora che hai familiarità con le principali fasi dello sviluppo del pesce zebra, esaminiamo le prime 24 ore in modo più dettagliato.

Il ciclo di vita del pesce zebra inizia con un uovo fecondato. Questo zigote ha alcune strutture importanti, tra cui la membrana protettiva che circonda l’embrione chiamata corion e il tuorlo che fornisce nutrienti per lo sviluppo embrionale fino a quando il pesce non può nutrirsi da solo. Poco dopo la fecondazione, il citoplasma si muove verso un polo dell’uovo gonfiando una singola cellula chiamata blastodisco.

Durante il periodo di scissione, il blastodisco si divide per formare i blastomeri, che continuano a subire divisioni cellulari rapide e sincronizzate senza crescita cellulare.

Queste rapide divisioni sono possibili perché l’RNA depositato nell’uovo dalla madre viene utilizzato per far funzionare le proteine all’interno dei blastomeri, eliminando la necessità di sintesi dell’RNA. Durante il periodo della blastula, l’embrione inizia a produrre il proprio RNA, allungando così il ciclo cellulare. Questo periodo include anche l’inizio di un drammatico movimento delle cellule sulla superficie del tuorlo, noto come epiboly.

Quando le cellule sono avanzate per coprire circa la metà del tuorlo inizia il periodo della gastrula. Questo periodo prende il nome da un diverso tipo di movimento, noto come gastrulazione, in cui le cellule migrano sotto il fronte cellulare che avanza. Il risultato sono tre strati distinti di cellule chiamati strati germinali, tra cui l’endoderma, il mesoderma e l’ectoderma. Le cellule in ciascuno di questi tre strati hanno destini molto diversi: l’ectoderma dà origine all’epidermide e al sistema nervoso, l’endoderma forma l’intestino e il mesoderma genera muscoli, ossa e vascolarizzazione.

Entro 12 hpf, il mesoderma inizia a dividersi in somiti, che sono segmenti di tessuto lungo il tronco che in seguito diventeranno muscoli. Sebbene il numero di somiti definisca le singole fasi in questo periodo di segmentazione, c’è molto di più di quello che sta succedendo durante la durata di 10 ore. A sole 24 ore dalla fecondazione, gli embrioni sono attivi e hanno persino un cuore che batte!

Ha fatto molta strada in un solo giorno, ma il lavoro dell’embrione non è ancora finito! Gli embrioni continuano a svilupparsi all’interno delle loro cori fino a quando non si schiudono in larve a circa 3 giorni dopo la fecondazione. Mentre esauriscono rapidamente le riserve di energia del tuorlo, le larve sviluppano presto strutture specializzate per il nuoto, come la vescica natatoria: un organo pieno di gas che controlla la galleggiabilità. Dopo 7 dpf, i giovani pesci, o “avannotti”, sono completamente mobili e in cerca di cibo!

Pronto ad adottare un pesce? Avrai bisogno di un asilo nido per allevare i tuoi avannotti fino all’età adulta. No, non proprio così. Le larve vengono collocate in vasche con poco o nessun scambio d’acqua per iniziare e aumentando il flusso d’acqua man mano che i pesci migliorano la loro capacità di cacciare e nuotare. Le larve vengono solitamente alimentate con una combinazione di cibo secco reidratato e microrganismi, come la paramecia, per massimizzare i tassi di crescita. Dopo 2-3 mesi nella scuola materna, il pesce raggiunge l’età adulta, completando il ciclo di vita.

Ora che abbiamo visto alcune delle principali fasi dello sviluppo del pesce zebra, diamo un’occhiata ad alcune tecniche utilizzate per studiare questi passaggi.

Le piccole dimensioni e la trasparenza degli embrioni di zebrafish li rendono suscettibili all’ibridazione dell’RNA in situ. Questa tecnica utilizza una molecola di RNA etichettata complementare a un mRNA di interesse, per visualizzare l’espressione genica in tutto l’organismo. I cambiamenti nell’espressione genica nel tempo e in organi specifici sono facilmente osservabili e forniscono informazioni sui processi di sviluppo.

Inoltre, lo sviluppo esterno degli embrioni di zebrafish li rende suscettibili di trapianto di cellule. Le cellule di embrioni precoci etichettati fluorescentemente possono essere trapiantate in embrioni ospiti non etichettati e monitorate nel tempo. Questo metodo consente ai ricercatori di esaminare come le interazioni cellulari contribuiscono alla funzione degli organi e di visualizzare facilmente i movimenti cellulari in vivo.

Infine, poiché gli embrioni di zebrafish sono facilmente manipolati geneticamente dalla microiniezione, i ricercatori possono esaminare il ruolo di geni specifici durante lo sviluppo a partire dallo stadio di una cellula. Ad esempio, per studiare l’effetto della perdita di funzione di un gene, il pesce zebra può essere iniettato con morfolinos, che sono oligonucleotidi antisenso progettati per bloccare l’espressione proteica. Lo screening dei pesci iniettati per i fenotipi dello sviluppo, come i cambiamenti nell’assemblaggio dei vasi sanguigni, fornisce informazioni sul controllo genetico di complessi processi di sviluppo.

Hai appena visto il video di JoVE sullo sviluppo del pesce zebra. Questo video ha delineato il ciclo di vita del pesce zebra, ha coperto le fasi dello sviluppo precoce del pesce zebra e ha evidenziato il potere del pesce zebra come strumento nella biologia dello sviluppo. Grazie per l’attenzione!

Transcript

Zebrafish embryos have many characteristics that make them a favorite model among developmental biologists. Their rapid, external development and transparency make them uniquely suited to visualization. Additionally, embryos are amenable to both physical and genetic manipulations, allowing researchers to tease apart the signals controlling developmental processes. This video will go over the zebrafish life cycle, early stages of embryo development, raising fish to adulthood, and highlight some techniques that take advantage of developing zebrafish embryos.

First, let’s go over the basic steps in zebrafish development.

The zebrafish lifecycle is divided into four major periods: Embryo, larva, juvenile, and adult. The full life cycle from fertilized egg to adult is a quick 90 days.

Early development occurs at a rapid, but predictable rate when the embryos are raised at 28 °C. As a result, stages can be defined as the number of hours or days post fertilization (more commonly abbreviated as hpf or dpf). However, if the incubation temperature is increased or decreased, stages can be more accurately identified by morphological features. By this method, the first 24 hours are divided into five phases: Zygote, cleavage, blastula, gastrula, and segmentation. The pharyngula phase encompasses the next 24 hours until the embryos hatch into larvae.

Now that you’re familiar with the major stages of zebrafish development, let’s go over the first 24 hours in more detail.

The zebrafish life cycle begins with a fertilized egg. This zygote has a few important structures, including the protective membrane surrounding the embryo called the chorion and the yolk that provides nutrients for embryonic development until the fish can feed itself. Shortly after fertilization, cytoplasm moves toward one pole of the egg inflating a single cell called the blastodisc.

During the cleavage period, the blastodisc divides to form the blastomeres, which continue to undergo rapid, synchronized cell divisions with no cell growth.

These rapid divisions are possible because RNA deposited in the egg by the mother is used to make the proteins functioning within the blastomeres, eliminating the need for RNA synthesis. During the blastula period, the embryo begins to make its own RNA, thus lengthening the cell cycle. This period also includes the beginning of a dramatic movement of cells over the surface of the yolk, known as epiboly.

When the cells have advanced to cover about half of the yolk the gastrula period begins. This period is named for a different kind of movement, known as gastrulation, in which cells migrate under the advancing cell front. The result is three distinct layers of cells called the germ layers, including the endoderm, mesoderm, and ectoderm. Cells in each of these three layers have very different fates: The ectoderm gives rise to epidermis and nervous system, the endoderm forms the gut, and the mesoderm generates muscle, bone, and vasculature.

By 12 hpf, the mesoderm begins to divide into somites, which are tissue segments along the trunk that will later become muscle. Although the number of somites defines the individual stages in this segmentation period, there’s a lot more than that going on during it’s 10 hour duration. By just 24 hours post fertilization, the embryos are active and even have a beating heart!

It’s come a long way in just one day, but the embryo’s work is not yet done! The embryos continue to develop within their chorions until they hatch into larvae at about 3 days post fertilization. While rapidly depleting the energy stores of the yolk, the larvae soon develop specialized structures for swimming, like the swim bladder: A gas-filled organ that controls buoyancy. After 7 dpf, the young fish, or “fry”, are fully mobile and looking for food!

Ready to adopt a fish? You’ll need a nursery to raise your fry to adulthood. No, not quite like that. Larvae are placed into tanks with little to no water exchange to start, and increasing water flow as the fish improve their ability to hunt and swim. Larvae are usually fed a combination of rehydrated dry food and microorganisms, such as paramecia, to maximize growth rates. After 2-3 months in the nursery, the fish reach adulthood, completing the lifecycle.

Now that we’ve seen some of the major stages of zebrafish development, let’s look at some techniques used to study these steps.

The small size and transparency of zebrafish embryos makes them amenable to RNA in situ hybridization. This technique uses a labeled RNA molecule complementary to an mRNA of interest, to visualize gene expression throughout the entire organism. Changes in gene expression over time and in specific organs are easily observed and provide insight to developmental processes.

Additionally, the external development of zebrafish embryos makes them amenable to cell transplantation. Cells from fluorescently labeled early embryos can be transplanted into unlabeled host embryos, and tracked over time. This method allows researchers to examine how cell interactions contribute to organ function as well as to easily visualize cell movements in vivo.

Finally, because zebrafish embryos are easily genetically manipulated by microinjection, researchers can examine the role of specific genes during development starting from the one-cell stage. For example, to study the effect of loss of function of a gene, zebrafish can be injected with morpholinos, which are antisense oligonucleotides designed to block protein expression. Screening injected fish for developmental phenotypes, such as changes in the assembly of blood vessels, provides insight into the genetic control of complex developmental processes.

You’ve just watched JoVE’s video on zebrafish development. This video outlined the zebrafish lifecycle, covered the stages of early zebrafish development, and highlighted the power of the zebrafish as a tool in developmental biology. Thanks for watching!

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