Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare gli stadi in cui l'espressione genica virale è influenzata dal trattamento chimico. A tal fine, le cellule di coltura tissutale vengono piastrate e incubate. Fino a quando non sono confluenti, le cellule vengono infettate con un virus vaccinico triplo reporter o con un virus della lista dei promotori di controllo.

Successivamente, vengono applicati i composti di trattamento e le cellule vengono incubate per 18 ore per consentire il completamento di tutte le fasi dell'espressione genica virale. La fluorescenza risultante viene quindi determinata utilizzando un lettore di piastre. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano i cambiamenti relativi nell'espressione causati dai composti sperimentali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'infezione con un virus che esprime una singola proteina di fusione fluorescente è che questo insieme di virus fornisce maggiori informazioni su dove agisce nello stesso ciclo di vita virale uno specifico farmaco terapeutico, fornendo informazioni sul suo meccanismo d'azione. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per identificare gli inibitori dell'infezione virale, può anche essere utilizzato per rilevare lo stadio di replicazione virale completato in linee cellulari non permissive o in screening RNAi, identificando i fattori cellulari necessari per l'infezione. Questo protocollo utilizza il virus triplo o virus reporter multistadio Trip V, in cui tre fluoro quattro spettralmente distinti sono incorporati nel genoma a filamento doppietto di un singolo virus della venia.

Ciascuno di questi fluoro quattro è controllato da un promotore specifico per stadio ben definito. Il promotore C 11 R per l'espressione precoce di Venere, il promotore intermedio G otto R per l'espressione di m ciliegia e il promotore F 17 R per l'espressione in fase avanzata del tag BFP. Pertanto, Venus m Cherry e tag BFP sono espressi in sequenza durante l'infezione.

Come controllo, viene utilizzato un virus dell'elenco dei promotori. La PLV contiene un costrutto venoso simile a quello del Trip V.Tuttavia, non ha un promotore di trascrizione funzionale. Inizia questo protocollo dissociandoti.

Le cellule Hela cresciute su un piatto di 10 centimetri, diluiscono le cellule nel terreno di crescita a circa 2,0 volte 10 fino alla quinta cellula per millilitro. Quindi erogare 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto trasparente con pareti nere, incubare le cellule per 24 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica fino a quando non sono confluenti per diluire i virus, scongelare Tripp V e PLV in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, quindi sonicare per cinque minuti per disaggregare. Successivamente, diluire lo stock virale a 1,0 volte 10 al settimo PFU per millilitro in un terreno di infezione che è stato preriscaldato a 37 gradi Celsius per infettare le cellule.

Sostituire i terreni di coltura con 50 microlitri di virus diluito in ciascun pozzetto per ogni trattamento. Infettare tre pozzetti replicati con Tripp V e altri tre con PLV per tenere conto della fluorescenza di fondo specifica per ciascun trattamento. Questo è definito come il tempo è uguale a zero ore.

Dopo l'infezione, ad esempio, fare 350 microlitri per 6 96 pozzetti con 50 microlitri ciascuno. Ogni composto deve essere diluito al doppio della concentrazione finale, poiché verrà aggiunto al volume dell'inoculo già nel pozzetto. Successivamente, per ogni condizione di trattamento, creare una miscela master due volte diluendo i composti sperimentali o i solventi di controllo del veicolo come PBS o DMSO in una quantità sufficiente di terreno di infezione per tutte le repliche.

Più uno, Si noti che la concentrazione di solvente sia nel controllo sperimentale che in quello solo vettoriale dovrebbe essere la stessa. Ad esempio, se si utilizza l'IBT a un microlitro per mil in DMSO, si dovrebbe anche utilizzare il DMSL da solo a un microlitro per mil come controllo vettoriale. Immediatamente dopo aver aggiunto il virus, aggiungere 50 microlitri di terreno di coltura contenente i composti di trattamento e controllo desiderati a ciascun pozzetto, come mostrato in questa illustrazione.

Si noti che ogni composto viene testato con Tripp V e PLV in triplice copia e che un controllo del veicolo viene eseguito in triplice copia per ciascun virus. Incubare per 18 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius più il 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, fissare le cellule aggiungendo 100 microlitri di aldeide paraforme all'8% al terreno di infezione già in ogni pozzetto, incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce.

L'aggiunta di due aldeide paraforma all'8% direttamente al mezzo di infezione impedirà l'aerosolizzazione del virus, che potrebbe altrimenti verificarsi se il virus non fissato viene invertito direttamente nel piatto dei rifiuti. Trascorsi 15 minuti, rimuovere il fissativo capovolgendo la piastra nella vaschetta dei rifiuti. Aggiungere quindi 100 microlitri di PBS a temperatura ambiente e sigillare la piastra con pellicola adesiva otticamente trasparente.

Se la lastra non verrà letta immediatamente, conservarla a quattro gradi Celsius. Assicurarsi di riportare le piastre sigillate a temperatura ambiente prima di leggerle per evitare che la condensa distorca le misurazioni dello spettrofotometro. Per quantificare la crescita del virus, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la fluorescenza del punto finale.

Effettua quattro misurazioni per pozzetto utilizzando le impostazioni di guadagno ottimizzate per ciascun canale. Il lettore di piastre TAN Infinite M 1000 Pro utilizzato in questo video esporta le misurazioni grezze della fluorescenza in un file Microsoft Excel. Dopo aver ottenuto le letture, aprire i dati grezzi in Microsoft Excel.

Quindi copialo e incollalo in un prisma GraphPad. La scheda dei risultati in Prism determina la media dei pozzetti replicati Tripp v e PLV. Quindi sottrarre il valore medio di PLV dal valore medio di Tripp V per ciascun trattamento.

Per facilitare il confronto con gli esperimenti replicati, normalizzare i dati dividendo i dati sottratti in background dal solo veicolo Tripp v Wells. Una volta che un esperimento è stato ripetuto più volte, eseguire un'analisi unidirezionale della varianza o un test NOVA unidirezionale e un confronto multiplo post-test per determinare se uno qualsiasi dei trattamenti è significativamente diverso dal trattamento DMSO. Affinché ciascun canale esegua saggi cinetici che infettino le cellule e applichino i composti in esame come in precedenza, è particolarmente importante utilizzare un terreno tamponato per mantenere un pH corretto senza l'aggiunta del 5% di anidride carbonica.

Dopo aver sigillato la piastra con pellicola adesiva, posizionarla nella camera di lettura delle piastre in equilibrio a 37 gradi Celsius. Particolare attenzione deve essere prestata per mantenere le piastre costantemente a 37 gradi Celsius. In questo modo si evitano sollecitazioni eccessive e condensa delle celle.

Impostare manualmente il guadagno del lettore di piastre per evitare la saturazione di punti temporali successivi. Acquisisci letture orarie da otto a 24 ore dopo l'infezione e normalizza. Per quanto riguarda il test endpoint, i singoli punti temporali possono essere analizzati per la significatività statistica utilizzando metodi simili al test endpoint precedentemente descritto.

Per confrontare i punti di inibizione, le cellule heela infettate con il vaccino TPV o PLV sono state coltivate in presenza degli inibitori del virus del vaiolo, Aris, CIBT, Rifampicina e ST 2 46. Questa volta, il filmato mostra l'espressione sequenziale dei fluoro quattro verdi, rossi e blu durante la crescita del virus nelle cellule di controllo quando infettate in presenza del farmaco che blocca la replicazione del DNA aee. Il fluoro quattro verde precoce viene prodotto come prima, ma la produzione intermedia e tardiva di fluorescenza rossa e blu non si verifica.

L'analisi quantitativa mediante spettrometria ha mostrato un aumento del 210% dell'espressione genica precoce, ma una mancanza di espressione intermedia e tardiva nelle cellule trattate con cellule C infettate in presenza di IBT, che si ritiene promuova. La trascrizione read through aveva livelli di espressione intermedi e tardivi che erano il 24,7% e il 2,9% dei livelli di controllo, le cellule infettate in presenza di ST 2, 46 e rifampicina, che inibiscono dopo l'espressione genica tardiva durante l'assemblaggio e la maturazione del virione, non erano significativamente diversi dai controlli. Questi risultati sono coerenti con il meccanismo d'azione di questi composti e suggeriscono che il virus reporter Trip V può essere utilizzato per identificare lo stadio specifico dell'inibizione virale per composti sconosciuti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere controlli appropriati. Questo non solo consente la corretta normalizzazione dei risultati, ma anche di determinare un potenziale meccanismo per il composto sperimentale. Non dimenticare che lavorare con il virus del vaccino può essere estremamente pericoloso, indossa sempre dispositivi di protezione individuale adeguati e segui i bsl raccomandati.

Due tecniche di contenimento.