Vaccinia Reporter virus per quantificare Funzione virale in tutte le fasi di espressione genica

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le fasi in cui l'espressione genica virale è influenzata dal trattamento chimico. A tale scopo, le cellule in coltura vengono seminate e incubate fino a raggiungere la confluenza. Le cellule vengono quindi infettate con un virus vaccinico contenente un triplo reporter oppure con un virus di controllo privo di promotore.

In seguito vengono applicati i composti da trattare e le cellule vengono incubate per 18 ore per consentire il completamento di tutte le fasi dell'espressione genica virale. La fluorescenza risultante viene quindi determinata utilizzando un lettore di piastre. Infine, si possono ottenere risultati che mostrano le variazioni relative nell'espressione causate dai composti sperimentali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'infezione con un virus che esprime una singola proteina fluorescente fusa è che questo insieme di virus fornisce maggiori informazioni su in quale fase del ciclo vitale virale agisce un particolare farmaco terapeutico, offrendo indicazioni sul suo meccanismo d'azione. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per identificare inibitori dell'infezione virale, può anche essere impiegato per rilevare la fase di replicazione virale completata in linee cellulari non permissive o in schermate di RNAi, identificando fattori cellulari necessari per l'infezione. Questo protocollo utilizza il virus reporter multistadio, detto virus triplo o TrpV, in cui tre fluorofori spettralmente distinti sono incorporati nel genoma a doppio filamento di un singolo virus vaccinia.

Ciascuno di questi fluorofori è controllato da un promotore specifico ben definito per ogni stadio. Il promotore C 11 R per l'espressione precoce di Venus, il promotore intermedio G eight R per l'espressione di m-cherry e il promotore F 17 R per l'espressione tardiva di tag BFP. Pertanto, Venus, m-Cherry e tag BFP vengono espressi in modo sequenziale durante l'infezione.

Come controllo, viene utilizzato un virus privo di promotore. Il PLV contiene un costrutto Venus simile a quello presente nel TrpV, tuttavia non possiede un promotore trascrizionale funzionale.

Iniziare questo protocollo dissociando le cellule HeLa coltivate in una piastra da 10 centimetri, diluendo le cellule nel mezzo di crescita a circa 2,0 × 10⁵ cellule per millilitro. Successivamente, distribuire 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti con pareti nere, fondo trasparente e piano. Incubare le cellule per 24 ore in un incubatore a 37 °C con 5% di anidride carbonica fino a quando non diventano confluenti. Per diluire i virus, scongelare TrpV e PLV in un bagno d'acqua a 37 °C, quindi sottoporli a sonificazione per cinque minuti per disgregarli. Successivamente, diluire il ceppo virale a 1,0 × 10⁷ PFU/mL in mezzo di infezione preriscaldato a 37 °C.

Per infettare le cellule, sostituire il terreno di crescita con 50 microlitri di virus diluito in ogni pozzetto. Per ogni trattamento, infettare tre pozzetti replicati con TrpV e altri tre con PLV per tenere conto della fluorescenza di fondo specifica di ciascun trattamento. Questo momento è definito come tempo uguale a zero ore post-infezione. Ad esempio, preparare 350 microlitri per 6 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti, con 50 microlitri ciascuno. Ogni composto deve essere diluito al doppio della concentrazione finale, poiché verrà aggiunto al volume di inoculo già presente nel pozzetto. Successivamente, per ogni condizione di trattamento, preparare un mix master 2x diluendo i composti sperimentali o i solventi di controllo veicolo come PBS o DMSO in una quantità sufficiente di terreno di infezione per tutti i replicati, più uno. Si noti che la concentrazione di solvente nei controlli sperimentali e nei soli vettori deve essere la stessa. Ad esempio, se si utilizza IBT a un microlitro per millilitro in DMSO, si deve utilizzare anche DMSO da solo a un microlitro per mL come controllo del vettore. Immediatamente dopo l'aggiunta del virus, aggiungere 50 microlitri di terreno di infezione contenente i composti di trattamento e di controllo desiderati in ogni pozzetto, come mostrato in questa illustrazione.

Si noti che ogni composto viene testato con TrpV e PLV in triplicato, e un controllo del veicolo viene eseguito in triplicato per ciascun virus.

Incubare per 18 ore in un incubatore a 37 gradi Celsius con aggiunta di anidride carbonica al 5%. Il giorno successivo, fissare le cellule aggiungendo 100 microlitri di paraformaldeide all'8% al mezzo di infezione già presente in ogni pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce.

Aggiungere direttamente due x o 8% di paraformaldeide al mezzo di infezione impedirà l'aerosolizzazione del virus, che potrebbe verificarsi se il virus non fissato venisse rovesciato direttamente nel contenitore dei rifiuti. Dopo 15 minuti, rimuovere il fissativo rovesciando la piastra nel contenitore dei rifiuti. Quindi aggiungere 100 microlitri di PBS a temperatura ambiente e sigillare la piastra con un film adesivo otticamente trasparente.

Se la piastra non verrà letta immediatamente, conservarla a quattro gradi Celsius. Assicurarsi di riportare le piastre sigillate a temperatura ambiente prima della lettura, per evitare che la condensa alteri le misurazioni dello spettrofotometro.

Per quantificare la crescita virale, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la fluorescenza al punto finale. Effettuare quattro misurazioni per pozzetto utilizzando impostazioni di guadagno ottimizzate per ogni canale. Il lettore di piastre TECAN Infinite M 1000 Pro utilizzato in questo video esporta le misurazioni di fluorescenza grezze in un file Microsoft Excel. Dopo aver ottenuto le letture, aprire i dati grezzi in Microsoft Excel.

Quindi copiare e incollare i dati in un foglio risultati di GraphPad Prism. In Prism, determinare la media delle pozzette TrpV e PLV replicate. Successivamente, sottrarre il valore medio delle pozzette PLV dal valore medio delle pozzette TrpV per ogni trattamento. Per facilitare il confronto con esperimenti replicati, normalizzare i dati dividendo i dati corretti per il fondo con i valori delle pozzette TrpV contenenti solo il veicolo. Una volta ripetuto l'esperimento più volte, eseguire un'analisi della varianza unidirezionale (one-way ANOVA) e un test post-hoc di confronto multiplo per determinare se uno dei trattamenti differisce in modo significativo dal trattamento con DMSO per ciascun canale. Per eseguire saggi cinetici, infettare le cellule e applicare i composti in prova come in precedenza; è particolarmente importante utilizzare un mezzo tamponato per mantenere il pH corretto senza aggiunta di anidride carbonica al 5%.

Dopo aver sigillato la piastra con pellicola adesiva, posizionarla nella camera del lettore di piastre equilibrata a 37 gradi Celsius. È necessario prestare particolare attenzione a mantenere le piastre costantemente a 37 gradi Celsius. Questo eviterà stress cellulare eccessivo e formazione di condensa.

Impostare manualmente il guadagno del lettore di piastre per evitare la saturazione dei punti temporali successivi. Acquisire letture orarie per un periodo di otto a 24 ore dopo l'infezione e normalizzare come per il saggio endpoint. Singoli punti temporali possono essere analizzati per la significatività statistica utilizzando metodi simili a quelli descritti in precedenza per il saggio endpoint.

Per confrontare i punti di inibizione, cellule HeLa infettate con vaccinia TrpV o PLV sono state coltivate in presenza degli inibitori del virus poxvirus, AraC, IBT, Rifampicina e ST 246. Questo filmato in time-lapse mostra l'espressione sequenziale dei fluorofori verde, rosso e blu durante la crescita virale in cellule di controllo. Quando l'infezione avviene in presenza del farmaco AraC, che blocca la replicazione del DNA, il fluoroforo verde precoce viene prodotto come in precedenza, ma non si verifica la produzione intermedia e tardiva della fluorescenza rossa e blu.

L'analisi quantitativa mediante spettrometria ha mostrato un aumento del 210% nell'espressione dei geni precoci, ma una mancanza di espressione intermedia e tardiva nelle cellule trattate con araC. Le cellule infettate in presenza di IBT, che si ritiene favorisca la trascrizione in lettura continua, hanno mostrato livelli di espressione intermedia e tardiva pari al 24,7% e al 2,9% rispetto ai controlli. Le cellule infettate in presenza di ST246 e rifampicina, che inibiscono l'espressione tardiva durante l'assemblaggio e la maturazione del virione, non hanno mostrato differenze significative rispetto ai controlli. Questi risultati sono coerenti con il meccanismo d'azione noto di questi composti e suggeriscono che il virus reporter TrpV può essere utilizzato per identificare la fase specifica di inibizione virale di composti sconosciuti.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di includere controlli appropriati. Questo non solo consente una corretta normalizzazione dei risultati, ma aiuta anche a determinare un potenziale meccanismo d'azione per il composto sperimentale. Non dimenticare che lavorare con il virus vaccinia può essere estremamente pericoloso: indossare sempre dispositivi di protezione individuale adeguati e seguire le tecniche raccomandate di contenimento di livello BSL-2.