Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale Drosophila Tessuti In Situ
14 agosto 2014
L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare o saziare i tessuti in C 2 utilizzando la microscopia a fluorescenza dopo la sonicazione. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni embrionali e larvali e poi fissandoli utilizzando formaldeide, eptano e metanolo. Il secondo passo consiste nel sonicare il campione fissato per rimuovere la cuticola per consentire la penetrazione degli anticorpi.
Successivamente, il campione viene colorato immuno con anticorpi primari e secondari fluorescenti. Il passaggio finale consiste nel montare il campione in una soluzione Antifa a base di glicerolo. In definitiva, la microscopia confocale o epifluorescente viene utilizzata per visualizzare il tessuto in via di sviluppo, nonché l'espressione e la localizzazione delle proteine.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la dissezione dei tessuti, è che consente la visualizzazione di una varietà di tessuti in via di sviluppo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la fase di sonicazione dipende da una serie di fattori per ottenere la massima efficienza, incluso il corretto posizionamento della sonda sonica. A dimostrare la procedura saranno Ashley Fiddler e Lauren Bole, due talentuose ricercatrici universitarie del mio laboratorio.
Per iniziare l'esperimento, rimuovere con cura gli embrioni raccolti su una piastra di agar utilizzando un piccolo pennello da vernice unito con una soluzione di tampone fosfato Triton X 100 o PBTX. Quindi, strofinare il pennello carico di campioni contro la cresta interna di un filtro cellulare. Posizionare un coperchio per piastre di Petri sotto il colino cellulare.
Quindi sciacquare il pennello e le pareti del colino cellulare con un flacone a spruzzo contenente PBTX. Dopo che il campione è stato trasferito nel filtro, versare una quantità sufficiente di PBTX nel filtro per sollevare il campione dalla rete. Ripetere questo passaggio tre volte per rimuovere il lievito e gli escrementi delle mosche, rimuovere il PBTX.
Quindi versare una soluzione di candeggina al 50% nel colino e lasciare riposare le larve nella soluzione per cinque minuti. Quindi, rimuovi la soluzione. Quindi lavare il campione con PBTX e lasciare riposare il campione nella soluzione per tre minuti.
Ripetere il passaggio cinque volte, asciugare il fondo del filtro cellulare. Quindi utilizzare un pennello accoppiato con PBTX per trasferire il campione in una fiala di scintillazione contenente 1,75 millilitri di pems. In una cappa aspirante, aggiungere 250 microlitri di formaldeide al 37% e otto millilitri di grado reagente.
Eptano nella fiala di scintillazione e agitare la fiala a 200 giri/min per 20 minuti. Quindi aggiungere 10 millilitri di metanolo alla fiala di scintillazione senza rimuovere la fase acquosa e agitare energicamente a 500 giri/min. Dopo aver agitato, versare immediatamente il contenuto in un colino cellulare sopra un contenitore per liquidi di scarto.
Aggiungere altro metanolo alla fiala e far passare il contenuto attraverso il colino cellulare. Per assicurarsi che l'intero campione sia stato rimosso. Provare il fondo del colino cellulare con del tessuto da laboratorio.
Quindi applicare un pennello per trasferire il campione dal colino a una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 0,5 millilitri di metanolo. Attendi che il campione si depositi. Quindi rimuovere il metanolo con una pipetta e sostituirlo con un'aliquota fresca di metanolo da 0,5 millilitri.
Ripeti questo passaggio tre volte e aggiungi gli ultimi 0,5 millilitri di metanolo al tubo prima di riporlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Per un secondo momento, recuperare il campione conservato dal congelatore e rimuovere il metanolo con una pipetta. Quindi aggiungere un millilitro di una soluzione tampone di metanolo fosfato al 50% o PBTW alla provetta e far oscillare la provetta per tre minuti.
Quindi, sciacquare il campione con un millilitro di PBTW due volte lasciando che il campione si depositi prima di prelevare il PBTW con una pipetta, aggiungere 1,0 millilitri di siero bovino albumina fosfato tamponato tween, o BBTW, alla fiala e agitarlo per tre minuti. Lasciare depositare il campione e rimuovere il BBTW con una pipetta. Ripetere questo passaggio due volte.
Avendo cura di rimuovere quanto più BBTW possibile senza perdere nulla del campione. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di BBTW al tubo e metterlo sul ghiaccio. Quindi, impostare il sonicato al 10% di ampiezza massima e un'autonomia di due secondi con azione costante, pulire la sonda dell'atore inserendo la punta della sonda in un tubo conico da 50 millilitri riempito con acqua deionizzata ed eseguire il sonicato.
Quindi asciugare la sonda sonicata con un panno da laboratorio. Immergere la sonda nel tubo, da tre a quattro millimetri sopra il campione e avviare la sonicazione. Quindi rimuovere il tubo e metterlo sul ghiaccio per 30 secondi per evitare il surriscaldamento della sonicazione e per consentire al campione di depositarsi sul fondo del tubo.
Ripetere questo passaggio come richiesto dall'età del campione al termine della sonicazione. Sciacquare il campione due volte con un millilitro di BBTW. Dopo ogni risciacquo, lasciare depositare il campione prima di asciugare BBTW Con una pipetta, aggiungere un millilitro di BBTW alla fiala e posizionarla su un bilanciere.
Dopo tre minuti, lasciare depositare il campione e rimuovere il BBTW con una pipetta. Quindi ripeti l'operazione. Passare due volte, bloccare il campione con 0,5 millilitri di siero normale al 5% diluito in BBTW nella provetta e posizionare il campione su un bilanciere per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di anticorpi primari e far oscillare il campione per una notte a quattro gradi Celsius, lasciando che il campione si depositi sul fondo del tubo. Quindi prelevare gli anticorpi primari con una pipetta e sciacquare due volte con un millilitro di BBTW. Aggiungere un millilitro di BBTW alla fiala e poi posizionarlo su un bilanciere per tre minuti.
Quindi rimuovere il BBTW con una pipetta e ripetere l'operazione. Passare cinque volte, bloccare il campione con una soluzione di siero BBTW normale al 5% e farlo oscillare per 30 minuti. Quindi rimuovere la soluzione.
Aggiungere l'anticorpo secondario diluito al 5% di soluzione sierica BBTW normale e avvolgere la provetta in un foglio di alluminio. Quindi agitare il campione per una notte a quattro gradi Celsius. Prelevare gli anticorpi secondari con una pipetta e sciacquare il campione con un millilitro di PBTW due volte.
Quindi, aggiungere un millilitro di PBTW alla fiala e posizionarla su un bilanciere per cinque minuti. Quindi lasciare depositare il campione e rimuovere il PBTW con una pipetta. Ripeti l'operazione.
Passo tre volte. Aggiungere da 80 a 100 microlitri di soluzione di CO DAB al tubo e conservarlo a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Infine, per montare il campione, utilizzare da cinque a 10 microlitri di dab BCO p lene diammina o PPD anti fade.
Quindi visualizzalo con la microscopia a fluorescenza. Queste proiezioni Z di quattro fette confocali dimostrano l'efficacia del protocollo per la visualizzazione delle caratteristiche morfologiche e delle singole cellule in C 2 durante le fasi embrionali tardive fino alle prime e medie fasi di sviluppo della Drosophila. Lo sviluppo dei testicoli è un sistema particolarmente buono per illustrare l'efficacia del protocollo perché la maturazione dei testicoli è dinamica durante lo sviluppo larvale.
Queste immagini evidenziano le cellule germinali nelle cellule rosse e hub e le zone FU nelle singole sezioni confocali verdi dei tre cervelli medi L. Colorazione immunologica per cellule madri ganglionari, neuroni indifferenziati in verde e neuroni immaturi e primari. In rosso mostra una forte colorazione con modelli di espressione distinti nei lobi cerebrali e nel midollo nervoso ventrale, a seconda dell'orientamento di montaggio, l'imaging consente la visualizzazione del tessuto cerebrale dalla superficie dorsale, dalla superficie ventrale o in sezione trasversale sagittale.
Questa tecnica in situ consente ai biologi di esplorare lo sviluppo degli organi nella morfogenesi dei tessuti negli organismi in cui la cuticola protettiva impedisce la penetrazione degli anticorpi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sonicare e immunocolorare campioni di esofago embrionale e larvale in fase avanzata al fine di visualizzare i tessuti in via di sviluppo in C due. Non dimenticare che lavorare con formaldeide, eptano e metanolo può essere estremamente pericoloso e precauzioni come lavorare in una cappa aspirante.
Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario osservare sempre l'uso di guanti adeguati e un camice da laboratorio.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'immunomarcatura di tessuti di Drosophila melanogaster mediante sonificazione. Il metodo consente la visualizzazione di specifici tipi cellulari e proteine senza la necessità di dissezione, aumentando l'efficienza nello studio dei tessuti in via di sviluppo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- L'immunomarcatura è fondamentale per visualizzare le proteine nei tessuti.
- I metodi tradizionali richiedono spesso dissezione, un processo che può richiedere molto tempo.
- La sonificazione può facilitare la penetrazione degli anticorpi rimuovendo la cuticola.
- La microscopia a fluorescenza viene utilizzata per osservare la localizzazione delle proteine.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo di immunomarcatura efficiente per larve in preparazione intera.
- Visualizzare l'espressione proteica nei tessuti di Drosophila.
- Migliorare l'accessibilità della penetrazione degli anticorpi in campioni fissati.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di campioni embrionali e larvali.
- Fissazione mediante formaldeide, eptano e metanolo.
- Sonicazione per rimuovere il cuticolo.
- Immunomarcatura con anticorpi primari e anticorpi secondari fluorescenti.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita dei tessuti in sviluppo mediante microscopia a fluorescenza.
- Penetrazione efficace degli anticorpi ottenuta tramite sonificazione.
- Localizzazione chiara delle proteine all'interno dei campioni.
- Il protocollo migliora l'efficienza delle procedure di immunomarcatura.
Conclusioni
- Il metodo descritto semplifica il processo di immunomarcatura.
- La sonificazione è una tecnica utile per la preparazione dei tessuti di Drosophila.
- Questo protocollo può essere ampiamente adottato per studi simili in biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo di immunofluorescenza facilitato da sonificazione affronta un collo di bottiglia fondamentale nella ricerca in biologia dello sviluppo: il cuticolo impermeabile negli embrioni e nei larve di Drosophila in stadi avanzati, che ostacola la penetrazione degli anticorpi. Permettendo la colorazione immunologica in preparati interi senza dissezione, il protocollo migliora la produttività e preserva la morfologia dei tessuti, favorendo una valida conferma dell'obiettivo in schermate genetiche e fenotipiche. L'approccio aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta fornendo dati quantitativi sull'espressione proteica con risoluzione spaziale, fondamentali per ridurre i rischi meccanicistici delle ipotesi terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione della localizzazione proteica in tessuti integri, riducendo l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Permette l'elaborazione ad alto rendimento di un elevato numero di campioni, migliorando l'efficienza nei flussi di lavoro di validazione di bersagli.
- Valore strategico: Facilita lo screening fenotipico consentendo l'analisi simultanea di diversi tipi di tessuto (ad esempio testicoli, ovaie, tessuti neurali) in diverse fasi di sviluppo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di fluorescenza che consentono una valutazione standardizzata dei livelli di espressione dell'antigene.
- Valore operativo: Mantiene l'architettura tissutale in situ, garantendo la riproducibilità del saggio e riducendo la variabilità derivante da artefatti di dissezione.
- Valore strategico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, confermando l'interazione con il bersaglio e i modelli di espressione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce una risoluzione cellulare rilevante per le malattie nei modelli di Drosophila, sostenendo la scoperta di biomarcatori traslazionali per le vie dello sviluppo neurologico e riproduttivo.
- Valore operativo: Permette la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, mantenendo protocolli costanti di preparazione e colorazione dei tessuti.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio fornendo dati affidabili sulla localizzazione spazialmente risolta delle proteine.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto attivo, in particolare quando lo screening fenotipico richiede l'analisi di tessuti integri e la localizzazione quantitativa delle proteine.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione di specifici tipi cellulari e dell'espressione proteica in tessuti in via di sviluppo.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso una immunomarcatura standardizzata e riproducibile, con output quantitativi di fluorescenza adatti alla valutazione di composti.
- Analisi: Genera letture quantitative (intensità di fluorescenza, pattern di localizzazione) che consentono ai gruppi di lavoro di confrontare condizioni sperimentali e valutare la modulazione del bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo dati a livello tissutale allineati a fenotipi dello sviluppo rilevanti per i modelli di malattie umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di preparazione dei campioni riutilizzabile, applicabile in più progetti di biologia dello sviluppo e screening genetico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo i falsi negativi derivanti da scarsa penetrazione degli anticorpi e migliorando l'accuratezza della validazione della proteina bersaglio.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la scalabilità grazie a un protocollo semplificato, privo di dissezione, compatibile con elaborazioni ad alto volume.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o abbandono del bersaglio fornendo informazioni meccanicistiche affidabili e riducendo il rischio biologico in fasi avanzate dello sviluppo del bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata su modelli di espressione validati e rilevanza funzionale in sistemi pertinenti alla malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ottimizzazione dei parametri di sonicazione (posizione della sonda, ampiezza, durata) per evitare danni al campione garantendo al contempo la rimozione della cuticola.
- Presuppone l'accesso a un apparecchio per la sonicazione dotato di controlli precisi dell'ampiezza e dei tempi, nonché ai reagenti standard per immunofluorescenza e a un microscopio a fluorescenza.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di sonicazione e colorazione, per garantire la riproducibilità tra diversi utilizzatori e laboratori.
- Richiede considerazioni adattative per diversi tipi di tessuti e stadi di sviluppo di Drosophila, poiché l'efficienza della sonicazione può variare in base all'età del campione e allo spessore della cuticola.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di ottimizzare i tempi di incubazione degli anticorpi per bersagli a bassa abbondanza e la manipolazione accurata di reagenti pericolosi (formaldeide, eptano, metanolo).
