Name: Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale Drosophila Tessuti In Situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Impara la sonica-facilitata immunofluorescenza per visualizzare tessuti embrionali e larvali di Drosophila melanogaster senza dissezione. Questo metodo migliora la penetrazione degli anticorpi attraverso la cuticola.

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Siamo grati a Ruth Lehman e Dorthea Godt che ci ha gentilmente fornito gli anticorpi Vasa e traffico Jam. Vorremmo riconoscere il Bloomington Stock Center presso l&#39;Indiana University per mantenere le scorte e la Developmental Studies Ibridoma Banca, sotto gli auspici del NICHD e mantenuti da The University of Iowa. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Wawersik per i loro consigli e sostegno. Questo lavoro è stato finanziato dalla Monroe Scholars Program Grant (per AF e LB) e NSF concedere IOS0823151 (a MW).

1 Preparazione di una gabbia Collection <ol><li> Anestetizzare giovani, mosche fertili con CO 2. Trasferimento mosche anestetizzati ad una gabbia. Per ottenere il rendimento ottimale, utilizzare 100-120 mosche adulte che vanno da 2-7 giorni di età in un rapporto 4: 1 di femmine ai maschi. Consenti mosche un adeguato periodo di acclimatazione, ~ 24 ore prima di ottenere il campione per il fissaggio. Se la gabbia è stato istituito con femmine vergini accoppiato ai maschi, un uso un 36 - periodo di acclimatazione ore 48. </li><li> Sulla estremità aperta della gabbia, mettere una piastra di agar succo di mela pre-preparata con una goccia monetina imprese di lievito in pasta al centro sopra l&#39;apertura della gabbia. Quindi, fissare con nastro adesivo. Sigillare la giunzione tra la piastra di agar succo di mela e la gabbia con Parafilm. </li><li> Posizionare la gabbia in un contenitore secondario con succo di mela piastra di agar come la base e consentire in linea di riprodurre ad una temperatura definita per un adeguato periodo di tempo determinato dall&#39;esperimento. Nota: i tempi di prelievo dei campioni will variare. Ad esempio, quando si raccolgono fase embrioni fine / inizio larve L1 (17-24 ore), permettono di mosche depongono le uova su piastre di agar succo di mela per 7 ore a 25 ° C prima della maturazione del campione per 17 ore a 25 ° C. Allo stesso modo, per una collezione di metà-fine primo larve instar (36 - 48 ore) permettono le mosche a deporre le uova per 12 ore a 25 ° C prima della maturazione del campione per 36 ore a 25 ° C. </li><li> Una volta che il periodo di tempo è completa, toccare la gabbia su un tavolo in modo che le mosche cadono lontano dalla piastra di agar succo di mela senza anestesia. Sostituire velocemente la piastra utilizzata con una nuova contenente una goccia di lievito in pasta. Fissare la piastra fresca con nastro adesivo e parafilm e conservare la gabbia con succo di mela piastra di agar come base. </li><li> Rimuovere con cautela la goccia lievito dalla piastra utilizzato con una spatola metallica. Mettere il coperchio sulla piastra utilizzato succo di mela e consentono di cui gli embrioni di età, se necessario, sperimentalmente. Nota: Durante l&#39;invecchiamento dei campioni, le piastre possono essere conservati a 25 ° C a meno che temperature più alte sono Experimentally richiesta. Esempi di come invecchiare embrioni per la raccolta sono descritti in precedenza (vedi nota per la fase 1.3). Rimozione di lievito pasta prima di assaggiare l&#39;invecchiamento viene eseguita per evitare che le larve di eseguire la scansione nel lievito e rompere l&#39;agar sotto. Il restante succo di mela agar e incolla lievito residuo fornire sostanze nutritive per la crescita delle larve. Mentre gli embrioni di cui direttamente nella pasta lievito sono persi attraverso la rimozione lievito in pasta, questa perdita è preferibile lievito e residui di agar nel campione che può ridurre l&#39;efficienza colorazione. Se uno sceglie di non rimuovere la pasta di lievito, lievito può essere liquefatto con tampone fosfato Triton X-100 (PBTx), mescolato con un pennello, e poi rimosso dal campione con un colino cella prima della fissazione. </li></ol> 2 Fissazione <ol><li> Una volta che gli embrioni di cui alla piastra di succo di mela agar sono invecchiati al punto di tempo desiderato, utilizzare un piccolo pennello bagnato con la soluzione tampone fosfato Triton X-100 (PBTx) per rimuovere con attenzione campione dal the piastra. Nota: le larve più vecchie sono mobili e possono strisciare sulla parte interna del coperchio. Tale campione può essere raccolto in modo simile con asportazione con un pennello. </li><li> Pulire il pennello campione di carichi contro la cresta rivolta verso l&#39;interno di un colino cella. Poi, lavare le pareti del filtro e il pennello con un flacone con spruzzatore contenente soluzione PBTx. Mettere un coperchio capsula di Petri sotto il filtro per catturare la soluzione PBTx. </li><li> Dopo tutto il campione è stato trasferito al colino, versare abbastanza PBTx nel filtro per sollevare il campione fuori dalla rete. Quindi, sollevare il colino e versare il contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi. </li><li> Ripetere il punto 2.3 tre volte per rimuovere il lievito e volano rifiuti che possono essere stati trasferiti con il campione. </li><li> Versare abbastanza 50% di candeggina (ipoclorito di sodio) / acqua (DDH 2 O) soluzione nel filtro per sollevare le larve fuori dalla rete. Lasciare le larve di sedersi in soluzione per 5 min. Quindi, sollevare il filtro e versare tegli contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi. Nota: Bleach è richiesto solo nei campioni embrionali di età compresa tra 0-22 ore, al fine di rimuovere la membrana coriale. L&#39;applicazione di candeggina per campioni anziani può essere omesso, ma la sua inclusione non è dannosa. Se omissione si desidera, sostituire la candeggina in questa fase con PBTx. Candeggina diluita deve essere utilizzato entro 24 ore di preparazione della soluzione. </li><li> Lavare campione nel colino con PBTx versando abbastanza PBTx nel filtro per sollevare il campione fuori dalla rete. Lasciare campione di sedersi in soluzione per 3 min. Quindi, sollevare il colino e versare il contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi. </li><li> Ripetere il punto 2.6 cinque volte. </li><li> Tamponare la parte inferiore del filtro cella a secco, poi trasferire campione in una fiala di scintillazione contenente 1,75 ml di soluzione PEMS con un pennello. </li><li> Lavorare sotto cappa ventilata, aggiungere 250 ml di formaldeide al 37% e 8 ml di eptano grado reagente alla fiala di scintillazione. <br/&gt; Nota: Formaldeide e eptano sono pericolosi. Per motivi di sicurezza, continuare a lavorare in una cappa ventilata e indossare guanti appropriati per passaggi 2,9-3,3. </li><li> Lasciare che il flaconcino a scuotere a 200 rpm o una simile velocità moderata per 20 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml di metanolo a scintillazione fiala senza rimuovere la fase acquosa precedente e consentire il flaconcino a scuotere vigorosamente a 500 rpm per 1 min. Nota: Il metanolo è pericoloso. Continuare a lavorare in una cappa ventilata e indossare guanti adeguati. </li><li> Rimuovere fiala da shaker e versare immediatamente il contenuto in un colino cellule sopra un contenitore di rifiuti liquidi nella cappa. Aggiungi metanolo in più per il flaconcino e correre attraverso il filtro, se necessario, delle cellule al fine di garantire tutti i campioni è stato rimosso. Nota: filtri cellula può defluire lentamente. Per ovviare a questo, toccare un tessuto laboratorio al fondo del filtro cella per disegnare la soluzione attraverso il filtro più rapidamente. Metanolo, formaldeide, e eptano dovrebbe essereimmagazzinato in appositi contenitori per rifiuti fino a corretto smaltimento secondo le linee guida istituzionali. </li><li> Fondo secco di filtro cella utilizzando un tessuto di laboratorio, quindi utilizzare un pennello per il trasferimento del campione catturato nel filtro in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 0,5 ml di metanolo. Nota: Se più fiale di scintillazione sono in uso, completare i passaggi 2.12 e 2.13 una fiala alla volta per evitare che si secchi campione su filtri cellulari. </li><li> Una volta che il campione è stato aggiunto alla provetta, eliminare il metanolo con una pipetta. Garantire campione è depositata sul fondo della provetta. </li><li> Sciacquare campione nella provetta con l&#39;aggiunta di circa 0,5 ml di metanolo al tubo. Attendere per il campione di risolvere quindi rimuovere il metanolo con una pipetta. </li><li> Ripetere il passaggio 15 tre volte. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di metanolo al tubo, e poi conservare in freezer a -20 ° C per un uso successivo. </li></ol> 3. reidratazione e preparazione di campioni per Immunostaining <ol><li> Rimuovere metanolo dalla provetta con una pipetta, lasciando il campione nel tubo. Conservare rifiuti metanolo al contenitore rifiuti appropriato fino al momento corretto smaltimento. Nota: Per migliorare l&#39;efficienza sonicazione, utilizzano non più di 3 mm di campione stabilirono sul fondo della provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Campione in eccesso può essere trasferita in un tubo separato con una pipetta prima di iniziare la fase di reidratazione sopra. Tagliare la punta della pipetta con una lama di rasoio pulito può essere usato per prevenire l&#39;intasamento della punta della pipetta. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di una soluzione al 50% di metanolo / tampone fosfato Tween (PBTw) al tubo e rock per 3 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di metanolo al contenitore dei rifiuti corretto e risciacquare con 1,0 ml di PBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare il campione di stabilirsi prima svinatura il PBTw con una pipetta. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di albumina sierica bovina / Tampone fosfato Tween (BBTw) mescolare al flaconcino e rock. Dopo 3 minuti su una sedia a dondolo, consentire la sample di stabilirsi e rimuovere il BBTw con pipetta. </li><li> Ripetere il punto 3.4 due volte avendo cura di rimuovere quanto più BBTw possibile senza perdere campione dopo l&#39;ultimo lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di BBTw al tubo e posizionare il tubo in ghiaccio. </li></ol> 4 Sonicazione di Campione <ol><li> Impostare il sonicatore al 10% dell&#39;ampiezza massima e designare un tempo di funzionamento di 2 sec costante sonicazione. Nota: Queste impostazioni sono specifiche del sonicatore indicato nei Materiali e attrezzature Tavolo e possono richiedere l&#39;ottimizzazione per i diversi sonicatori. </li><li> Prima di sonicazione di campione, pulire la sonda sonicatore posizionando la punta della sonda in un tubo da 50 ml riempita con acqua deionizzata e corsa di sonicazione per pulire la sonda. Sonda sonicatore secco con tessuto in laboratorio dopo l&#39;esecuzione. </li><li> Immergere la sonda nella provetta contenente campione in modo che sia posizionato a circa 3-4 mm sopra il campione e iniziare a sonicazione. </li><li> Rimuovere il mtubo icrocentrifuge e metterlo in ghiaccio per almeno 30 secondi per dissipare il calore da sonicazione e permettere campione di stabilirsi sul fondo della provetta. </li><li> Ripetere i punti 4.3 e 4.4, come necessario in base all&#39;età di campione in fase di elaborazione. Nota: Per ottimizzare il volume del campione sonicazione, gli embrioni più giovani di 17 ore non richiedono sonicazione, ma quelli tra 17 e 24 ore (fase 17 / early-L1) richiedono due sonications. Larve tra 24 - 36 (inizio / metà-L1), 36 - 48 (metà / fine-L1), 48 - 60 (inizio / metà-L2), 60-72 (metà / fine-L2), 72-84 ( early-L3), 84-96 (inizio / metà-L3), 96-108 (metà / fine-L3) hr richiedono 5, 9, 11, 13, 15, 18, e 22 sonications rispettivamente. Vedere di discussione per ulteriori elaborazioni sui tempi di sonicazione. </li><li> Sciacquare con 1,0 ml BBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare il campione di stabilirsi prima di trarre fuori BBTw con una pipetta. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di BBTw nel flacone e rock. Dopo 3 minuti a bilanciere, permettono il campione di stabilirsi e rimuovere il BBTw con pipetta. &lt;/ Li&gt; <li> Ripetere il punto 4.7 due volte. </li></ol> 5. Immunostaining <ol><li> Blocco campione con l&#39;aggiunta di 5% di siero normale diluito in BBTw alla provetta. Rimuovere blocco dopo dondolo per 1 ora. Nota: Utilizzare siero normale dalla specie in cui si generano gli anticorpi secondari. </li><li> Diluire gli anticorpi primari di appropriarsi concentrazione di lavoro in 5% di siero normale soluzione / BBTw. </li><li> Campione di roccia in soluzione anticorpo primario O / N a 4 ° C o per almeno 3 ore a temperatura ambiente (circa 22 ° C. Nota: i tempi di incubazione dell&#39;anticorpo e le temperature possono variare. O / N di incubazione a 4 ° C o 3 ore a temperatura ambiente è tipicamente sufficiente. Tuttavia, un periodo di incubazione di due giorni può migliorare la qualità della colorazione, soprattutto con i campioni più grandi o quando si utilizzano anticorpi primari a bassa affinità. Incubazioni più lunghe sono in genere eseguite a 4 ° C. Analoghe considerazioni devono essere effettuate quando si utilizza anticorpi secondari (vedi 5.10). </li><li> Lasciare che il campione di stabilirsi afondo della provetta per microcentrifuga. Aspirare anticorpi primari con pipetta. Salvare gli anticorpi per il riutilizzo, se desiderato. </li><li> Sciacquare con 1,0 ml di BBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare campione di stabilirsi prima di trarre fuori BBTw con una pipetta. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di BBTw nel flacone e rock. Dopo 3 minuti sul bilanciere, permettono campione di stabilirsi e rimuovere BBTw con pipetta. </li><li> Ripetere il punto 5.6 cinque volte. </li><li> Campione Block con l&#39;aggiunta di 5% di siero normale soluzione / BBTw alla provetta. Rimuovere blocco dopo dondolo per 30 minuti a 1 ora. Nota: Questo passaggio di bloccaggio supplementare non è necessario, ma può migliorare la qualità della colorazione degli anticorpi specifici. </li><li> Diluire anticorpi secondari di appropriarsi concentrazione di lavoro in 5% di siero normale soluzione / BBTw. </li><li> Avvolgere provetta in un foglio di alluminio per ridurre il deterioramento causato da esposizione alla luce. Campione di roccia in soluzione di anticorpo secondario per 12-48 ore a 4 ° C o per almeno 3 ore a temperatura ambiente (circa 22 ° C. </li><li> Lasciare campione a stabilirsi al fondo della provetta da microcentrifuga. Aspirare anticorpi secondari con pipetta. </li><li> Sciacquare con 1,0 ml di PBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare campione di stabilirsi prima svinatura il PBTw con una pipetta. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di PBTw nel flacone e rock. Dopo 5 min a bilanciere, permettono il campione di stabilirsi e rimuovere il PBTw con pipetta. </li><li> Ripetere il punto 5.13 tre volte. </li><li> OPTIONAL: Aggiungi DAPI diluito 1: 1000 in PBTw. Campione di roccia avvolta in un foglio di alluminio per 3 min; quindi rimuovere soluzione DAPI con una pipetta. Sciacquare cinque volte con 1,0 ml di PBTw, permettendo campione di stabilirsi prima di rimuovere PBTw con pipetta. </li><li> Aggiungi 80-100 ml di 1,4-diazabiciclo soluzione [2.2.2] ottano (DABCO) per provetta e conservare a -20 ° C. Nota: un altro agente anti-fade base di glicerolo-può essere sostituito. </li></ol> 6 Analisi <ol><li> Prima del campione di montaggio su vetrini, aggiungere un extra di 5-10 ml di DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade soluzione provetta. Nota: Il campione può essere aggiunto alle diapositive senza dissezione. Volume del campione aggiunto a una diapositiva varia con le dimensioni coprioggetto. Quando pipettaggio del campione sul vetrino, la punta della pipetta può essere tagliato con una lama di rasoio per evitare campione di taglio. Spesso è utile per allineare campione in file per l&#39;analisi facile. L&#39;aggiunta di PPD come agente antifade aggiuntivo potrebbe non essere necessaria, ma può impedire photobleaching se i campioni vengono conservati a lungo termine. </li><li> Posizionare delicatamente antiscivolo copertura in vetro sopra del campione. Poi, polizza di copertura sicura in posizione con smalto. </li><li> Visualizza montato campione utilizzando la microscopia a fluorescenza. </li></ol>

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<li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li>
<li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li>
<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo fornisce un metodo per indirizzare correttamente immunostain Drosophila embrionale e tessuti larvali in situ, eliminando così la necessità di dissezione. Come per i protocolli precedenti per la colorazione embrioni precoci 1,2,3, la membrana corionica viene rimossa con il 50% di candeggina (NaOCl). I campioni sono fissati in formaldeide e metanolo. Poiché la cuticola larvale provoca campione più vecchio a stare a galla, l&#39;intero campione viene fatto passare attraverso u...

Embrioni di Drosophila e larve forniscono un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo in molti organi e tessuti. Imaging delle singole cellule è spesso necessario in questi studi per verificare gli ambienti complessi in cui le cellule si sviluppano. Visualizzazione di cellule nei tessuti può essere realizzato attraverso immunostaining. Ben descritti immunoistochimica esistono protocolli per i tessuti embrionali di Drosophila &lt;17 ore dopo la deposizione delle uova (AEL) 1-3. Tuttavia, un protettivo forme cuticola verso la fine dell&#39;embriogenesi, impedendo efficace permeazione anticorpo. Così, questi protocolli immunostaining sono inefficienti per l&#39;analisi dei tessuti in embrioni in ritardo-fase e nelle successive fasi di sviluppo larvale (1 ° instar (L1), 2 ° instar (L2), e 3 ° instar (L3)). Questa inefficienza impone un ostacolo alla nostra comprensione dei processi dinamici che si verificano durante il periodo di sviluppo prolungato 4. Tissue dissezione è una tecnica largamente impiegato per aggirare questa barriera 5-7. Tuttavia, dissezione può rivelarsi inefficiente. L&#39;estrazione può essere gravato da difficoltà nel trovare o isolare embrionale e tessuti larvali. Inoltre, la rimozione fisica dei tessuti bersaglio può causare danni da loro rottura o omettendo di estrarli nella loro interezza. La sonicazione è un metodo che impiega onde sonore disturbare interazioni intermolecolari. È stato usato per disturbare l&#39;integrità della cuticola larvale Drosophila per immunostain sviluppare tipi di cellule neurali 6. Questo protocollo è stato adattato per immunostain ritardo-fase embrionale e larvale gonadi, che può essere piccolo come 50 micron di diametro 8-10. Attraverso tali studi, il processo di maschio di cellule staminali germinali (GSC) formazione di nicchia è stata caratterizzata nell&#39;ultima fase embrioni di Drosophila 8-10 e meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule staminali e difdifferenzia- nell&#39;ultima fase gonadi embrionali e le larve sono stati chiariti 9-12. Così, sonicazione fornisce un&#39;alternativa efficiente per la dissezione dei tessuti che può essere difficile a causa delle dimensioni del tessuto. Inoltre, esso consente immunocolorazione di tessuti di Drosophila in situ, lasciando le cellule nel contesto dell&#39;intero organismo e mantenuto in situ morfologia. Qui, descriviamo un protocollo step-by-step per fluorescenza immunoistochimica di ritardo-fase embrionale attraverso primi tessuti / mid-L3 in situ. Analisi di Drosophila gonadica e neurale tessuto è mostrato nelle Rappresentante dei risultati per dimostrare l&#39;efficacia di questo protocollo. Inoltre, questo protocollo immunostaining può essere adattato ad analizzare altri tessuti di Drosophila così come i tessuti in altri organismi con una cuticola esterna.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabella 1: Reagenti e tamponi Tampone</td></tr><tr><td>fosfato Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>Per 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Negozio presso RT.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>Per 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4. Aggiungere i componenti e riempire fino al volume appropriato. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>Per 50 ml: 5 ml di Triton, 5 ml di PBS 10X, 45 ml di ddH2O. Rock da miscelare. Negozio presso RT.</td></tr><tr><td>Tubi PEMS</td><td></td><td></td><td>0,1 m (pH 6,9), 2,0 mM MgSO4, 1,0 mM EGTA. Negozio presso RT.</td></tr><tr><td>Tubi</td><td></td><td></td><td>Per 400 ml di una soluzione 0,25 M (pH 6,9): 30,24 g Tubi dH20 NaOH. Sciogliere i tubi in 300 ml di dH2O e quindi regolare a pH 6,9 con NaOH. Portare il volume totale a 400 ml con dH2O e autoclave. Negozio presso RT.</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td></td><td></td><td>37% formaldeide in peso in metanolo. Conservare presso RT. Conservare la miscela di scarti di formaldeide, eptano e metanolo in un contenitore ermeticamente sigillato in cappa aspirante prima dello smaltimento secondo le linee guida istituzionali.</td></tr><tr><td>Eptano</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-eptano. Conservare presso RT. Conservare la miscela di scarti di formaldeide, eptano e metanolo in un contenitore ermeticamente sigillato in cappa aspirante prima dello smaltimento secondo le linee guida istituzionali.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>Conservare presso RT. Conservare la miscela di rifiuti di formaldeide, eptano e metanolo in un contenitore ermeticamente sigillato in cappa aspirante prima dello smaltimento secondo le linee guida istituzionali.</td></tr><tr><td>Tampone fosfato Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>Per fare 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Il filtro sterilizza dopo aver aggiunto tutti i componenti. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>Per 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml di PBS 10X, 40 ml di ddH2O. Rock da miscelare. Negozio presso RT.</td></tr><tr><td>Siero bovino albumina/tampone fosfato Tween (BBTw)</td><td></td><td></td><td>Per fare 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Albumina sierica bovina (BSA). Aggiungere BSA quindi sterilizzare utilizzando un 0,2 &mu; m Unità filtro sottovuoto. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Siero di capra normale (NGS)</td><td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>Per fare 10 ml: Siero di capra normale 10 ml ddH2O. Aggiungere ddH2O alla fiala di NGS e sterilizzare con un 0,2 &mu; m Filtro Syrninge. Conservare le aliquote a -20 °C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano (DABCO)</td><td></td><td>CAS: 281-57-9</td><td>Per fare 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml di Tris HCl (1M, pH 7,5), 2,5 g di DABCO solido, 3,5 ml 6N HCl, 250 &mu; l 10N NaOH, 70 ml di glicerolo. Nel becher da 250 ml con ancoretta, aggiungere ddH2O, Tris HCl e DABCO. Mescolare e poi aggiungere 6N HCl, 10 N NaOH e glicerolo. Quindi aggiungere 10N NaOH goccia a goccia fino a quando la soluzione raggiunge il pH 7,5. Aliquota. Conservare le aliquote a -20 °C.</td></tr><tr>DABCO + soluzione <td></td><td></td><td>di p-fenilendiammina (PPD)</td><td>1,765 ml NaHCO3, 0,353 Na2CO3, 0,02 g PPD (CAS: 106-50-3). Sciogliere la PPD nella soluzione di NaHCO3 e NaCO3. Aggiungi 60 &mu; l di soluzione PPD a 500 &mu; l di DABCO. Conservare le aliquote a -20 °C.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Per <td>preparare ~200 piatti: 45 g di agar agar (CAS#9002-18-0), 45 g di zucchero semolato (acquistato in negozio), 500 ml di succo di mela (acquistato in negozio), 15 ml di Tegosept 10%, 1,5 ml di ddH2O. Aggiungere l'agar a ddH2O in un pallone da 4 L, quindi sterilizzare in autoclave per 30 minuti. Mescolare il succo di mela e lo zucchero sulla piastra di cottura riscaldata. Aggiungere gradualmente la miscela di succo di mela all'agar autoclavato. Mescolare su una piastra di miscelazione riscaldata, quindi aliquotare 10 ml di volume in piastre di Petri da 35 mm e lasciare riposare a RT per solidificare. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>Per fare 100 ml: 10 g di Tegosept, 100 ml di etanolo. Conservare le aliquote a -20 °C.</td></tr><tr><td>Pasta</td><td></td><td></td> di lievito~<td>50 g di lievito attivo secco. Aggiungere gradualmente ddH2O al bicchiere contenente lievito mescolando fino a raggiungere una consistenza pastosa. Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 2: Materiali coloranti</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, stock a 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Coniglio anti-Vasa</td><td></td><td></td><td>1:250, dono di Ruth Lehmann.</td></tr><tr><td>Mouse anti-Fasciclin III</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Mouse anti-1B1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>Guniea pig anti-Traffic Jam</td><td></td><td></td><td>1:2500, un dono di Dorthea Godt (Li et al, 2003).</td></tr><tr><td>Topo anti-Prospero</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Rat anti-Elav</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr><tr><td>topo anti-Repo</td><td>Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Capra anti-topo Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Maiale anti-guniea di capra Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 3: Materiali e attrezzature</td></tr><tr><td>Gabbie per mosche</td><td>fatte a mano; Genesee Scientific Corporation</td><td>Non applicabile; Bottiglie: 32-130; Gabbia prefabbricata: 59-101</td><td>Realizzata tagliando tubi acrilici colati trasparenti (1 3/4 di pollice di diametro) in segmenti alti 4 pollici con una troncatrice composta a 400 giri/min. Schermatura ultrafine in acciaio inossidabile (è stata fissata a un'estremità della vasca con colla acrilica. Un metodo alternativo che utilizza una bottiglia vuota di cibo per mosche può essere trovato nei protocolli Drosophila ISBN 0-87969-584-4. Le gabbie possono anche essere acquistate dalla Genesee Scientific Corporation.</td></tr><tr><td>Sonicatore: Branson 250 Digital Sonifier</td><td></td><td>Branson Modello: Branson Digital Sonifier 250</td><td></td></tr><tr><td>Sonda sonicatrice</td><td>Branson</td><td>Modello #: 102C (CE)</td><td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0.2 &mu; m cellulosa, filtro a membrana in acetato</td></tr><tr><td>Sistema di imaging: Microscopio confocale a disco rotante con sorgente luminosa multicromatica, fotocamera CCD digitale e software di imaging</td><td>Microscopio: Olympus, Sorgente luminosa: Lumen Dynamics, Fotocamera: Q-Imaging, Software di imaging: Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>Microscopio: BX51 dotato di disco rotante DSU, Sorgente luminosa: X-Cite 120Q, Fotocamera: RETIGA-SRV, Software di imaging: Slidebook 5.0</td></tr><tr><td>Unità filtro sottovuoto</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0.2 &mu; m filtro a membrana in nitrato di cellulosa</td></tr></tbody></table>

sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; drosophila</em&gt; tessuti<em&gt; in situ</em

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Gli studi condotti in Drosophila melanogaster embrioni e larve forniscono informazioni cruciali nei processi di sviluppo, come specifica il destino delle cellule e organogenesi. Immunocolorazione permette la visualizzazione di sviluppare tessuti e organi. Tuttavia, una cuticola protettiva che si forma al termine della embriogenesi impedisce permeazione di anticorpi in embrioni in fase avanzata e larve. Mentre dissezione prima della colorazione viene regolarmente utilizzato per analizzare i tessuti di Drosophila larvali, si rivela inefficiente per alcune analisi, perché i piccoli tessuti possono essere difficili da individuare e isolare. Sonicazione fornisce un&#39;alternativa alla dissezione nei protocolli di immunoistochimica Drosophila larvali. Esso consente una rapida, l&#39;elaborazione simultanea di un gran numero di embrioni in fase avanzata e le larve e mantiene nella morfologia situ. Dopo fissazione in formaldeide, un campione viene sonicato. Campione viene quindi sottoposto ad immunocolorazione con antigene-specifica formica primariaibodies e anticorpi secondari fluorescente di visualizzare tipi di cellule bersaglio e proteine ​​specifiche mediante microscopia a fluorescenza. Durante il processo di sonicazione, il corretto posizionamento di una sonda sonicating sopra il campione, nonché la durata e l&#39;intensità della sonicazione, è critica. Additonal piccole modifiche ai protocolli di immunoistochimica standard possono essere richiesti per le macchie di alta qualità. Per gli anticorpi con basso rapporto segnale rumore, tempi di incubazione più lunghi sono in genere necessari. Come un proof of concept per questo protocollo sonicazione-facilitato, mostriamo immunoistochimiche su tre tipi di tessuto (testicoli, ovaie, e tessuti neurali) ad una serie di stadi di sviluppo.

Per dimostrare l&#39;efficacia di immunoistochimica basata sonicazione-analisi di ritardo-fase embrionale e tessuti larvali in situ, wild-type embrioni e larve sono stati trattati per immunoistochimica dei testicoli, ovaie e tessuto neurale. I campioni sono stati ripresi tramite microscopia confocale e risultati rappresentativi sono mostrati (Figura 1 e Figura 2). I risultati rivelano che il protocollo descritto è efficace per la visualizzazione di caratteri morfologici, nonché...

L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare o saturare i tessuti in C due mediante microscopia a fluorescenza dopo sonificazione. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo campioni embrionali e larvali, quindi fissandoli con formaldeide, eptano e metanolo. Il secondo passaggio consiste nella sonificazione del campione fissato per rimuovere la cuticola e consentire la penetrazione dell'anticorpo.Successivamente, il campione viene immuno marcato con anticorpi primari e secondari fluorescenti. L'ultimo passaggio consiste nel montare il campione in una soluzione Antifa a base di glicerolo. Infine, si utilizza la microscopia confocale o a fluorescenza in episcopio per visualizzare il tessuto in via di sviluppo, nonché l'espressione e il localizzazione delle proteine.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi come la dissezione dei tessuti è che consente la visualizzazione in situ di una varietà di tessuti in via di sviluppo. In genere, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà poiché il passaggio di sonica dipende da diversi fattori per raggiungere la massima efficienza, tra cui il corretto posizionamento

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

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Biologia

Mesoscopici fluorescenza tomografia opera oltre i limiti di penetrazione del tessuto-sezionamento microscopia a fluorescenza. La tecnica è basata su multi-proiezione di illuminazione e una descrizione di trasporto fotone. Abbiamo dimostrato in vivo di tutto il corpo visualizzazione 3D della morfogenesi della GFP che esprimono ala dischi immaginale...

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

Qui si descrive un insieme di montaggio...

Tutta la Monte RNA fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; L&#39;ibridazione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Viene presentato un protocollo di immunocolorazione a montaggio intero su embrioni di afidi, in cui vengono affrontate le condizioni critiche per ridurre la colorazione di fondo e aumentare la permeabilità tissutale. Queste condizioni sono state sviluppate specificamente per il rilevamento efficace dell'espressione proteica nei tessuti embrionali degli afidi.

Individuazione di condizioni critiche per Immunostaining nel pisello afide embrioni: l&#39;aumento del tessuto Permeabilità e diminuire la colorazione di fondo

Imaging della morfogenesi di embrioni insetto con luce microscopio a fluorescenza foglio basata è diventato stato dell'arte. Questo protocollo descrive e confronta tre tecniche di montaggio appropriate per gli embrioni Tribolium castaneum, presenta due linee transgeniche misura romanzo ben adatto per l'imaging in tempo reale, discute controlli di qualità essenziali e indichi limitazioni dell'esperimento corrente.

Luce Scheda a base di microscopia a fluorescenza di vita o fissate e colorate<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; embrioni

Il protocollo descritto di RNA in situ ibridazione del permette la rilevazione del RNA in embrioni della drosofila interi o tessuti dissecati. Utilizzando piastre microtiter a 96 pozzetti e amplificazione del segnale di microarray, trascrizioni possono essere rilevate alla velocità effettiva, sensibilità e alta risoluzione e ad un costo relativamente basso.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

Qui, descriviamo un protocollo per il rilevamento e la localizzazione della proteina embrionale di Drosophila e dell'RNA dalla raccolta al pre-incorporamento e incorporamento, all'immunocolorazione e all'ibridazione in situ dell'mRNA.

Un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'RNA in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce

Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l'immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l'osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Questi protocolli delineano come caratterizzare l'organizzazione e la funzione di occluso delle giunzioni del setto piegato nell'epitelio embrionale di Drosophila di controllo e mutante.

Immunocolorazione e esperimenti di penetrazione del colorante per definire le proteine di giunzione settata piegate core nell'epitelio embrionale di Drosophila

Impara la sonica-facilitata immunofluorescenza per visualizzare tessuti embrionali e larvali di Drosophila melanogaster senza dissezione. Questo metodo migliora la penetrazione degli anticorpi attraverso la cuticola.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale

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