In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare in tempo reale singoli trascritti di RNA in cellule viventi. Ciò si ottiene ibridando prima due oligonucleotidi che sono stati progettati per formare una sonda a forcina nota come metrica del rapporto per faro molecolare. Il secondo passo consiste nel purificare la metrica del rapporto mediante beacon molecolari mediante cromatografia ad esclusione dimensionale.

Successivamente, la metrica del rapporto mediante fari molecolari viene introdotta nelle cellule che esprimono il bersaglio dell'RNA ingegnerizzato tramite micro porzione. Il passaggio finale consiste nel vedere le cellule in una piastra a micropozzetti adatta per la microscopia su cellule vive. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per monitorare i movimenti dei singoli trascritti di RNA visualizzati come punti fluorescenti luminosi all'interno di singole cellule.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza sonde sintetiche che sono luminose e fotostabili e mostrano un segnale elevato sullo sfondo, il che apre la possibilità di imaging di qualsiasi RNA endogeno Iniziare la preparazione del rapporto metrico mediante beacon molecolari o RBM BS mescolando i seguenti reagenti in una provetta. 20 microlitri di Rbm B uno 30 microlitri di Rbm B due sei microlitri di 10 x tampone fosfato, e quattro microlitri di acqua libera di DNA e RNA. Questo è in genere sufficiente per circa 50 studi.

Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Nel frattempo, preparare una colonna per cromatografia liquida per rimuovere eventuali oligonucleotidi RBM B ibridati all'ONU. Utilizzare 75 super deck di grado di preparazione in una colonna per cromatografia liquida da otto millilitri con un volume del letto di circa quattro millilitri utilizzando una pompa a siringa che funziona a una portata di 0,6 millilitri al minuto.

Lavare ed equilibrare il SUEx con circa 50 millilitri di un tampone fosfato prima che tutto il fluido entri nel volume del letto. Arrestare la pompa a siringa, staccarla e lasciare che il liquido rimanente passi attraverso la colonna per gravità. Quindi, caricare la miscela RBMB sulla colonna cromatografica.

Dopo che il campione RBMB è completamente entrato nel letto, aggiungere lentamente altri 250 microlitri di un tampone fosfato nella parte superiore del letto per assicurarsi che l'intero campione sia completamente entrato nella colonna. Riempire la colonna fino al bordo con un tampone fosfato. Chiudere la parte superiore e avviare la pompa a siringa.

La siringa è riempita con circa 50 millilitri di un XPBS e funziona a una velocità di flusso di 0,6 millilitri al minuto. In genere, il campione RBMB può essere facilmente visualizzato grazie al colore del colorante incorporato nella sonda. Una volta che l'RBMB si avvicina al fondo della colonna, raccogliere il flusso attraverso due gocce per provetta da microcentrifuga.

Interrompere la raccolta del campione. Una volta che il colore del campione all'interno delle provette per microcentrifuga diventa chiaro, combinare le provette contenenti il campione RBMB colorato, in genere da cinque a sei provette, e caricarle in un dispositivo di filtro centrifugo. Centrifugare il campione a 10.000 RCF per 20 minuti o fino al volume desiderato.

Questa velocità e questo tempo produrranno in genere un volume finale di circa 30 microlitri. In questo protocollo, una linea cellulare di fibrosarcoma umano è stata ingegnerizzata per esprimere Q-F-P-R-N-A con 96 ripetizioni tandem della sequenza target RBMB nei tre UTR primari, la linea cellulare di controllo è stata ingegnerizzata per esprimere Q-F-P-R-N-A wild type un giorno prima della sonda in una fiaschetta T 25 al 40-50% di co. Le cellule con DMEM media sono state integrate con l'1% di streptococco in penna e il 10% di siero bovino fetale e incubano a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica il giorno successivo.

Accendere il micro por e impostare i parametri di micro portrazione ottimizzati per le celle HT 10 80. Riempire la provetta per microporzioni con quattro millilitri di tampone elettrolitico e posizionarla sulla stazione di micropreparazione. Scongelare un campione stock di RBMB purificato e diluire diversi microlitri fino a una concentrazione finale di 12 micromolari con un tampone fosfato.

È necessario un microlitro per ogni microporzione. Per ogni reazione di microporzione, pipettare un millilitro di terreno di coltura con FBS, ma senza antibiotici, in una provetta per microcentrifuga. Metterlo da parte vicino al dispositivo micro porion.

Verrà utilizzato in seguito per sospendere le cellule subito dopo la micro preparazione. Gli antibiotici non vengono utilizzati perché ridurrebbero la vitalità cellulare dopo la micropreparazione. Le celle HT 10 80 placcate il giorno precedente dovrebbero ora essere confluenti al 60-80%.

Rimuovere i terreni di coltura cellulare e lavare le cellule una volta con un millilitro di DPBS privo di calcio e magnesio, incubare con un millilitro di tripsina per uno o due minuti. Fermare la tripsina aggiungendo un millilitro di terreno DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino senza antibiotici e rosso fenolo e trasferire le cellule in due provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Far girare le cellule nella provetta della microcentrifuga a 200 volte G per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante, risospendere e unire i pellet cellulari in un volume finale di un millilitro di DPBS. Rimuovere 10 microlitri dalla sospensione cellulare ben miscelata per contare le cellule, pipettare le cellule su e giù più volte per assicurarsi che siano ben disperse e trasferire 300.000 cellule con DPBS in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Girare verso il basso a 200 volte G per cinque minuti.

Rimuovere il surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Risospendere il pellet in 11 microlitri di sospensione Resus, tampone e pipetta su e giù più volte per assicurarsi che le cellule siano ben disperse. Assicurarsi di non generare bolle d'aria.

Aggiungere un microlitro di RBMB diluito e mescolare bene pipettando su e giù più volte. Anche in questo caso, fare attenzione a non generare bolle d'aria. È fondamentale evitare di introdurre bolle d'aria nella sospensione delle vendite di RBMB perché le bolle d'aria causeranno una scintilla durante il micro funzionamento e si tradurranno in una scarsa consegna di RBMB e morte cellulare.

Utilizzando la pipetta di micropreparazione, aspirare 10 microlitri della miscela di cellule RBMB e inserire la pipetta nella provetta di micropreparazione. Premi il pulsante di avvio per avviare la micro società. Non dovrebbero esserci bolle d'aria visibili nella punta quando lo schermo del micro por mostra il completamento.

Rimuovere la pipetta dalla stazione ed espellere la miscela da 10 microlitri nella provetta da microcentrifuga precedentemente preparata contenente un millilitro di terreno di coltura con FBS, ma senza antibiotici miscelato delicatamente facendo oscillare la provetta da un lato all'altro più volte. Centrifugare le celle a 200 volte G per cinque minuti. Lavare le cellule due volte in un millilitro di terreno di coltura privo di rosso fenolo con FBS, ma senza antibiotici per rimuovere eventuali rbm BS che non sono stati somministrati nelle cellule.

Dopo il secondo lavaggio. Resus sospendere le cellule in 400 microlitri di terreno di coltura privo di rosso fenolo con FBS, ma senza antibiotici. Piastra le celle micro proporzionali in un vetro di copertura a otto camere rivestito in polide lisina precedentemente preparato a 200 microlitri per pozzetto o alla cofluenza desiderata.

Posizionare il vetro di copertura a camera in un incubatore per colture cellulari. L'imaging può essere eseguito non appena 30 minuti dopo la micro preparazione. Per iniziare questa procedura, accendere il sistema di incubazione superiore dello stadio di cellule vive ed equilibrarlo fino a raggiungere i 37 gradi Celsius, il 5% di anidride carbonica e il 75% di umidità.

Accendere il microscopio e la sorgente di luce fluorescente e aprire il software di acquisizione delle immagini metamorfiche. Applicare l'olio da immersione sull'obiettivo. Trasferire il vetro di copertura a camera con celle microporate allo stadio di cella viva.

Sistema di incubazione superiore. Incubare il sistema della parte superiore del palco fino a quando la temperatura e i livelli di anidride carbonica non si sono stabilizzati. Apri la scheda di acquisizione nel software metamorph.

Fare clic sul pulsante Mostra in tempo reale per trovare il campo. Regola la messa a fuoco sotto la luce bianca e fai clic sul pulsante di arresto in diretta. Nella scheda acquisisci.

Fare clic e aprire il pulsante popup di acquisizione del flusso e impostare i parametri di acquisizione del film desiderati. Acquisisci 150 fotogrammi utilizzando il filtro SCI five CF six 40 R. Salvare le immagini sul disco rigido.

Qui sono mostrate immagini rappresentative di HT 10 80 cellule che esprimono stabilmente RNA con 96 ripetizioni tandem, o quattro ripetizioni tandem del sito di legame RBMB nei tre UTR primari. A seguito della somministrazione intracellulare di mbs. La presenza di 96 ripetizioni tandem consente ai singoli trascritti di RNA di apparire come macchie fluorescenti luminose.

Al contrario, l'RNA contenente solo quattro ripetizioni tandem appare come macchie fluorescenti molto deboli e spesso è rilevabile solo in aree di fondo eccezionalmente basso. L'acquisizione di immagini in streaming consente di visualizzare in tempo reale i singoli trascritti di RNA. I singoli trascritti di RNA possono essere facilmente visti all'interno del citoplasma e del nucleo delle cellule sottoposte a movimenti browniani o sub diffusivi.

In rari casi, si osserverà un RNA sottoposto a trasporto diretto come mostrato qui. I trascritti di RNA sottoposti a trasporto diretto si muovono tipicamente rapidamente lungo un percorso rettilineo. In questo montaggio, la traiettoria del trascritto dell'RNA è mostrata sovrapposta su un singolo fotogramma della serie temporale.

I movimenti diretti dell'RNA sono coerenti con il trasporto dell'RNA lungo i microtubuli e i microfilamenti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e purificare la metrica razziale mediante fari molecolari. Fornire metriche razziali tramite beacon molecolari nelle cellule tramite micro parion e visualizzare i trascritti di RNA singolo al microscopio a fluorescenza.