Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare come le dinamiche di looping del DNA a doppio filamento siano influenzate dalla forma intrinseca del DNA senza l'uso di proteine leganti il DNA. Ciò si ottiene incorporando molecole di colorante in frammenti di DNA a doppio filamento di diverse curvature in modo che il loop del DNA possa essere monitorato mediante risonanza di fluorescenza, trasferimento di energia o frequenza. Gli eventi reversibili di looping e unlooping dalle singole molecole di DNA possono quindi essere osservati mediante microscopia a riflessione interna totale.

La velocità di looping del DNA può quindi essere estrapolata dalle traiettorie temporali della fluorescenza di ogni singola molecola. In definitiva, è possibile misurare la probabilità di looping del DNA in relazione alla forma intrinseca del frammento. Il vantaggio principale di questo saggio di DNA looping è che non si basa sulla proteina legante il DNA A, che potrebbe influenzare la cinetica di looping del DNA A.

Il semplice protocollo consiste nell'utilizzare una tecnica chiamata fluorescenza, risonanza, trasferimento di energia e sintesi del DNA basata sulla PCR. Per misurare la probabilità di ricerca del DNA Inizia progettando DNA curvi a livello globale ripetendo una sequenza di 10 MER. Ad esempio, questa sequenza rappresentativa è un DNA curvo di 186 coppie di basi, dove X è una base extra casuale e le sequenze che fiancheggiano la sequenza ripetuta di 10 mers sono sequenze adattatrici.

Successivamente, eseguire la PCR con i primer uno e due con il donatore di tasti SI tre etichettando il primer due all'estremità cinque prime. Quindi eseguire la PCR con i primer tre e quattro con l'accettore di tasti SCI cinque che marcano attraverso la spina dorsale e il linker della biotina all'estremità principale cinque del primer tre. Dopo aver purificato i prodotti PCR utilizzando un kit di pulizia PCR, mescolare i prodotti marcati con LM tre e cinque in un tampone per lo scambio di filamenti a concentrazioni finali rispettivamente di 0,4 micromolari e 0,1 micromolari.

Quindi incubare i filamenti a 98,5 gradi Celsius per due minuti, raffreddandoli gradualmente a cinque gradi Celsius con una velocità di rampa di 0,1 gradi Celsius al secondo, quindi incubando a cinque gradi Celsius per due ore. Per scambiare i fili per preparare la cella di flusso, utilizzare un trapano a colonna e punte diamantate per creare da sei a sette coppie di fori lungo i due bordi opposti di un vetrino da tre pollici per un pollice. Quando tutti i fori sono stati praticati, strofinare il vetrino sotto l'acqua corrente per rimuovere la polvere di vetro visibile.

Metti i vetrini in posizione verticale in un barattolo di vetro e riempilo con acqua distillata. Sonicare il barattolo per 15 minuti e poi trasferire i vetrini in un barattolo di vetro dedicato alla pulizia con acetone. Riempi il barattolo con acetone e sonica i vetrini in acetone per altri 15 minuti.

Successivamente, spruzzare i vetrini con etanolo e poi con acqua per sciacquarli, quindi trasferire i vetrini in un barattolo di polipropilene. Riempire il barattolo di polipropilene con idrossido di potassio a cinque molari e quindi sonicare i vetrini per altri 15 minuti dopo l'ultimo lavaggio, sciacquare i vetrini in acqua distillata, seguiti da altri 15 minuti. Sonicazione quindi dopo la pulizia dei vetrini coprioggetto.

Allo stesso modo, erogare 80 microlitri di soluzione PEG appena preparata su ciascun vetrino, quindi abbassare delicatamente un vetrino coprioggetti sul piolo. Dopo 45 minuti, utilizzare una pinzetta per rimuovere i vetrini dai vetrini, sciacquare i vetrini e i vetrini coprioggetti con abbondante acqua distillata. Quindi asciugarli in un essiccante quando i vetrini coprioggetti e i vetrini sono asciutti, posizionare strisce sottili di nastro biadesivo sul vetrino per formare canali, una linea un vetrino coprioggetti sulle strisce e premere con decisione sul vetrino coprioggetti per formare canali a tenuta di liquido.

Quindi utilizzare cinque minuti di resina epossidica per sigillare i bordi dei canali per immobilizzare le molecole per la microscopia. Innanzitutto, iniettare 15 microlitri di soluzione di neu tradina in un canale. Dopo due minuti, sciacquare il canale con 100 microlitri di tampone T 50 e quindi iniettare 50 microlitri di campione di DNA nel canale.

Dopo cinque minuti, sciacquare via il DNA non legato con 100 microlitri di tampone T 50, quindi riempire il canale con un tampone di imaging che contiene il sistema di evacuazione dell'ossigeno. Posizionare ora l'olio da immersione sull'obiettivo del microscopio, quindi utilizzare le clip per campioni per fissare la cella di flusso al tavolino del microscopio. Accendi il laser a 532 nanometri.

Utilizzare il live view delle immagini fluorescenti sul monitor per ottenere una multa. Regolare la messa a fuoco. Iniziare l'acquisizione dei dati con il laser a 532 nanometri acceso.

Interrompere l'acquisizione dei dati quando la maggior parte delle molecole è stata sbiancata per elaborare e analizzare le immagini, utilizzare uno script MATLAB per esaminare tutte le tracce temporali delle singole molecole che mostrano transizioni multiple tra i segnali dei tasti alti e bassi. Identificare gli stati di ciclo e di annullamento del ciclo, quindi trovare la soglia che separa le due distribuzioni determinando l'intersezione tra le due curve gaussiane adattate. Quindi, calcola l'efficienza del fronte F dividendo l'intensità fantascientifica per la somma delle tre SCI e delle intensità fantascientifiche.

Assegnazione degli stati del loop con valori di tasto alti e degli stati di unloop con valori di tasto bassi. Quindi, utilizzando uno script MATLAB, analizza il numero cumulativo di molecole o NFT che hanno eseguito il loop, ovvero che hanno raggiunto lo stato di tasto alto in diversi intervalli di tempo. Dall'inizio dell'acquisizione dei dati, il loop rate K sub loop può quindi essere estratto adattando l'NFT con una funzione esponenziale.

Se l'NFT aumenta il bi, in pratica può essere dotato di una doppia funzione esponenziale, come illustrato nell'equazione. In questo caso, da questa equazione si ottiene il sottociclo K per determinare il flusso del fattore J. 20 microlitri da 30 a 50 picaMolar biotina sci cinque oligo o primer tre in uno dei canali rivestiti di noce travain come appena dimostrato.

Successivamente, sciacquare il canale con 100 microlitri di T 50 per lavare via gli oligo non legati, quindi far scorrere nella camera il tampone di imaging appena preparato e integrato con PS tre oligo. Tieni acceso il laser a 532 nanometri e poi accendi brevemente il laser a 640 nanometri per identificare le posizioni di eventuali oligo fantascientifici legati alla superficie. Quindi spegni il laser a 640 nanometri e inizia a monitorare il segnale dei tasti.

Utilizza uno script MATLAB per analizzare il numero di molecole che iniziano nello stato non legato. Questo è con una bassa intensità di sci cinque, ma in seguito si trasforma nello stato IL. Cioè, con un'alta intensità di scifi in funzione del tempo dalle tracce di intensità di scifi, tracciano questo numero di molecole di ane rispetto al tempo, adattando la curva con una singola funzione esponenziale per ottenere il tasso di ealing.

K sub anil, ripetere l'esperimento a diverse concentrazioni di SI tre oligo per confermare la linearità tra la velocità di inginocchiamento e la concentrazione del reagente. Estrarre dal pendio il secondo ordine di una costante di velocità in ginocchio K primo sub ail. Infine, calcolare il fattore J dove K sub loop è la velocità di looping misurata nelle stesse condizioni tampone per testare l'effetto della curvatura intrinseca del DNA a doppio filamento sul looping.

In questo esperimento, una coppia di basi 186 diritte e una curva. Il DNA a doppio filamento è stato costruito rispetto al DNA puro. È stato determinato che il DNA curvo produce più eventi di tasti alti durante lo stesso periodo di tempo.

Il DNA curvo ha anche eseguito il loop quattro volte più frequentemente rispetto al DNA dritto durante lo stesso tempo di acquisizione, dimostrando che la curvatura intrinseca del DNA può influenzare significativamente la dinamica del looping. In questa fase finale dell'analisi, il fattore J è stato calcolato dividendo la velocità di looping per il primo ordine, una costante di frequenza di inginocchiamento, ed è stato determinato essere 61 più o meno tre anomolari per il DNA dritto e 265 più o meno 48 nanomolari per il DNA curvo in accordo con i risultati precedenti. Seguendo questa procedura, è possibile studiare gli effetti del fattore di incidente sulla mobilità del looping, come la temperatura, l'assenza di tensione e la viscosità.

Questo protocollo sarà utile non solo per studiare la fisica dei polimeri del DNA, ma anche per dimostrare il potere della fluorescenza di una singola molecola a studenti di ricerca principianti o a un pubblico non specializzato.