Name: Studiare Looping DNA a singola molecola FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Scopri la dinamica di looping del DNA a doppio filamento utilizzando FRET a singola molecola. Questo metodo misura la probabilità di looping senza proteine leganti, rivelando come la curvatura intrinseca influenzi la cinetica.

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Ringraziamo James Waters, Gable Wadsworth e Bo Broadwater per criticamente la lettura del manoscritto. Ringraziamo anche quattro revisori anonimi per fornire commenti utili. Noi riconosciamo il sostegno finanziario Georgia Institute of Technology, il Burroughs Wellcome Fund Award Career l&#39;interfaccia scientifico, e la borsa di rete di ricerca studente dalla NSF Fisica dei sistemi viventi.

1. Preparazione dsDNA campione <ol><li> Progettare DNA curve globalmente ripetendo una sequenza di 10-mer. Ad esempio, 5&#39;-GTGCCAGCAACAGATAGC - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 &#39;è un DNA curvo 186-bp, dove X è una base supplementare casuale e la sequenza fiancheggiante la sequenza ripetuta 10-mer sono sequenze adattatore. NOTA:. In questo esempio 15 sono stati scelti due 10-mers con preferenze opposte alla formazione dei nucleosomi sulla base di una larga scala studio occupazione nucleosomi da Kaplan et al. Poiché la ripetizione dell&#39;elica di dsDNA è vicino a 10 bp, qualsiasi deviazione netto dell&#39;asse elicoidale del 10-mer si accumulerà per produrre una forma ad arco di cerchio (Figura 3A). Poiché il periodo elicoidale è più vicino a 10,5 bp, una base supplementare è inserito dopo ogni due ripetizioni di mantenere la struttura curva come planare possibile. Queste sequenze più brevi di 200 bp possono essere ordinati da companies che offrono gene servizio di sintesi. E &#39;conveniente per affiancare queste sequenze con sequenze adattatori comuni per i passi successivi. La procedura è schematizzata in Figura 3B. </li><li> Eseguire la PCR con Primer 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Primer 2 è etichettato con il Cy3 donatore FRET all&#39;estremità 5 &#39;. Una tipica ricetta PCR e protocollo di ciclismo sono presentati nelle tabelle 1 e 2. </li><li> Eseguire la PCR con Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) e Primer 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTA: Primer 3 è etichettato con l&#39;accettante Cy5 FRET attraverso la spina dorsale e la biotina-linker all&#39;estremità 5 &#39;. PCR ricetta e il protocollo ciclismo sono come sopra. </li><li> Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di pulizia PCR. </li><li> Mescolare il prodotto Cy3 marcato e il prodotto Cy5 marcato in un buffer di scambio strand (NaCl 100 mM, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) a concentrazioni finali di 0,4 &amp;# 181, M e 0,1 micron, rispettivamente. NOTA: L&#39;eccesso Cy3-DNA aumenta la concentrazione del duplex trasportare sia Cy3 e Cy5 per effetto dello scambio filamento. </li><li> Scambio trefoli incubando a 98,5 ° C per 2 min, gradualmente raffreddamento a 5 ° C con velocità di rampa di 0,1 ° C / sec, e incubando a 5 &#160; ° C per 2 ore. </li></ol> 2. Elettroforesi su gel per rilevare dsDNA curvatura <ol><li> Versare il gel poliacrilammide 16,17 mescolando acrilammide e soluzioni bis-acrilammide a 29.2:0.8 rapporto, 5% (w / v) in 1X Tris / Borato / EDTA (TBE) tampone a pH 8,0. Nota: 10 ml di soluzione di gel contiene: 1.217 ml 40% di acrilammide, 0.667 ml 2% bis-acrilammide, 1 ml di TBE 10X, 100 L persolfato di ammonio (APS) 10%, 10 L TEMED, e il resto è dH 2 O. Solidificazione completa del gel dura circa 30 min. </li><li> Caricare il gel di poliacrilammide con campioni di DNA e il DNA ladder in 1X tampone di caricamento (5% glicerolo, 0,03% (w / v) di bromofenolo blue) ed eseguire il gel a 5-8 V / cm a 4 ° C per 45 minuti o fino a quando il fronte del colorante si avvicina alla fine del gel. </li><li> Macchiare il gel utilizzando tampone 1X TBE contenente 0,5 g / ml di etidio bromuro per 30 min. Identificare le bande di DNA sotto illuminazione UV. Confronta le posizioni di banda con il marcatore di formato (100 bp DNA ladder) per calcolare le dimensioni apparenti delle molecole di DNA. NOTA: curvo DNA generalmente si muovono più lentamente rispetto DNA dritto. </li></ol> 3. Flusso Preparazione cellulare <ol><li> Praticare 6-7 coppie di fori lungo due lati opposti di un vetrino (3&#39;&#39; x 1&#39;&#39;) utilizzando un trapano a colonna e punte di diamante. Dopo la foratura, strofinare lo scivolo in acqua corrente per eliminare polvere di vetro visibile. NOTA: I fori servono come ingressi di perfusione e punti vendita. Durante la perforazione, raffreddando il vetrino con acqua è importante per evitare fessurazioni. </li><li> Porre i vetrini in posizione verticale in un barattolo di vetro e riempirlo con acqua. Ultrasuoni per 15 min e trasferirli in un altro vaso di vetro dedicated per pulizia acetone. Riempire con acetone e ultrasuoni per 15 min. Sciacquare i vetrini con etanolo utilizzando un flacone spray e poi con acqua. Metterli in un barattolo di polipropilene, riempirlo con idrossido di potassio 5 M, e ultrasuoni per 15 min. Infine, sonicare i vetrini in acqua per 15 minuti. Pulire i coprioggetti (n. 1, 24 x 40 mm) utilizzando lo stesso protocollo. NOTA: diapositive e vetrini puliti possono essere memorizzati in dH 2 O per l&#39;uso a lungo termine. </li><li> Mescolare 1 mg di biotina-PEG-silano (MW 3400) con 80 mg di MPEG-silano (MW 2000) in 340 L di soluzione di bicarbonato 0,1 M di sodio. Mescolare bene e centrifugare la miscela brevemente per sbarazzarsi di bolle. NOTA: La funzionalizzazione della superficie con polietilene glicole (PEG) aiuta a ridurre il legame non specifico del DNA alla superficie. </li><li> Mettere 80 L della soluzione di PEG in ogni diapositiva e abbassare delicatamente un coprioggetto su di esso. Attendere 45 min. Separare il vetrino dalla diapositiva con le pinzette, sciacquare con abbondante dH 2 O e lasciare torlo asciugare all&#39;aria aperta. </li><li> Mettere sottili strisce di nastro biadesivo in tutta la diapositiva di formare canali. Allineare un coprioggetto su di esso e premere con decisione il vetrino contro la diapositiva di formare canali a tenuta stagna. Utilizzare 5 minuti epossidica per sigillare i bordi dei canali. </li></ol> 4. Preparazione della Soluzione Trolox <ol><li> Mettere ~ 30 mg Trolox e 10 ml di dH 2 O in un pallone e utilizzare una barra di magnete scalpore per mescolare la soluzione all&#39;aria aperta per 18 ore. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 micron e regolare il pH a 7 con l&#39;aggiunta di ~ 6 microlitri di 1 base M Tris (pH 11). Nota: Trolox è un reagente anti-lampeggiante che viene comunemente usato in singola molecola studi 18. L&#39;azione antiscolorimento di Trolox deriva dal suo derivato ossidato che è presente in parzialmente degradata soluzione Trolox 19. Sciogliendo rapidamente Trolox in metanolo o ad alto pH della soluzione Tris deve essere evitato a causa dell&#39;ossidazione inefficiente. </li></ol> 5. Single-molImaging ecule <ol><li> Iniettare 15 ml di soluzione NeutrAvidin (0,5 mg / ml) nel canale e attendere 2 minuti prima di risciacquare con 100 microlitri di tampone T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,0). </li><li> Iniettare 50 ml di campione di DNA (50-100 pM) nel canale. Attendere 5 minuti e risciacquare il DNA non legato via con 100 L di tampone T50. NOTA: molecole di DNA saranno specificatamente legarsi alla superficie attraverso l&#39;interazione NeutrAvidin-biotina. </li><li> Riempire il canale con il buffer di imaging che contiene un sistema che assorbe ossigeno 20 (PCD 100 mM, 5 mM PCA, 1 Trolox mM e NaCl 500 mM). </li><li> Impostare la EMCCD in modalità a trasferimento di quadro per lo streaming di 2 x 2 immagini categorizzate (256 x 256) al computer a 25 fotogrammi al secondo. </li><li> Mettete l&#39;olio per immersione sull&#39;obiettivo microscopio, e fissare la cella di flusso sul palco microscopio utilizzando clip campioni. Coarse-regolare il fuoco osservando il modello riflessione laser sulla parete. Fine-regolare la messa a fuoco utilizzando la visualizzazione in tempo reale della fluorescenza imetà sul monitor. </li><li> Iniziare acquisizione dati con il laser 532 nm su. Controllare il live view e regolare la messa a fuoco, se necessario. Smettere di acquisizione dati quando la maggior parte delle molecole sono fotodecolorate. NOTA: In questa struttura, viene utilizzato un programma-lab scritta C per controllare il microscopio e visualizzare le immagini in diretta sul monitor in quanto vengono salvati sul disco rigido. </li></ol> 6. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati NOTA: Una serie temporale di 256 x 256 le immagini vengono elaborate da un codice MATLAB per generare singola molecola tempo tracce di Cy3 e Cy5 intensità. Per accoppiare pixel tra il canale donatore e accettore canale dell&#39;immagine split-view, 6-7 coppie di Cy3 e Cy5 macchie, ciascuna coppia dalla stessa molecola uniformemente dispersa attraverso il campo di vista, vengono raccolte manualmente, e una trasformazione affine viene calcolato utilizzando le coordinate di questi punti come punti di ancoraggio. <ol><li> Utilizzo di uno script MATLAB, guardare attraverso tutti i tempi singola molecola tracce tcappello mostrano più transizioni tra i segnali alte e basse tasto. Identificare gli stati in loop e in loop. NOTA: Il segnale FRET è definita come l&#39;intensità Cy5 (I a) diviso per la somma di Cy3 e Cy5 intensità (I a + I d). Stato Looped ha un alto valore FRET mentre lo stato in loop ha un valore basso FRET. L&#39;istogramma dei segnali FRET da una singola molecola è bimodale distribuito a causa di looping reversibile e unlooping. </li><li> Trova la soglia che separa le due distribuzioni determinando l&#39;intersezione tra le due curve gaussiane muro. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza FRET come <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq7.jpg" /> e assegnare gli stati ansa con alti valori di FRET e gli stati in loop con valori bassi FRET. </li><li> Utilizzo di uno script MATLAB, analizzare il numero cumulativo di molecole (N (t)), che in loop (oraggiunto lo stato alto FRET) a diversi time-lapse da inizio acquisizione dati. NOTA: Dal momento che una molecola di dsDNA può iniziare in qualsiasi conformazione dello stato in loop all&#39;inizio di acquisizione dati, il tasso di aumento della popolazione loop riflette il tasso medio di ciclo media di oltre conformazioni iniziali. Estrarre il looping ciclo tasso k montando N (t) con una funzione esponenziale: <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq1.jpg" /> Se aumenta bifasico, può essere dotato di una doppia funzione esponenziale: <img fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51667/eq2.jpg" /> In questo caso, k ciclo è ottenuta da: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51667/eq3.jpg" /> NOTA: Teoricamente, la probabilità di sopravvivenza che un polimero non ha loop al tempo t non è una singola o doppia funzione esponenziale 12. FITT esponenzialeING è usato come un mezzo pratico per estrarre il tempo medio looping. </li></ol> 7. Determinazione del fattore J NOTA: Il fattore J rappresenta come concentrato un&#39;estremità di un dsDNA è intorno all&#39;altra estremità. Può essere determinato interpolando la concentrazione di una estremità del segmento di DNA che produrrebbe la stessa velocità di reazione con l&#39;altra estremità segmento come tasso loop misurata. Sperimentalmente, un segmento finale viene immobilizzato sulla superficie, e l&#39;altra estremità segmento viene introdotto ad una certa concentrazione c. Se il tasso di ricottura misurata tra le due estremità è k ricottura, allora il fattore J 21 è dato da <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq4.jpg" /> . La costante di velocità di ricottura (k = k ricottura ricottura / C) è indipendente dalla concentrazione sonda. <ol><li> Flusso 20 l di 30-50 pM biotina-Cy5 oligo (Primer 3) into un canale NeutrAvidin rivestita. Sciacquare il canale con 100 microlitri T50 per lavare via oligo non legato. </li><li> Preparare il tampone di imaging come descritto nella parte 5 con l&#39;aggiunta di Cy3 oligo (Primer 2) ad una concentrazione finale di 50 nM. Flusso questo buffer di imaging nel canale. </li><li> Pur mantenendo il laser 532 nm su, girare brevemente il laser 640 nm a identificare le posizioni di associazione superficie Cy5 oligo. Spegnere il laser 640 nm e iniziare a monitorare il segnale FRET. NOTA: Su ibridazione di un oligo Cy3 ad un Cy5 oligo-bound superficie, Cy5 fluorescenza derivare da FRET. </li><li> Utilizzo di uno script MATLAB, analizzare il numero di molecole che si aprono nello stato non legato (bassa intensità Cy5) ma poi si trasformano in stato (intensità alta Cy5) ricotto in funzione del tempo per l&#39;intensità tracce Cy5. </li><li> Tracciare questo numero di molecole vs tempo ricottura. Montare questa curva con una singola funzione esponenziale ( <img fo:content-width="1.8in" src="/files/ftp_upload/51667/eq5.jpg"/&gt;) Per ottenere il tasso di ricottura (k tempra). </li><li> Ripetere questo esperimento a diverse concentrazioni Cy3 oligo (60, 100 e 180 nm) per confermare la linearità tra il tasso di ricottura e la concentrazione reagente. Estrarre la costante di velocità di ricottura secondo ordine (k tempra ) Dal pendio. </li><li> Calcolare il fattore J da <img fo:content-width="0.6in" src="/files/ftp_upload/51667/eq6.jpg" /> , Dove k ciclo è il tasso loop misurata nelle stesse condizioni buffer. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano assenza di conflitti di interesse.

Un semplice test single-molecule basato su FRET è stato usato per studiare la cinetica di loop di DNA di diverse forme intrinseche. DNA curve possono essere preparati ripetendo una sequenza di 10-mer in fase con il periodo elicoidale di 10,5 bp, e le curvature possono essere stimati usando PAGE. Questi dsDNAs sono progettati con le estremità adesive per permettere la stabilizzazione ciclo transitorio. Abbiamo estratto il tasso loop dalla crescita esponenziale del numero di molecole in loop nel tempo. La costante di velo...

Comprendere le proprietà meccaniche di dsDNA è di fondamentale importanza nelle scienze di base e applicazioni di ingegneria. La struttura di dsDNA è più complicato di una scala elicoidale dritto, perché angoli di rollio, inclinazione e torsione tra coppie di basi successive possono variare con la sequenza. Fluttuazioni termiche possono causare dsDNA di sottoporsi a diversi modi di fluttuazioni conformazionali come la flessione, torsione e stretching. Transizioni come fusione e attorcigliamenti possono verificarsi anche in condizioni estreme. Tra questi movimenti, dsDNA flessione ha l&#39;impatto biologico più evidente 1. dsDNA piegatura è associato repressione genica o attivazione portando due siti distanti vicini tra loro. Esso gioca un ruolo importante nella confezione DNA all&#39;interno del nucleo cellulare o un capside virale. Deformazione piegatura di dsDNA possono essere visualizzati sperimentalmente microscopia ad alta risoluzione (AFM 2 e 3 TEM), e il Thermodynamics e cinetiche possono essere studiati mediante saggi di looping, che legano chimicamente siti giustapposte del dsDNA. Un tale saggio è ligasi-dipendente ciclizzazione 4. In questo saggio, le molecole di dsDNA con (coesivi) estremita &#39;adesive&#39; sono circolarizzato o dimerizzate da DNA ligasi. Confrontando i tassi di cerchio e la formazione di dimeri, si può ottenere una concentrazione molare efficace di una delle estremità del DNA in prossimità dell&#39;altra estremità, che è conosciuto come il fattore J. Questo fattore J è dimensionalmente equivalente alla densità di probabilità di trovare una estremità del DNA a breve distanza dall&#39;altra estremità, e riflette quindi la flessibilità del DNA. Misurare il fattore J in funzione della lunghezza del DNA rivela molte caratteristiche di meccanica DNA compresa la lunghezza di persistenza 4,5. La catena vermiforme (WLC) modello è stato ampiamente considerato come il modello di polimero canonico per la meccanica dsDNA in base al suo successo nel spiegazioneining le curve forza-estensione ottenuti in DNA tirare esperimenti 6, e correttamente predire i fattori di J dsDNAs più di 200 bp 7. Tuttavia, utilizzando il test ciclizzazione su molecole dsDNA più brevi 100 bp, Cloutier e Widom misurato i fattori J di essere diversi ordini di grandezza superiori rispetto al modello WLC previsione 8. Un anno dopo, Du et al. prodotta fattori J in accordo con il modello WLC utilizzando il test ciclizzazione con concentrazioni più basse di ligasi e attribuito il risultato anomalo dal gruppo Widom ad alte concentrazioni ligasi utilizzati 9. Questa controversia esemplifica l&#39;influenza inevitabile di DNA ligasi sulla cinetica di ciclizzazione quando si utilizza il test convenzionali 9. Inoltre, DNA ligasi può anche influenzare la struttura del DNA e la rigidità attraverso legame non specifico 10,11. Per eliminare le preoccupazioni tecniche di analisi looping proteina-dipendente, abbiamo recentemente dimostrato una prottest looping ein-libero basato sul Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. In questo metodo, conformazioni loop vengono rilevati dal FRET tra donatore e accettore divisoria in prossimità delle estremità appiccicose di una molecola di DNA. Un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale obiettivo di tipo (TIRFM) viene utilizzato per registrare traiettorie di ciclaggio reversibile e eventi unlooping di molecole di DNA a singola superficie immobilizzato per un periodo prolungato di tempo. Questo metodo offre assemblaggio basato su PCR di molecole di DNA per generare molecole di DNA senza disadattamento, che è un miglioramento fondamentale per un metodo simile per Vafabakhsh e Ha 13. L&#39;aspetto unico molecola di questo protocollo permette misura delle distribuzioni oltre Ensemble medie mentre l&#39;aspetto FRET permette di misurare la dinamica di ciclica DNA ripetutamente dalla stessa molecola, anche in condizioni che possono alterare ligasi attività. La configurazione TIRFM è mostrato in Figura 1. A personalizzatoPortaoggetti progettato è posto sopra un corpo del microscopio Olympus IX61. 532 nm e 640 nm laser vengono introdotti dal lato e sono riflessi da specchi ellittici minuscoli 14 nella alta obiettivo NA per ottenere l&#39;angolo di incidenza critico all&#39;interfaccia coprioggetto-acqua. Notiamo che più diffusa passante obiettivo TIR utilizzando specchi dicroici o configurazioni TIR basato prisma può essere utilizzato anche per questa applicazione FRET. L&#39;immagine di fluorescenza formata dal microscopio è suddiviso in immagini donatore e accettore da uno specchio dicroico. Vengono poi ri-masterizzata su due metà di un EMCCD. Ulteriori filtri di emissione passa-lungo sono utilizzati per ridurre segnale di fondo. Il controllo della temperatura è essenziale per acquisire dati cinetici riproducibili. Per il controllo della temperatura, l&#39;obiettivo è separato dal boccaglio del corpo del microscopio per ridurre al minimo il trasferimento di calore, e l&#39;acqua da un raffreddatore / riscaldatore di temperatura controllata è distribuito attraverso un collare di ottone che si adatta strettamenteattorno al metallo interno sotto la giacca obiettivo. Questa configurazione è in grado di ottenere il controllo della temperatura solido a superficie coprioggetto tra 15 e 50 ° C (Figura 2). In questo lavoro, la temperatura del campione è stata mantenuta a 24 ° C. Il protocollo seguente presenta la procedura step-by-step per la costruzione del DNA, la stima di forma del DNA, esperimento di singola molecola, e J determinazione fattore.

<table><tbody><tr><td>Kit di estratto di DNA FRAG piccolo-100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide soluzione al 40% 500 ml</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bis-acrilammide al 2% (p/v) 500 ml</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1.000 bp</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Mini sistema PAGE verticale</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,2 &mu; m CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>quencher a tripletto di stato</td></tr><tr><td>Acido protocatechiico (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>sistema di evacuazione dell'ossigeno</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>sistema di evacuazione dell'ossigeno</td></tr><tr><td>mPEG-silano, MW 2.000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-PEG-Silano, MW 3.400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotina-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin, NeutrAvidin Proteina legante la biotina</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel/PCR Kit di estrazione di frammenti di DNA</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in vetro piano di alta qualità</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro vetro di copertura, rettangolare, n. 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 1006S Refrigeratore/riscaldatore a ricircolo</td> Fisher <td>Scientific</td><td></td><td>Controllo della temperatura</td></tr><tr><td>Obiettivo Collare di raffreddamento</td><td>Bioptechs</td><td>150303</td><td>controllo della temperatura</td></tr><tr><td>KMI53 Biological Stadio di misura micrometrico</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>Laser DPSS ad alte prestazioni 532 nm 50 mW</td><td>Ottica</td><td>Edmund NT66-968</td><td>Eccitazione Cy3</td></tr><tr><td>CUBE Fibra Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fibra, Connettore FC/APC</td><td>Eccitazione</td><td>coerente 1139604</td><td>Cy5</td></tr><tr><td>650 nm Beamsplitter dicroico BrightLine</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td><td>dicroico</td></tr> <tr><td>a spaccoCombinatore di fasci LaserMUX, riflette 514.5, 532, & Laser da 543,5 nm, 25 mm</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>che combina</td></tr><tr><td>il filtro a fluorescenza dicroico Brightline 593/40</td> Filtro <td>di emissione Cy3</td><td>Semrock</td><td>FF01-593/40-25</td></tr><tr><td>Filtro passa-lungo EdgeBasic LWP da 635 nm, filtro</td> di emissione <td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td><td>Cy5</td>da 25 mm</tr><tr><td>EMCCD iXon+</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 telaio per microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X/1.49 Olio TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione tipo-F per microscopia a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 mm Diametro 45&deg; Obiettivo dell'asta rivestito in alluminio&nbsp;</td><td>Edmund optics</td><td>54-092</td><td>specchio in miniatura</td></tr><tr><td>1/4" corsa monoasse traslazione stadio</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>traslazione di specchio in miniatura</td></tr><tr><td>&Oslash; Doppietto acromatico da 1", ARC: 400-700 nm, f=200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>lente di messa a fuoco</td></tr><tr><td>Fessura meccanica regolabile</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dielettrico</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; Doppietto acromatico da 1", f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>obiettivo relè</td></tr><tr><td>Supporto per obiettivo per &Oslash; 1" Ottica</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Dicroico Supporto</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia Fissa Cubo Piattaforma</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>Supporto Cinematico per &Oslash; Ottica 1"</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Lente piano-convessa, &Oslash; 1", f = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>lente di collimazione</td></tr><tr><td>N-BK7 Lente piano-convessa, &Oslash; 6,0 mm, f = 15 mm</td><td>Lente telescopica Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 Lente piano-convessa, &Oslash; 6,0 mm, f = 150 mm</td><td>Obiettivo telescopico Thorlabs</td><td>LA1433-A</td><td></td></tr></tbody></table>

studiare looping dna a singola molecola fret

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Curvatura del DNA a doppia elica (dsDNA) è associato con molti importanti processi biologici quali il riconoscimento DNA-proteine ​​e confezionamento DNA in nucleosomi. Termodinamica di dsDNA curvatura è stata studiata da un metodo chiamato ciclizzazione che si basa sul DNA ligasi di unirsi covalentemente brevi estremità coesive di un dsDNA. Tuttavia, l&#39;efficienza legatura può essere influenzata da molti fattori che non sono legati a dsDNA loop come la struttura del DNA che circonda le estremità appiccicose uniti, e ligasi può anche influenzare il tasso looping apparente attraverso meccanismi quali il legame non specifico. Qui mostriamo come misurare dsDNA cinetica looping senza ligasi rilevando formazione transitoria ciclo DNA mediante FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). molecole di dsDNA sono costruiti utilizzando un protocollo basato su PCR semplice con un paio FRET e un linker biotina. La densità di probabilità loop noto come fattore J viene estratto dal prezzo loop e il tasso di ricottura tra due sezionatoreTed estremità appiccicose. Testando due dsDNAs con curvature diverse intrinseche, mostriamo che il fattore J è sensibile alla forma intrinseca del dsDNA.

Molecole di DNA utilizzati per lo studio loop consistono in una regione duplex di sequenza e lunghezza variabile e sporgenze a singolo filamento che sono complementari tra loro. Le sporgenze, che sono lunghe 7-base, possono ricombinarsi tra loro per acquisire lo stato in loop. Ogni sbalzo contiene sia Cy3 o Cy5 che è collegato nella spina dorsale del DNA attraverso la chimica amidite. Il Cy5-sporgenza è anche collegata con biotina-TEG (15-atomo Tetra-glicole etilenico distanziale) per l&#39;immobilizzazione di superfici...

Questo studio presenta una procedura sperimentale dettagliato per misurare le dinamiche di loop di DNA a doppio filamento con singola molecola Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Il protocollo descrive inoltre come estrarre il ciclo di densità di probabilità chiamato il fattore J.

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare come le dinamiche di looping del DNA a doppio filamento siano influenzate dalla forma intrinseca del DNA senza l'uso di proteine leganti il DNA. Ciò si ottiene incorporando molecole di colorante in frammenti di DNA a doppio filamento di diverse curvature in modo che il loop del DNA possa essere monitorato mediante risonanza di fluorescenza, trasferimento di energia o frequenza. Gli eventi reversibili di looping e unlooping dalle singole molecole di DNA possono quindi essere osservati mediante microscopia a riflessione interna totale.La velocità di looping del DNA può quindi essere estrapolata dalle traiettorie temporali della fluorescenza di ogni singola molecola. In definitiva, è possibile misurare la probabilità di looping del DNA in relazione alla forma intrinseca del frammento. Il vantaggio principale di questo saggio di DNA looping è che non si basa sulla proteina legante il DNA A, che potrebbe influenzare la cinetica di looping del DNA A.Il semplice protocollo consiste nell'utilizzare una tecnica chiamata fluorescenza, risonanza, trasferimento di energia e sintesi del DNA basata sulla PCR. Per misurare la prob

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