Discriminazione e caratterizzazione delle popolazioni eterocellulari con tecniche di imaging quantitative

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di valutare quantitativamente le risposte fenotipiche dinamiche delle popolazioni eterocellulari alle pertubazioni, discriminando tra le sottopopolazioni. La maggior parte delle interazioni fisiologiche avviene in presenza di più tipi di cellule. Questo metodo può aiutare i biologi cellulari a valutare come le cellule eterogenee rispondono a pressioni ambientali identiche e come quelle diverse si influenzano a vicenda.

Questa tecnica ha diversi vantaggi, discrimina tra più tipi di cellule, consente l'analisi simultanea su sottopopolazioni tra cui i tassi di natalità e mortalità e le dinamiche morfologiche. Sebbene questo protocollo possa essere utilizzato per studiare molti processi biologici, dimostreremo il flusso di lavoro utilizzando cellule tumorali H3255 e cellule di fibroblasti CCD19LU trattate con Erlotinib, un farmaco chemioterapico. Per iniziare, dopo aver preparato le sospensioni cellulari in provette secondo il protocollo di testo, capovolgere le provette per mescolare le cellule in soluzione per standardizzare la semina.

Quindi pipettare 10 microlitri di ciascuna sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 10 microlitri di blu di tripano. Pipettare 10 microlitri di soluzione in un vetrino per il conteggio delle cellule e inserire il vetrino in un contatore di cellule automatizzato. Ripetere il conteggio delle cellule almeno tre volte o fino a quando i conteggi ottenuti sono coerenti.

Utilizzando una pipetta multicanale, seminare un totale di 1.500 cellule in 100 microlitri di RPMI nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Piastra ogni sospensione cellulare in triplice copia con configurazioni di piastre identiche per ogni punto temporale. Incubare le cellule durante la notte.

Aggiungere DMSO a Erlotinib polvere per ottenere una soluzione madre di Erlotinib da 10 millimoleri. Quindi, utilizzare il terreno di coltura cellulare per diluire il farmaco a due volte la concentrazione finale più alta di 10 micromolari. Diluire in serie il farmaco quattro volte con un rapporto 1:10, per un totale di cinque concentrazioni di farmaco e un controllo senza farmaci.

Pipettare 100 microlitri di soluzione farmacologica nei pozzetti appropriati della piastra di cellule a 96 pozzetti per una concentrazione finale di farmaco di 1x diluito in terreno. Quindi, per colorare le cellule per la classificazione basata sulla fluorescenza, preparare cinque microgrammi per millilitro di colorante nucleare e cinque micromolari di colorazione di cellule morte in PBS. Per la classificazione basata sulla morfologia, preparare cinque microgrammi per millilitro di colorazione nucleare, cinque colorazioni di cellule morte micromolari e cinque colorazioni di cellule micromolari in PBS.

Aggiungere 20 microlitri di soluzione colorante in ogni pozzetto. Quindi, incubare i campioni a 37 gradi Celsius al riparo dalla luce per 30 minuti. Per acquisire le immagini, utilizzare etanolo al 70% per pulire il fondo della lastra e posizionare la lastra nella camera di imaging.

Nella scheda di configurazione sotto la selezione del canale, fare clic sul pulsante più per aggiungere i canali appropriati all'immagine. In Selezione layout, impostare una pila z di immagini di test ogni due micron, a partire da zero micron e terminando a 20 micron, per identificare il piano di messa a fuoco. Fare clic su snapshot, sotto ogni canale per valutare le intensità e ottimizzare i tempi di esposizione.

Immettere valori più alti o più bassi nel tempo in base alle esigenze. I nuclei nelle cellule devono essere a fuoco per garantire l'accuratezza dell'analisi a valle. Sullo schema della piastra, evidenziare i pozzetti appropriati.

Quindi, nello schema dei pozzetti, evidenziare i 25 campi da visualizzare in modo simile. In Esegui esperimento, identificare la lastra nel nome della lastra, quindi fare clic sul pulsante di avvio per eseguire il protocollo di acquisizione delle immagini con un obiettivo 10x per generare immagini TIFF in scala di grigi nei canali scelti. Dopo aver installato i software open source, CellProfiler e l'analisi CellProfiler, aprire CellProfiler, fare clic su File, Importa, Pipeline da file e selezionare il file appropriato.

Seleziona la pipeline di classificazione basata sulla fluorescenza per classificare le cellule come H3255 o CCD19LU in base all'intensità dell'EGFP e per calcolare le caratteristiche morfologiche. Fare clic su Visualizza impostazioni di output, quindi selezionare la posizione dei file immagine per l'analisi e la destinazione dei dati estratti. Prima di eseguire l'analisi, il protocollo deve essere testato in modalità test per verificare i valori dei parametri.

È importante che la segmentazione nucleare e cellulare sia accurata. Questo protocollo è stato progettato per identificare le cellule con colorazione variabile dei nuclei, garantire che il valore dei pixel di cui i nuclei vengono espansi sia abbastanza grande da mascherare i nuclei con la più alta colorazione di DNA, ma abbastanza piccolo da non mascherare i nuclei circostanti. Per classificare le popolazioni in base alla fluorescenza, in primo luogo, ridimensionare l'intervallo di intensità GFP, quindi misurare l'intensità GFP di ciascun nucleo identificato e classificare gli oggetti in base a una soglia definita dall'utente.

Quindi, fai clic su analizza immagini per iniziare l'analisi. Al termine dell'analisi, passare alla cartella di output predefinita per visualizzare i dati calcolati. Per la classificazione basata sulla morfologia, eseguire il protocollo appropriato nel profilatore cellulare per generare caratteristiche di morfologia dell'intera cellula.

Aprire il software Cell Profiler Analysis, selezionare il file delle proprietà del database generato in Cell Profiler e fare clic su Apri. Fai clic sulla scheda Classificatore in alto a sinistra dello schermo. Per richiamare immagini di celle casuali dall'esperimento, fai clic su Recupera, le immagini appariranno nella finestra non classificata.

Classificare manualmente le celle come positive o negative, che qui rappresentano H3255 o CCD19LU selezionando e trascinando le celle nel contenitore appropriato. Dopo aver classificato almeno 50 celle per sottopopolazione, fare clic su Train Classifier e quindi fare clic su Controlla stato di avanzamento. Infine, fare clic su Assegna un punteggio a tutto per generare una tabella con il conteggio delle celle per ogni sottopopolazione.

In una coltura eterocellulare a freddo di cellule tumorali H3255 e di fibroblasti CCD19LU, i nuclei sono stati identificati e segmentati in base alla colorazione del DNA. Le popolazioni cellulari sono state classificate mediante fluorescenza indotta artificialmente o addestrate in un algoritmo di apprendimento automatico per identificare i tipi di cellule in base alle differenze morfologiche. C'è un'elevata concordanza tra la fluorescenza e le metodologie basate sulla morfologia.

I due metodi di classificazione sono stati implicati in modo indipendente nelle stesse immagini e concordavano rispettivamente del 97,4% e del 92,5% sulle popolazioni non trattate e trattate. In questo studio sono stati studiati i cambiamenti nella morfologia cellulare e la risposta al trattamento con erlotinib. Dopo tre giorni di trattamento farmacologico, sono stati osservati una diminuzione dell'area dei nuclei e un aumento dell'area cellulare dalle cellule H3255.

Ciò era probabilmente dovuto alla morte cellulare. Per verificare se Erlotinib avesse un effetto citotossico o citostatico sulle cellule, le cellule morte sono state identificate sulla base della colorazione con ioduro di propidio. Sono stati osservati effetti sia citotossici che citostatici di Erlotinib sulle cellule H3255, con un aumento del numero di decessi e una diminuzione del numero di nascite dopo il trattamento farmacologico.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore non consecutive se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'interferenza RA o CRISPR, al fine di affrontare ulteriori domande che indagano la genomica funzionale. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia del cancro per esplorare l'influenza delle cellule stromali sulla progressione del tumore in diversi tipi di cancro.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare le risposte eterocellulari agli stimoli ambientali, in particolare come analizzare i dati di imaging basati sulla microscopia in modo ad alto rendimento.