Lingua elettronica Generazione di modelli continui di rilevazione delle analisi delle proteine

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di costruire una lingua elettronica basata su un approccio combinatorio ed eseguire l'imaging di superficie al plasma e la risonanza per l'analisi delle proteine. Ciò si ottiene utilizzando il lattosio e il lattosio solfato come elementi costitutivi e depositando le loro miscele sulla superficie d'oro di un prisma per l'autoassemblaggio per creare una serie di recettori cross-reattivi combinatori. Come seconda fase, viene applicata l'imaging al plasma e la risonanza, che monitora gli eventi di legame in tempo reale e produce immagini SPR e una serie di curve di legame cinetiche chiamate grammi del sensore.

Successivamente l'elaborazione dei dati viene eseguita sulla base dei grammi del sensore utilizzando un software di calcolo matematico al fine di creare un profilo di evoluzione continua 2D e un panorama di evoluzione continua 3D per ciascun campione, i risultati mostrano che la lingua elettronica è in grado di generare paesaggi di evoluzione continua 3D distinti per le comuni proteine purificate ed è efficiente per la loro discriminazione basata sul riconoscimento dei modelli. Questa tecnica presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi esistenti come la gnosi classica, elettronica e le lingue. In primo luogo, la preparazione dei recettori del canto è in gran parte semplificata.

Una grande varietà di recettori cross-reattivi può essere scelta mescolando un piccolo numero di molecole. In secondo luogo, grazie all'approccio combinatorio, i modelli di riconoscimento generati dalla nostra lingua elettronica possono essere considerati continui, in modo che i segnali anomali possano essere identificati più facilmente. Pertanto, è possibile ottenere un'analisi più affidabile per preparare l'array di recettori cross-reattivi combinatori.

Innanzitutto, pulire la superficie dorata del prisma 48 ore prima dell'uso con un detergente al plasma per tre minuti a una potenza di ossigeno del 75%, 25% di argon, 0,6 millibar e 40 watt. Quindi preparare 100 millilitri di soluzione tampone fosfato contenente il 10% di glicerolo o PBSG. L'aggiunta di glicerolo al PBS è molto importante per ridurre l'evaporazione del solvente e i cambiamenti nell'elemento costitutivo o nella concentrazione di BBB dopo la deposizione.

Quindi preparare le soluzioni madre di lattosio o il mattone uno e il lattosio solfato o il blocco due dalle soluzioni madre. Preparare 11 soluzioni pure e miscelate con rapporti compresi tra zero e 100% con incrementi del 10% e una concentrazione totale di 0,1 millimolari in PBSG, depositare otto goccioline di nanolitri di queste soluzioni pure e miscelate sulla superficie del prisma utilizzando uno spotter senza contatto in quadruplo duplicato per ogni rapporto con 44 punti in totale, posizionare il prisma all'interno di una capsula di Petri contenente un millilitro di acqua ultra pura e lasciarlo per una notte a temperatura ambiente per l'autoassemblaggio di BB one e BB two sulla superficie dorata qui riportata. Si presume che la composizione superficiale media nei monostrati misti autoassemblati rifletta la composizione della soluzione miscelata di deposizione.

Il giorno successivo, lavare accuratamente il prisma con acqua ultrapura prima di asciugarlo sotto un flusso di Argonne. Impostare l'incubatrice in cui il plasma di superficie e gli apparati di risonanza per immagini sono posizionati a 25 gradi Celsius per evitare variazioni dell'indice di rifrazione indotte dalla variazione di temperatura durante il rilevamento delle proteine. Inserire un prisma di risciacquo non funzionalizzato nella cella di flusso da 10 microlitri di polietere etere chetone collegata a una pompa a siringa controllata da computer, un desser e una valvola di iniezione a media pressione a sei vie.

Riempire il sistema di flusso con tampone in esecuzione di cumuli di gas appena filtrati. Rimuovere il prisma di risciacquo e inserire il prisma contenente l'array di recettori cross-reattivi combinatori nei cumuli di corsa della cella di flusso a una velocità di flusso di 100 microlitri al minuto. Con l'aiuto della telecamera CCD, rimuovere eventuali bolle d'aria presenti sulla superficie del prisma facendo passare il buffer di scorrimento.

Definisci rapidamente l'area di studio per ogni punto disegnando un cerchio con lo stesso diametro per l'area di interesse sulla base di un'immagine ben contrastata dell'array e, con l'aiuto del software integrato nel plasma di superficie e nel sistema di imaging di risonanza, traccia le curve del plasma, che rappresentano le curve di riflettività in funzione dell'angolo di incidenza per tutti i punti. Scegliere l'angolo di lavoro, che è la posizione in cui verranno registrate le curve cinetiche alla pendenza più alta delle curve di riflettività. Ruotare lo specchio di scansione per fissare l'angolo di lavoro selezionato per le misurazioni cinetiche.

Continuare a far scorrere cumuli attraverso il sistema di flusso fino a quando il segnale di riflettività per tutti i punti è stabile e costante. Quindi utilizzare una siringa per iniettare un millilitro di lectina di arachidi o una soluzione HL nel circuito del campione da 500 microlitri con la valvola di iniezione in posizione di carico con la portata impostata su 100 microlitri al minuto, mettere la valvola di iniezione in posizione di iniezione. Avvia le misurazioni cinetiche monitorando simultaneamente le variazioni di riflettività nel tempo su tutti i punti al termine dell'iniezione di proteine.

Sciacquare l'array con il tampone in esecuzione per otto minuti. Infine, iniettare un millilitro di 1%DS per rigenerare l'array. Ripetere la stessa procedura per le altre proteine dopo l'ingresso della soluzione proteica nella cella a flusso.

Il legame molecolare si verifica e induce uno spostamento delle curve del plasma e una variazione della riflessività. Il software di acquisizione delle immagini converte i valori di intensità della luce misurati in livelli di scala di grigi, fornendo immagini SPR e generando la variazione della riflettività rispetto al tempo fornendo grammi del sensore. Successivamente, utilizza un software di calcolo matematico per tracciare la riflettività alla fine di ogni iniezione di proteine rispetto al rapporto dei blocchi costitutivi per generare un profilo di evoluzione continua 2D per ciascun campione.

Infine, aggiungere il rapporto di blocco nei grammi del sensore per generare un modello di riconoscimento continuo dipendente dal tempo chiamato Un panorama di evoluzione continua 3D per ogni proteina per sondare la capacità della lingua elettronica per l'analisi delle proteine comuni, sono state utilizzate tre proteine, una mioglobina HL e un lisozima per ciascuna proteina. Un distinto profilo di evoluzione continua 2D è stato generato dalla lingua elettronica, come mostrato in 3D. Sono stati generati anche paesaggi a evoluzione continua per una mioglobina HL e lisozima.

La lingua elettronica è sensibile alle caratteristiche superficiali delle proteine, come la distribuzione di residui di aminoacidi idrofobi, neutri e carichi. I profili di evoluzione continua ottenuti dei paesaggi possono essere utilizzati come impronte digitali per un'efficiente discriminazione delle proteine e l'identificazione prospettica basata sul riconoscimento di modelli. Mentre si tenta questo approccio, è importante ricordarsi di seguire le procedure sperimentali ottimizzate e standardizzate al fine di garantire una buona riproducibilità della lingua elettronica.

Queste procedure includono la pulizia e la buona superficie del prisma, la scelta dell'angolo di lavoro per la risonanza al plasma di superficie e l'applicazione di una soluzione appropriata per rigenerare completamente il sistema per il riutilizzo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire la lingua elettronica basata sull'approccio COMBINATOR e sulla risonanza plasmatica SOFA per l'analisi delle proteine. Buona fortuna per i tuoi esperimenti.