Name: Veloce enzimatica Trattamento di proteine per MS rilevamento con un microreattore flusso-through (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Scopri la digestione enzimatica rapida delle proteine per la spettrometria di massa utilizzando un microreattore flow-through. Questo metodo veloce ed economico facilita l'identificazione proteica con ESI-MS.

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1. Preparazione del capillare microreattore <ol><li> Tagliare il diametro interno 100 micron (ID) x 360 micron di diametro esterno (OD) capillare ad una lunghezza di 7-8 cm, e 20 micron ID x 90 micron OD capillare per 3-5 cm con il coltello capillare di vetro; verifica al microscopio che entrambe le estremità capillari hanno un taglio netto, diritta, senza bave sporgenti. </li><li> Inserire il 20 um ID x 90 micron OD capillare in un&#39;estremità del 100 micron ID x 360 micron OD capillare, per una lunghezza di ~ 6 mm; in caso di necessità, osservare questa operazione al microscopio. </li><li> Applicare una piccola goccia di colla E6000 attorno alla giunzione dei 90 micron OD / 100 micron capillari ID con la fine di un Q-tip, e lasciare che la colla cura O / N a temperatura ambiente. </li><li> Tagliare il inserita 20 micron ID x 90 micron OD capillare ad una lunghezza di ~ 10-15 mm; questo sarà l&#39;emettitore Elettrospray. </li><li> Pre-tagliare il 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK e 1/16 &quot;PTFE vasca ODzione in pezzi di 4-5 cm di lunghezza; questi saranno i manicotti utilizzati nei sindacati capillari per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta del 100 micron ID x 360 micron OD capillare per un&#39;unione PEEK; usare un manicotto 1/32 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Inserire / serrare un pezzo di ~ 5 cm di lunghezza 1/16 &quot;tubo PTFE nella estremità opposta del raccordo. </li><li> Pesare ~ 4 mg di C18 (5 micron) particelle in un pre-pulito / secca 2 ml flacone di vetro; aggiungere 0,5 ml di isopropanolo, chiudere la fiala e disperdere il liquame nella vasca da bagno ultrasonicatore. </li><li> Prelevare con una siringa 250 microlitri di circa 200 pl liquami, inserire l&#39;ago della siringa nel &quot;tubo 1/16 PTFE dell&#39;unione PEEK, e dispensare lentamente l&#39;impasto in 100 micron ID x 360 micron OD capillare, osservare al microscopio come capillare riempie di particelle fino una lunghezza di 2-3 mm di imballaggio è realizzato; questo sarà il microreattore (Figura 1) il 20 μ.m ID capillare trattiene le particelle nel microreattore con un effetto Keystone. 15 </li><li> Risciacquare microreattore con ~ soluzione 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, e poi con soluzione ~ 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. preparazione di soluzioni campione Nota: Le operazioni che comportano la manipolazione di solventi organici e acidi e la preparazione della soluzione devono essere eseguite in una cappa aspirante. Indossare occhiali, guanti e indumenti protettivi. <ol><li> Risciacquare con CH 3 OH e asciugare alcune fiale di vetro (4 ml) e tubi di polipropilene (15 ml). </li><li> Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 9,8 ml H 2 O con 200 microlitri CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O con 5 ml di CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 4 ml di una soluzione acquosa acidificata (TFA 0,01% v / v) con l&#39;aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 4 ml di una soluzione organica acidificata (TFA 0,01% v / v) con l&#39;aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Pesare 16 mg di NH 4 HCO 3 con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml di H 2 O / CH 3 CN: soluzione (98 2 v / v) e disperdere per sonicazione; questo si traduce in una soluzione 50 mM di NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in tampone acquoso. </li><li> Pesare 5 mg di proteina standard (ad esempio, albumina di siero bovino, emoglobina α / β, citocromo C, anidrasi carbonica, α-2-HS-glicoproteina, etc.) con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml DI wateR e disperdere mediante ultrasuoni; questo genere si traduce in una soluzione ad elevata concentrazione di livello pM. </li><li> Preparare 1 ml di soluzione proteica (1-2 mM) diluendo la soluzione a concentrazione alto livello mM con un volume adeguato di NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare la soluzione di tripsina (5 mM) sciogliendo 20 mg sequenziamento grado tripsina in 170 microlitri NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; disperdere mediante ultrasuoni. </li></ol> 3. apparato sperimentale Nota: Il sistema LTQ-MS è dotato di una sorgente ESI modificato che comprende un XYZ stadi casa costruzione che abilita l&#39;interfacciamento dello spettrometro di massa a vari approcci ingresso campione. <ol><li> Scollegare il microreattore capillare dall&#39;unione PEEK e connettersi al PEEK Tee. </li><li> Inserire lunga ~ 2 centimetri di filo Pt nel braccio laterale del PEEK Tee; utilizzare un &quot;manicotto 1/32 PEEK per fornire un-Perdita di connessione e per isolare il filo Pt. </li><li> Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare all&#39;estremità opposta del PEEK Tee; usare un manicotto 1/32 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Fissare il Tee PEEK sul XYZ-stage e posizionare la ESI emettitore ~ ​​2 millimetri di distanza dal capillare di ingresso spettrometro di massa. </li><li> Collegare il filo Pt alla sorgente di alimentazione ESI dello spettrometro di massa. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta del capillare trasferimento del campione all&#39;unione di acciaio inossidabile; usare un manicotto 1/16 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Collegare un lungo 4-5 cm 1/16 &quot;tubo in teflon all&#39;estremità opposta del raccordo in acciaio inox e inserire l&#39;ago della siringa 250 microlitri nel tubo PTFE, accendere la pompa e impostare la portata al valore desiderato (ad esempio, 2 microlitri / min). </li><li> tandem Input parametri di acquisizione dati MS nel pacchetto software che controlla lo strumento un MSd salvare come file il metodo per preparare la messa a punto per l&#39;esecuzione di analisi; per il sistema LTQ-MS, utilizzare i parametri di analisi dipendenti seguenti dati: l&#39;esclusione dinamica abilitato per 180 sec con larghezza di massa esclusione ± 1,5 m / z; uno Stato membro scan seguito da uno zoom e MS 2 scansioni su i primi 5 picchi più intensi, zoom larghezza di scansione ± 5 m / z; dissociazione indotta da collisione (CID) parametri impostati in larghezza isolamento 3 m / z, energia di collisione normalizzato del 35%, l&#39;attivazione Q 0.25, e il tempo di attivazione di 30 msec. </li></ol> 4. Configurazione Microfluidic <ol><li> Preparare un dispositivo microfluidico in vetro o substrati polimerici; 16-18 il layout del dispositivo è fornito in Figura 2A, consistente in un microreattore (1) (0,13 mm Lunghezza larghezza x 2 mm x 50 micron di profondità) collegato ad un ingresso (2 ), uscita (3) e una porta laterale (4); i canali comunicanti per le manipolazioni fluidica sono ~110 micron di larghezza e ~ 50 micron in profondità; una struttura multicanale (5), costituito da ~ 1,5-2 micron profondo x 10 micron di larghezza x 100 micron lunghi microcanali posti 25 micron a parte, fungerà da filtro per trattenere le particelle nel microreattore. </li><li> Attiva connessioni fluido consegna al chip incollando connettori specializzati verso le luci di entrata, o escogitando un supporto polimerico che ospita raccordi per la consegna fluido (Figura 2B). 16 </li><li> Preparare una sospensione di particelle di C18 (5 micron), come descritto al punto 1.8; consegnare la sospensione al microreattore con una siringa utilizzando 1/16 &quot;tubo in teflon collegato alla porta lato di chip (4); chiudere la porta dopo il caricamento delle particelle con colla epossidica e la cura per 1 ora in stufa a 90 ° C 16. </li><li> Inserire un capillare (20 micron ID x 90 micron di lunghezza OD x 10 mm) nel porto di uscita, sigillare con la colla E6000, e lasciare che la cura O / N; questo diventerà l&#39;emettitore ESI ( <sTrong&gt; 6). </li><li> Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare alla porta di ingresso del circuito integrato (2); collegare l&#39;estremità opposta del capillare ad un microlitri siringa 250 e la pompa a siringa, come descritto in 3.6-3.7. </li><li> Collocare un leggero connettore PEEK Tee sulla linea di trasferimento del campione appena prima luce di ingresso (2) e inserire un filo di Pt sul braccio laterale della T, come descritto in 3.2; questo sarà l&#39;elettrodo ESI. </li><li> Fissare il dispositivo microfluidica sul palco XYZ con l&#39;emettitore ESI posizionato ~ 2 mm di distanza dal capillare spettrometro di massa in ingresso; preparare la MS per l&#39;analisi come descritto in 3.8. </li></ol> 5. Campione Caricamento, proteolitica Digestione e eluizione per MS Analysis Nota: Tutte le fasi di trasferimento soluzione / campione vengono eseguite con l&#39;ausilio di una pompa a siringa e dovrebbe consentire per alcuni minuti supplementari per completare, per compensare la dead-volumes associati alle linee di trasferimento da e per il microreattore; il tempo necessario dipenderà dalle portate coinvolti. <ol><li> Risciacquare microreattore e prepararla per analisi infondendo una soluzione acquosa di NH 4 HCO 3 (50 mM) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Caricare il campione di proteine ​​(1 pM) sul microreattore infondendo la soluzione campione a 2 microlitri / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Infondere la soluzione di tripsina (5 mM) sopra la proteina adsorbita sul microreattore a 2 microlitri / min per 1-3 min. </li><li> Quench il processo di digestione proteolitica risciacquando il microreattore con una soluzione acquosa acidificata di TFA (0,01% v / v) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Avviare eluendo la proteina digerire dal microreattore infondendo una soluzione organica acidificato di TFA (0,01%v / v) in H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) a 300 Nl / min. </li><li> Accendere il processo di acquisizione dei dati MS e la tensione ESI (~ 2.000 V); acquisire i dati MS utilizzando i parametri di acquisizione dati forniti al punto 3.8; osservare l&#39;eluizione dei peptidi trittico. </li></ol> 6. Elaborazione dati <ol><li> Elaborare i dati in tandem MS con un motore di ricerca compatibile con il formato di dati di MS crudo. <ol><li> Elaborare i file RAW LTQ-MS utilizzando un organismo specifico database di proteine ​​minimamente ridondante; caricare i dati grezzi nel motore di ricerca, impostare le tolleranze di massa genitore e ioni frammento di 2 e 1 Da rispettivamente, e utilizzare frammenti completamente solo triptici con un massimo di due perse spaccature per la ricerca; non consentono modifiche post-; fissare i tassi di rilevamento di alta e media fiducia falsi (FDR) a 1% e il 3%, rispettivamente, e non consentono modifiche post-traduzionali. </li></ol></li><li> Filtrare i dati per selezionare solo di alta fiduciapeptide corrisponde alle proteine ​​presenti nel database; valutare i risultati proteine ​​e livello peptide. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il microreattore descritto in questo lavoro fornisce un facile da implementare apparato sperimentale per mineralizzazione enzimatica delle proteine ​​per permettere l&#39;analisi MS e identificazione in meno di 30 min. I vantaggi di questo sistema, rispetto agli approcci convenzionali, comprendono semplicità, velocità, basso consumo di reagenti e bassi costi. In particolare, non vi è alcuna necessità di costosi perline tripsina immobilizzati e cartucce. La preparazione del microreattore capillare è semplice (Fig...

L&#39;identificazione e la caratterizzazione di proteine ​​purificate si ottiene spesso utilizzando tecniche MS. La proteina viene digerito con un enzima e dei suoi peptidi sono ulteriormente analizzato da MS utilizzando un semplice apparato sperimentale infusione. digestione proteolitica è necessaria per la generazione di piccoli frammenti peptidici che rientrano nel range di massa utile della maggior parte degli analizzatori MS, e che può essere facilmente frammentato attraverso bassa energia di collisione di dissociazione indotta per generare aminoacido informazioni sulla sequenza. Per proteine ​​isolate o semplici miscele proteiche, non vi è alcuna ulteriore necessità di separazione cromatografica dei peptidi prima della rivelazione MS. Una miscela di 25-50 peptidi può essere facilmente analizzato infondendo il campione con una pompa a siringa direttamente nella sorgente MS ioni. Lo spettrometro di massa può eseguire l&#39;analisi e confermare la sequenza di una proteina in un breve lasso di tempo. Con i moderni metodi di acquisizione dati, questo processo può essere realizzato well&#39;ambito pochi minuti o addirittura secondi. Il fattore limitante nel completare l&#39;intero processo in un breve lasso di tempo è la fase di digestione proteolitica. In genere, questa viene eseguita nell&#39;arco di alcune ore (o O / N), in soluzione, a 37 ° C, con substrato: rapporti di enzimi di (50-100): 1. Per ridurre il tempo di digestione enzimatica a minuti o secondi, microreattori enzima immobilizzato, in forma di reattori microfluidici o cartucce disponibili in commercio, sono stati descritti. 1-6 Tipicamente, l&#39;enzima è immobilizzato da covalente, non covalente / adsorbimento fisico, complesso formazione o incapsulamento, 3,6 la maggiore efficienza del processo enzimatico viene abilitato dalla grande superficie-volume e rapporti enzima-to-substrato. Ulteriori vantaggi di reattori immobilizzate comprendono la riduzione autolisi e interferenze da parte dell&#39;enzima in analisi MS, una migliore stabilità enzimatica e riutilizzabilità. Una varietà di approcci, utilizzando il vetro o dispositivi microfabbricate polimerici sono stati descritti,utilizzando enzimi immobilizzati su sfere magnetiche da interazioni antigene-anticorpo, 7,8 intrappolati nelle reti di nanoparticelle d&#39;oro, 9 incapsulato in titanio-allumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 o catturati attraverso Ni-NTA o His-Tag formazione del complesso. In alternativa 6 , sono stati sviluppati capillari aperti tubolari con enzimi immobilizzati, pure. 12 Inoltre, maggiore segmentazione proteolitica è stata dimostrata utilizzando controllata irradiazione a microonde 13 o tecnologia cicli di pressione assistita o pressione (PCT) per ridurre i tempi di reazione a 30-120 min. 14 Nonostante i molteplici vantaggi dei reattori enzima immobilizzato, i costi delle cartucce commerciali è alto, la disponibilità di dispositivi microfluidici per uso di routine è limitato, e l&#39;uso di tecnologie microonde o PCT risultati in necessità di strumentazione aggiuntiva. L&#39;obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo che circumveNTS questi svantaggi, e che può essere facilmente implementato in ogni laboratorio per potenziare ricercatori un approccio semplice ed efficace per l&#39;esecuzione di scissione enzimatica di proteine ​​in preparazione per l&#39;analisi MS in pochi minuti. Questo approccio si basa sull&#39;uso di idrofobici, C18-particelle che sono pre-caricate in un capillare o dispositivo microfluidica, e l&#39;adsorbimento della proteina (s) di interesse nelle particelle seguita da digestione enzimatica durante l&#39;infusione dell&#39;enzima sul letto impaccato e proteine ​​catturato (s). In questo approccio, il substrato viene immobilizzato attraverso interazioni non covalenti, e l&#39;enzima è infuso proteina immobilizzata. L&#39;efficienza proteolitica digestione viene aumentata dalle grandi superfici di particelle che espongono la proteina per la trasformazione enzimatica, distanze e tempi di diffusione da e verso la superficie delle particelle ridotta, migliorato trasferimento di massa, nessun legame covalente che possono influenzare l&#39;attività dell&#39;enzima, capacità rapidamente evaluate combinazioni di diversi enzimi, disponibilità, e multiplexing se il processo viene eseguito in un formato microfluidica. Questo approccio è dimostrato con l&#39;uso di una miscela di proteine ​​standard e tripsina-enzima più comunemente usato per la digestione proteolitica prima della rilevazione ESI-MS. Lo spettrometro di massa utilizzato per la rilevazione in questo studio era uno strumento lineare trappola quadrupolo (LTQ).

<table><tbody><tr><td>Trappola ionica ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>Lo spettrometro di massa LTQ viene utilizzato per l'acquisizione di dati MS tandem</td></tr><tr><td>Stadio XYZ</td><td>Newport</td><td>Parti multiple</td><td>Lo stadio XYZ costruito in casa viene utilizzato per adattare la sorgente commerciale LTQ nano-ESI per ricevere input da vari sistemi di erogazione del campione</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Ottica Edmund</td><td>G81-278</td><td>Il microscopio viene utilizzato per osservare il processo di impacchettamento del microreattore</td></tr><tr><td>Bilancia analitica/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>La bilancia viene utilizzata per pesare i campioni di proteine</td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>Il bagno sonico viene utilizzato per miscelare/omogeneizzare i campioni e disperdere il liquame di particelle C18</td></tr><tr><td>Pompa a siringa 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>La micropompa viene utilizzata per il caricamento, il risciacquo e l'eluizione del campione e dell'enzima su e dal microreattore capillare impaccato</td></tr><tr><td>Sistema di acqua ultrapura</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td><td>Il sistema idrico MilliQ viene utilizzato per preparare l'acqua deionizzata purificata</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1.000&nbsp; &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>Il pipettatore viene utilizzato per misurare piccoli volumi di soluzioni campione</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&nbsp; &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>Il pipettatore viene utilizzato per misurare piccoli volumi di soluzioni campione</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>Il pipettatore viene utilizzato per misurare piccoli volumi di soluzioni di campioni</td></tr><tr><td>Capillare di silice fusa (100 &; micro; m ID x 360 &micro; </td><td></td><td>TSP100375</td> Questo <td>capillare viene utilizzato per la fabbricazione del microreattore</td></tr><tr><td>Capillare in silice fusa (20&nbsp; &micro; m ID x 100 & micro; </td><td></td><td>TSP020090</td> Questo <td>capillare viene utilizzato per la fabbricazione dell'emettitore ESI</td></tr><tr><td>Capillare in silice fusa (50&nbsp; &micro; m ID x 360 &micro; </td><td></td><td>TSP050375</td> Questo <td>capillare viene utilizzato per trasferire i campioni e l'eluente dalla pompa a siringa al microreattore capillare</td></tr><tr><td>Mannaia capillare</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>Questo è uno strumento per il taglio di capillari di silice fusa alla lunghezza desiderata</td></tr><tr><td>Colla</td><td>Prodotti Eclettici</td><td>E6000 Craft</td><td>Questa colla viene utilizzata per fissare l'emettitore ESI nel microreattore capillare o nel chip microfluidico</td></tr><tr><td>Colla epossidica</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Questa colla viene utilizzata per sigillare il foro di ingresso microfluidico attraverso il quale vengono caricate le particelle C18</td></tr><tr><td>Particelle C18 a fase inversa (5&nbsp; &micro; m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Si tratta di particelle C18 su cui vengono adsorbite le proteine; le particelle sono state estratte da un 4&nbsp; mm x 20 cm Colonna LC C18 di Agilent</td></tr><tr><td>Siringa/vetro (250 &micro; l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>Le siringhe di vetro vengono utilizzate per caricare il liquame di particelle C18 nel microreattore capillare e per fornire il campione e gli eluenti al microreattore</td></tr><tr><td>Unione PEEK riducente interna (da 1/16" a 1/32")</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>Questo raccordo viene utilizzato per collegare il 250 &micro; l. siringa al microreattore per il caricamento del 5 &micro; M liquame di particelle</td></tr><tr><td>Raccordo in acciaio inossidabile (1/16")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>Il raccordo in acciaio inossidabile viene utilizzato per collegare l'ago della siringa in vetro al capillare per infusione</td></tr><tr><td>Connettore a T in PEEK per microvolume (1/32")</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>Il raccordo a T in Peek viene utilizzato per collegare il capillare di trasferimento del campione al microreattore capillare; sul suo braccio laterale, consente l'inserimento del cavo Pt</td></tr><tr><td>Connettore a T (peso leggero)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>Questo connettore a T viene utilizzato per applicare la tensione ESI al chip microfluidico attraverso la linea di trasferimento del campione</td></tr><tr><td>Filo Pt (0,404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>Il filo Pt fornisce il collegamento elettrico per la generazione ESI ed è collegato al tubo in PTFE dell'alimentatore ESI per spettrometro di massa</td></tr><tr><td>(1/16" OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>Il tubo in teflon viene utilizzato per consentire un collegamento a tenuta d'aria tra l'ago della siringa e il raccordo in acciaio inossidabile&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo in PEEK (0,015" ID x 1/16" OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>Il tubo in Peek viene utilizzato come manicotto per consentire un collegamento a tenuta d'aria tra il raccordo in acciaio inossidabile e il 50&nbsp; &micro; m Tubo in PEEK capillare di trasferimento ID</td></tr><tr><td>(0,015" ID x 1/32" OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>Il tubo in Peek viene utilizzato come manicotto per consentire un collegamento senza perdite tra i capillari in silice fusa e il Peek Tee</td></tr><tr><td>Tagliatubi in polimero tagliato pulito</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>Questo cutter viene utilizzato per pre-tagliare 1/16" e 1/32' Tubo in polimero Peek che viene utilizzato come manicotto per connessioni senza perdite in pezzi di ~4-5 cm di lunghezza</td></tr><tr><td>Fiala ambrata (2 ml)</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>Le fiale vengono utilizzate per preparare le soluzioni del campione e l'impasto di particelle C18</td></tr><tr><td>Flaconcino ambrato (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>I flaconi vengono utilizzati per preparare soluzioni campione</td></tr><tr><td>Tubo in polipropilene (15&nbsp; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>Le fiale sono utilizzate per preparare soluzioni tampone</td></tr><tr><td>Cilindro (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>Il cilindro è utilizzato per misurare i volumi di solvente</td></tr><tr><td>Cilindro (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>Il cilindro è utilizzato per misurare i volumi di solvente</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1.000 &; micro; l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>I puntali per pipette sono utilizzati per misurare piccoli volumi di soluzioni campione</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (100 &; micro; l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>I puntali per pipette sono utilizzati per misurare piccoli volumi di soluzioni campione</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (10 &; micro; l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>I puntali per pipette sono utilizzati per misurare piccoli volumi di soluzioni di campioni</td></tr><tr><td>Substrati di vetro</td><td></td><td>Nanofilm B270 corona bianca, 3" x 3"</td><td>Si tratta di substrati di vetro per la fabbricazione di microchip</td></tr><tr><td>Raccordo dado maschio (1/16")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>Questo raccordo viene utilizzato per collegare i capillari di trasferimento al chip microfluidico</td></tr><tr><td>Gruppo Nanoport</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>Questo raccordo viene utilizzato per collegare i capillari di trasferimento al chip microfluidico</td></tr><tr><td>Standard proteici</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, grado HPLC</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo, grado</td> <td>HPLCFisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo, grado HPLC</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado di sequenziamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

veloce enzimatica trattamento di proteine ​​per ms rilevamento con un microreattore flusso-through

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

La grande maggioranza di spettrometria di massa (MS) a base di metodi di analisi di proteine ​​implicano un&#39;attività digestione enzimatica prima della rivelazione, tipicamente con tripsina. Questo passo è necessario per la generazione di piccoli peptidi peso molecolare, generalmente con MW &lt;3000-4000 Da, che rientra nell&#39;intervallo di scansione effettiva della strumentazione di spettrometria di massa. protocolli convenzionali coinvolgono O / N digestione enzimatica a 37 ° C. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di una varietà di strategie, tipicamente coinvolge l&#39;uso di un microreattore con enzimi immobilizzati o di una serie di processi fisici complementari che riducono il tempo necessario per proteolitica digestione per alcuni minuti (per esempio, microonde o ad alta pressione). In questo lavoro, si descrive un approccio semplice e conveniente che può essere implementato in qualsiasi laboratorio per la realizzazione rapida digestione enzimatica di una proteina. La proteina (o miscela di proteine) è adsorbito sulla alta perf C18-bonded fase inversaormance particelle di silice cromatografia liquida (HPLC) precaricate in una colonna capillare, e tripsina in tampone acquoso viene infusa in particelle per un breve periodo di tempo. Per attivare il rilevamento on-line MS, i peptidi triptici vengono eluite con un sistema solvente con maggiore contenuto organico direttamente nella sorgente MS ioni. Questo approccio consente di evitare l&#39;uso di particelle ad alto prezzo degli enzimi immobilizzati e non richiede alcun aiuto per il completamento del processo. Protein digestione e l&#39;analisi del campione completo può essere realizzato in meno di ~ 3 min e ~ 30 minuti, rispettivamente.

Un risultato rappresentativo di un processo di digestione proteolitica eseguito contemporaneamente su una miscela di proteine, con le microreattori sopra descritti (figure 1 e 2), è fornita in Tabella 1. La tabella comprende le sequenze peptidiche uniche che identificano una proteina particolare, la croce punteggio correlazione (Xcorr) (ossia, un punteggio che caratterizza la qualità della partita sperimentale-to-teorico per lo spettro di massa ...

Viene presentato un protocollo rapido per la digestione proteolitica con un microreattore triptico a flusso continuo costruito internamente accoppiato a uno spettrometro di massa a ionizzazione elettrospray (ESI). Vengono descritti la fabbricazione del microreattore, la configurazione sperimentale e il processo di acquisizione dei dati.

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere la fabbricazione di un microricettore enzimatico a flusso continuo che esegue una rapida digestione enzimatica delle proteine, consentendo l'identificazione proteica mediante spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray. Il metodo può contribuire a illustrare la sequenza di aminoacidi di proteine isolate e purificate, supportando la caratterizzazione successiva della struttura e della funzione. Il principale vantaggio di questo protocollo è la rapidità, l'economicità e la facilità di integrazione in flussi di lavoro che utilizzano piattaforme microfabbricate.Per iniziare, utilizzare un taglia-capillari in vetro per tagliare il tubo capillare più grande a una lunghezza di sette-otto centimetri e quello più piccolo a una lunghezza di tre-cinque centimetri. Utilizzare un microscopio per verificare che entrambe le estremità dei capillari presentino un taglio pulito e dritto, senza bave o protuberanze. Inserire il capillare più piccolo di circa sei millimetri all'interno di un'estremità di quello più grande.Quindi, utilizzare un bastoncino di ovatta per applicare una piccola goccia di colla attorno alla giunzione dei capillari e lasciare polimerizzare la colla tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, tagliare il capillare inserito a una lunghezza di circa 10-15 millimetri. Questa estremità fungerà da emettitore per l'ionizzazione mediante elettrospruzzo.Inserire l'estremità opposta del capillare di diametro maggiore in un tubo PEEK da 1/32 di pollice, precedentemente tagliato a una lunghezza compresa tra quattro e cinque centimetri, e collegarlo a un raccordo PEEK. Successivamente, inserire e serrare un tratto da cinque centimetri di tubo PTFE da 1/16 nell'estremità opposta del raccordo. In un vial di vetro pulito e asciutto da due millilitri, pesare quattro milligrammi di particelle C18 e aggiungere poi 0,5 millilitri di isopropanolo.Chiudere il flaconcino. Collocarlo in un bagno a ultrasuoni e sottoporlo a sonificazione per disperdere uniformemente le particelle nella soluzione. Successivamente, utilizzare una siringa da 250 microlitri per aspirare 200 microlitri della sospensione C18.Inserire la siringa nel tubo in PTFE da 1/16 di pollice ed erogare lentamente la sospensione nel capillare grande. Osservare al microscopio mentre il capillare si riempie di particelle, fino a quando non si ottiene un impaccamento di particelle lungo due-tre millimetri. Il tubicino capillare più piccolo trattiene queste particelle nel microreattore grazie all'effetto chiave di volta.Infine, risciacquare il microreattore con 50 microlitri di una soluzione al 50-50 di acqua e acetonitrile, seguiti da 50 microlitri di una soluzione contenente 49 microlitri di acqua mescolati con un microlitro di acetonitrile. Scollegare il microreattore capillare dal raccordo PEEK e collegarlo a un T in PEEK. Inserire quindi un filo di platino lungo due centimetri, isolato con una guaina in PEEK da 1/32 di pollice, per ottenere un collegamento ermetico nel braccio laterale del T in PEEK.Collegare un capillare di trasferimento lungo mezzo metro all'estremità opposta del PEEK-T. Utilizzare un manicotto PEEK da 1/32 di pollice per ottenere un collegamento ermetico. Fissare il PEEK-T sullo stage XYZ.Posizionare l'emettitore a ionizzazione per elettrospray a circa due millimetri dall'ingresso capillare dello spettrometro di massa. Successivamente, collegare il filo di platino alla sorgente di alimentazione per la ionizzazione a elettrospray dello spettrometro di massa. Inoltre, collegare l'estremità opposta del capillare di trasferimento del campione all'unione in acciaio inossidabile, utilizzando un manicotto in PEEK da 1/16 di pollice per garantire un collegamento ermetico.Successivamente, collegare un pezzo di tubo in PTFE lungo quattro-cinque centimetri e di diametro 1/16 di pollice all'estremità opposta dell'unione in acciaio inossidabile. Inserire i parametri di acquisizione dati MS in tandem come descritto nel protocollo testuale allegato nel pacchetto software che controlla lo strumento MS. Salvare tali parametri come file di metodo per preparare l'allestimento all'esecuzione dell'analisi.Il sistema MS LTQ è dotato di una sorgente ESI modificata che include una piattaforma XYZ realizzata in laboratorio, che permette di collegare lo spettrometro di massa a diverse modalità di inserimento del campione. Caricare una siringa da 250 microlitri con una soluzione acquosa di bicarbonato 50 millimolare disciolto nel 2% di acetonitrile. Successivamente, collegare la siringa al microreattore e posizionarla sotto la pompa per siringa.Sciacquare il microreattore con due microlitri al minuto per cinque minuti, per prepararlo all'analisi. Successivamente, caricare il campione proteico di interesse in una siringa da 250 microlitri ed infondere la soluzione campione a due microlitri al minuto per cinque minuti. Poi, posizionare una siringa da 250 microlitri contenente una soluzione di tripsina da cinque micromolari sotto la pompa per siringa, ed infondere sulla proteina assorbita nel microreattore a due microlitri al minuto per uno-tre minuti.È fondamentale scongelare e preparare frescamente la soluzione di tripsina prima di ogni esperimento. Ciò garantirà che l'enzima proteolitico mantenga la propria attività e il pH operativo del microreattore, che è un pH di circa 8. Caricare un'altra siringa da 250 microlitri con una soluzione acquosa contenente 0%1% di acido trifluoroacetico aggiunto al 2% di acetonitrile.Utilizzare questa soluzione per arrestare il processo di digestione proteolitica, risciacquando il microreattore a due microlitri al minuto per cinque minuti. Successivamente, passare a una siringa riempita con acido trifluoroacetico 01% aggiunto ad acetonitrile al 50% e attivare il processo di acquisizione dati dello spettrometro di massa (MS) impostando la tensione di ionizzazione elettrospray a circa 2000 volt. Utilizzare la soluzione acidificata per iniziare l'eluzione del prodotto di digestione proteica dal microreattore a 300 nanolitri al minuto per 20-30 minuti.Acquisire i dati di spettrometria di massa utilizzando i parametri di acquisizione dati forniti nel protocollo testuale allegato. Elaborare i file grezzi LTQ MS utilizzando un database proteico minimamente ridondante, caricando innanzitutto i dati grezzi nel motore di ricerca. Successivamente, impostare le tolleranze di massa per gli ioni parentali e per gli ioni frammento rispettivamente a due e un dalton, e utilizzare soltanto frammenti totalmente triptici con fino a due scissioni mancate per la ricerca.Inoltre, impostare i tassi di scoperta falsa ad alta e media confidenza rispettivamente al 1% e al 3%, e non consentire modifiche post-traduzionali, a meno che non si stia cercando specificamente determinate modifiche. Infine, filtrare i dati per selezionare soltanto le corrispondenze peptidiche ad alta confidenza. Qui viene mostrato uno spettro di massa composto da peptidi tripsici generati da una miscela proteica sottoposta a proteolisi nel microreattore.Queste etichette rappresentano gli ioni peptidici triptici più intensi e forniscono la loro sequenza e l'identificatore proteico corrispondente. Questo microreattore consente un'allestimento sperimentale facile da implementare per eseguire la digestione enzimatica delle proteine e permette un'analisi e identificazione tramite spettrometria di massa in meno di 30 minuti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare che mantenere la pulizia delle provette e degli strumenti che vengono a contatto con le soluzioni è essenziale per evitare contaminazioni del campione.Seguendo questa procedura, altri metodi di acquisizione dati di spettrometria di massa possono essere utilizzati per ottenere una caratterizzazione più accurata dei peptidi generati e rispondere ad ulteriori domande relative alla struttura delle proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteomica per sviluppare protocolli più rapidi per l'analisi delle proteine ed esplorare lo sviluppo di nuove piattaforme microfaliche che consentano l'esplorazione ad alto rendimento di campioni biologici. Questa tecnica è limitata all'analisi di miscele proteiche relativamente semplici che generano da 25 a 50 peptidi.Questi peptidi possono essere analizzati mediante semplici esperimenti di infusione e non richiedono una separazione cromatografica liquida prima dell'analisi MS. Ricordare che lavorare con solventi organici può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come evitare fiamme libere, durante l'esecuzione di questa procedura.

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