Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere la fabbricazione di un microcoreattore triptico a flusso continuo che esegue una rapida digestione enzimatica delle proteine per consentire l'identificazione delle proteine con uno spettrometro di massa a ionizzazione elettrospray. Il metodo può aiutare a illustrare la sequenza amminoacidica delle proteine isolate e purificate per supportare la caratterizzazione a valle della struttura e della funzione. Il vantaggio principale di questo protocollo è che è veloce, economico e incline all'integrazione nei flussi di lavoro che utilizzano piattaforme microfabbricate.

Per iniziare, usa una mannaia capillare di vetro per tagliare il tubo capillare di vetro più grande a una lunghezza di sette-otto centimetri e quello più piccolo a una lunghezza di tre-cinque centimetri. Utilizzare un microscopio per verificare che entrambe le estremità dei capillari abbiano un taglio netto e dritto, senza sbavature sporgenti. Inserire il capillare più piccolo di circa sei millimetri in un'estremità di quello più grande.

Quindi, usa un cotton fioc per applicare una piccola goccia di colla attorno alla giunzione dei capillari e lascia che la colla si indurisca per una notte a temperatura ambiente. Quindi, tagliare il capillare inserito a una lunghezza di circa 10-15 millimetri. Questa estremità fungerà da emettitore di ionizzazione elettrospray.

Inserire l'estremità opposta del capillare di diametro maggiore in un tubo in PEEK da 1/32 di pollice che è stato pretagliato tra i quattro e i cinque centimetri di lunghezza e collegato a un raccordo in PEEK. Quindi, inserire e serrare il pezzo di tubo in PTFE da 1/16 lungo cinque centimetri nell'estremità opposta del raccordo. In una lima di vetro da due millilitri pulita e asciutta, pesare quattro milligrammi di particelle di C18 e poi aggiungere 0,5 millilitri di isopropanolo.

Chiudere il flaconcino. Metterlo nel bagno dell'ultrasuonatore e sonicare per disperdere uniformemente le particelle nella soluzione. Quindi, utilizzare una siringa da 250 microlitri per aspirare 200 microlitri di liquame C18.

Inserire la siringa nel tubo in PTFE da 1/16 di pollice ed erogare lentamente l'impasto nel grande capillare. Osservare al microscopio come il capillare si riempie di particelle, fino a raggiungere due o tre millimetri di impacchettamento delle particelle. Il tubo capillare più piccolo trattiene queste particelle nel microreattore attraverso un effetto trapezoidale.

Infine, sciacquare il microreattore con 50 microlitri di una soluzione da 50 a 50 di acqua e acetonitrile, seguiti da 50 microlitri di una soluzione contenente 49 microlitri di acqua, mescolata con un microlitro di acetonitrile. Scollegare il microreattore capillare dal bocchettone in PEEK e collegarlo a un PEEK-T. Quindi, inserire un filo di platino lungo due centimetri, isolato con un manicotto in PEEK da 1/32 di pollice per fornire un collegamento senza perdite nel braccio laterale del PEEK-T.

Collegare un capillare di trasferimento del campione lungo mezzo metro all'estremità opposta del PEEK-T. Utilizzare un manicotto in PEEK da 1/32 di pollice per fornire un collegamento senza perdite. Fissare il PEEK-T sul palco XYZ.

E posizionare l'emettitore di ionizzazione elettrospray a circa due millimetri di distanza dal capillare di ingresso dello spettrometro di massa. Quindi, collegare il filo di platino alla fonte di alimentazione a ionizzazione elettrospray dello spettrometro di massa. Inoltre, collegare l'estremità opposta del capillare di trasferimento del campione al raccordo in acciaio inossidabile, utilizzando un manicotto in PEEK da 1/16 di pollice per fornire un collegamento senza perdite.

Quindi, collegare un pezzo di tubo in PTFE lungo da quattro a cinque centimetri e lungo 1/16 di pollice all'estremità opposta del raccordo in acciaio inossidabile. Inserire i parametri di acquisizione dati MS tandem come descritto nel protocollo di testo allegato nel pacchetto software che controlla lo strumento MS. Salvateli come file di metodo per preparare l'impostazione per l'esecuzione dell'analisi.

Il sistema LTQ MS è dotato di una sorgente ESI modificata che include uno stadio XYZ costruito in casa, che consente l'interfacciamento dello spettrometro di massa con i vari approcci di input del campione. Caricare una siringa da 250 microlitri con una soluzione acquosa di bicarbonato da 50 millimolari disciolto nel 2% di acetonitrile. Quindi, collegare la siringa al microreattore e posizionarla sotto la pompa a siringa.

Sciacquare il microreattore e due microlitri al minuto per cinque minuti, per prepararlo all'analisi. Quindi, caricare il campione proteico di interesse in una siringa da 250 microlitri e infondere la soluzione del campione a due microlitri al minuto per cinque minuti. Quindi, posizionare una siringa da 250 microlitri caricata con una soluzione di tripsina a cinque micromolari sotto la pompa a siringa e infondere la proteina assorbita sul microreattore a due microlitri al minuto per uno o tre minuti.

È fondamentale scongelare e preparare la soluzione di tripsina prima di ogni esperimento. Ciò garantirà che l'enzima protolitico mantenga la sua attività e il suo pH operativo del microreattore, che è un pH di circa 8. Caricare un'altra siringa da 250 microlitri con una soluzione acquosa costituita dallo 0% 1% di acido trifluoroacetico aggiunto al 2% di acetonitrile.

Utilizzare questa soluzione per estinguere il processo di digestione proteolitica risciacquando il microreattore a due microlitri al minuto per cinque minuti. Quindi, passare a una siringa riempita con acido trifluoroacetico allo 01% aggiunto al 50% di acetonitrile e attivare il processo di acquisizione dati MS nella tensione di ionizzazione Electrospray a circa 2000 volt. Utilizzare la soluzione acidificata per iniziare a eluire il digestato proteico dal microreattore a 300 nanolitri al minuto per 20-30 minuti.

Acquisizione dei dati di spettrometria di massa utilizzando i parametri di acquisizione dati forniti nel protocollo di testo allegato. Elabora i file grezzi LTQ MS utilizzando un database di proteine minimamente ridondante caricando prima i dati grezzi nel motore di ricerca. Quindi, impostare le tolleranze di massa degli ioni genitore e del frammento rispettivamente su due e un dalton e utilizzare solo frammenti completamente triptici con un massimo di due scissioni mancanti per la ricerca.

Inoltre, impostare i tassi di falsa scoperta di confidenza alta e media rispettivamente all'1% e al 3% e non consentire modifiche post-traduzionali, a meno che non si cerchino specificamente modifiche particolari. Infine, filtrare i dati per selezionare solo le corrispondenze peptidiche ad alta confidenza. Qui è mostrato uno spettro di massa composto da peptidi triptici che sono stati generati da una miscela proteica che è stata sottoposta a proteolisi nel microreattore.

Queste etichette rappresentano gli ioni peptidi triptici più intensi e forniscono la loro sequenza e il corrispondente identificatore proteico. Questo microreattore fornisce un esperimento facile da implementare per l'esecuzione della digestione enzimatica delle proteine e consente un'analisi e un'identificazione di massa in meno di 30 minuti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che preservare la pulizia delle fiale e della strumentazione che entrano in contatto con le soluzioni è fondamentale per evitare la contaminazione del campione.

Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi di acquisizione dei dati di spettrometria di massa per consentire una migliore caratterizzazione dei peptidi generativi e rispondere a ulteriori domande relative alla struttura delle proteine. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della proteonomica per sviluppare protocolli più rapidi per l'analisi delle proteine ed esplorare lo sviluppo di nuove piattaforme microfasiche che consentono l'esplorazione ad alto rendimento di campioni biologici. Questa tecnica è limitata all'analisi di miscele proteiche piuttosto semplici che generano da 25 a 50 peptidi.

Questi peptidi possono essere analizzati mediante semplici esperimenti di infusione e non richiedono la separazione cromatografica liquida prima dell'analisi MS. Non dimenticare che lavorare con solventi organici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come evitare fiamme libere.