Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

La proteomica clinica è una nuova importante disciplina che promette la scoperta di biomarcatori che saranno utili per la diagnosi precoce e la prognosi della malattia. Qui riportiamo un nuovo metodo di microfluidica digitale o DMF che integra diverse fasi di lavorazione utilizzate nella proteomica clinica, tra cui l'estrazione delle proteine, la risolubilizzazione, la risolubilizzazione, la riduzione dell'alchilazione e la digestione enzimatica. Il DMF utilizza micro goccioline discrete di proteine campione su una serie di elettrodi e può essere eseguito a temperatura ambiente, consentendo l'analisi automatizzata parallela dei campioni.

Questa metodologia rappresenta un progresso significativo rispetto ai metodi convenzionali e ha il potenziale per essere un nuovo utile strumento nella proteomica clinica. Ciao, sono Steve Sche del Professore di Laboratorio Erin Wheeler presso il Dipartimento di Chimica e l'Istituto di Biomateriali e Ingegneria Biomedica dell'Università di Toronto. Ciao, sono Gabriel del Wheeler Lab dell'Università di Toronto.

E io sono Vivian Luke, anche lei del Wearer lab dell'Università di Toronto. Sono Erin Wheeler. Ho la fortuna di lavorare con Steve Mace e Vivian.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'elaborazione proteomica utilizzando la microfluidica digitale. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare proteine e campioni biologici. Quindi iniziamo.

Iniziare la procedura nella cappa aspirante pulendo i substrati di vetro in soluzione Piranha. Pur indossando una protezione adeguata, la soluzione piranha è composta da acido solforico concentrato tre a uno per il 30% di perossido di idrogeno. Quindi è necessario prestare attenzione mentre si lavora con esso.

Incubare i substrati di vetro in piranha per 10 minuti e dopo la pulizia, sciacquarli e deionizzarli o de-acqua e asciugare i substrati con azoto gassoso. Posizionare i substrati all'interno della camera di evaporazione a fascio di elettroni per la deposizione di cromo ad uno spessore di 250 nanometri. Rimuovere i substrati dalla camera una volta raggiunto questo spessore e risciacquare con isopropanolo, quindi asciugare su una piastra calda per cinque minuti a 115 gradi Celsius.

Adescare i substrati essiccati con esametilxilazina o HMDS mediante rivestimento di centrifuga a 30 secondi. Codice di rotazione a 3000 giri/min di nuovo con foto Shipley S 1811. Resiste utilizzando parametri identici.

Pre-cuocere il supporto direttamente su una piastra calda a 100 gradi Celsius al minuto. Quindi modellare il fotoresist mediante esposizione a radiazioni ultraviolette o UV per cinque secondi attraverso una maschera fotografica. Successivamente, sviluppare i substrati esposti ai raggi UV nello sviluppatore Shipley MF 3 21 Abbastanza per immergere il substrato per tre minuti dopo.

Sciacquare il substrato in acqua deionizzata. Cuocere direttamente su una piastra calda a 100 gradi Celsius per un minuto. Incidere il cromo esposto immergendo i substrati per 30 secondi in una quantità di mordenzatura al cromo sufficiente a coprirli completamente.

Sciacquare i substrati con acqua deionizzata e immergerli in uno sverniciatore Z 300 T quanto basta per immergere il substrato per 10 minuti. Per rimuovere il fotoresist rimanente. Sciacquare in acqua deionizzata e asciugare in azoto gassoso.

A seguito di questo deposito, da due a cinque micrometri di polimero isolante Paraline C.An sul substrato mediante deposizione chimica da vapore depositare 50 nanometri di Teflon AF per rendere la superficie idrofobica mediante rivestimento di spin una soluzione. 1% peso per peso in flora nervo FC 40 a 2000 giri/min per 60 secondi. Sul substrato.

Ripetere con ossido di indio e stagno o substrato di vetro ITO non passato per creare il montante della piastra superiore. Cuocere entrambi i substrati su una piastra calda a 160 gradi Celsius. 10 minuti per configurare il dispositivo microfluidico digitale.

Rimuovere i rivestimenti polimerici dai cuscinetti di contatto di un substrato inferiore raschiando con un bisturi. Accoppiare le piazzole esposte del substrato inferiore con connettori a 40 pin per accendere un computer con vista di laboratorio. Utilizziamo una scatola di controllo costruita in casa che contiene relè con segnali controllati da dpad.

La scatola di controllo del computer facilita il controllo da parte dell'utente sull'applicazione di segnali a 100 volt RMS per 18 kilohertz al dispositivo tramite i connettori a 40 pin. Accendi anche un generatore di funzioni e un amplificatore. Assemblare il dispositivo posizionando due pezzi di nastro biadesivo di 140 micrometri di spessore totale sui bordi del substrato inferiore.

Pipettare quattro microlitri di acqua deionizzata in uno dei serbatoi e racchiudere il dispositivo posizionando il vetrino di ossido di indio e stagno non modellato sulla parte superiore del dispositivo con il lato rivestito in teflon rivolto verso il basso. Collegare un connettore di terra alla corsa della piastra superiore. Il programma di inizializzazione creato in laboratorio per calibrare il controllo di feedback il dispositivo è ora pronto per gli esperimenti.

In questo protocollo, utilizzeremo l'albumina sierica bovina o BSA come campione proteico per dimostrare la nostra progettazione e utilizzo della microfluidica digitale. La BSA è diluita in tampone di lavoro o WB costituito da 100 millimolari tris HCL pH 7,8 con 0,08% di peso per volume di F1 27. Preparare un millilitro di ciascun campione e soluzione di reagente e indicare il serbatoio in cui verrà aggiunto.

Dopo la preparazione del reagente, rimuovere la piastra superiore dal dispositivo e pipettare quattro microlitri di soluzione nel serbatoio assegnato. Dopo aver riempito i serbatoi, riposizionare la piastra superiore sul dispositivo. Utilizzare il programma di visualizzazione lab interno per eseguire i seguenti passaggi.

Ricorda, l'interfaccia del computer consente all'utente di erogare circa 600 goccioline di nanolitri dai serbatoi e manipolare le goccioline sulla serie di elettrodi. Innanzitutto, erogare una gocciolina di proteina contenente il campione da R 1 e una gocciolina di precipitante da R 2. Unisci le due goccioline e lascia incubare la gocciolina combinata per cinque minuti in modo che le proteine precipitino sulla superficie.

Azionare il surnatante lontano dalla proteina precipitata nel serbatoio di scarto. R tre, per lavare la proteina precipitata, erogare tre goccioline di tampone di lavaggio da R quattro e guidarle attraverso la proteina precipitata e nel serbatoio di scarto. Lasciare asciugare il precipitato ed erogare una gocciolina di tampone risolubilizzante da R 5 sulla proteina.

Lasciare incubare il tampone per 20 minuti fino a quando il precipitato non si sarà sciolto. Quindi, erogare una gocciolina di agente riducente da R six e fonderla con la gocciolina del campione. Mescolare la gocciolina combinata azionandola su sei elettrodi in uno schema circolare.

Lasciare incubare la gocciolina per un'ora a temperatura ambiente. Erogare una goccia di agente alchilante da R seven e fonderla con la gocciolina del campione, quindi mescolare. Lasciare incubare la gocciolina per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.

Infine, erogare una goccia di tripsina da R otto e fonderla con la gocciolina del campione, quindi mescolare. Lasciare incubare la gocciolina per tre ore a 37 gradi Celsius in una capsula di Petri su una piastra calda. Per terminare la reazione, rimuovere la piastra superiore e spegnere la digestione mediante pipettaggio.

Puntare sei millilitri di acido tricloroacetico al 2,5% in acqua sulla gocciolina di reazione. Purificare il prodotto di reazione temprato aspirando la gocciolina del campione direttamente dalla piastra inferiore. Utilizzando una punta a cerniera C 18, secondo le istruzioni del produttore, i campioni possono ora essere diluiti secondo necessità e valutati mediante spettrometria di massa per identificare le proteine nel campione utilizzando questo sistema.

Seguite da quelle di spettrometria di massa, le proteine sono state identificate con punteggi di probabilità inferiori a una volta E rispetto a tre negativi, equivalenti a un intervallo di confidenza del 99,9% e a una copertura di sequenza di almeno il 30%. Oggi abbiamo mostrato come utilizziamo la microfluidica digitale per estrarre e processare le proteine in modo automatizzato. Questa metodologia fornisce una potenziale soluzione per la perdita e la contaminazione del campione durante l'isolamento e l'identificazione delle proteine.

Speriamo di applicare questo metodo in futuro ad altre applicazioni biologiche, inclusi i saggi immunologici e i saggi basati su cellule. Quando si fa questo tipo di esperimento, la cosa più importante è ricordarsi di goderselo. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.