Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare il rimodellamento del sistema lisosomiale terminale da parte di batteri intracellulari utilizzando nanoparticelle fluorescenti come traccianti. Ciò si ottiene seminando prima le cellule del tallone in un vetrino a otto pozzetti e incubandole durante la notte. Il secondo passo è infettare le cellule con salmonella e tarica.

Successivamente, viene eseguita una marcatura a inseguimento di impulsi delle cellule ospiti infette mediante incubazione con nanoparticelle di rumina BSA d'oro. Il passo finale consiste nell'osservare le alterazioni del sistema endosomiale della cellula ospite mediante microscopia confocale. Infine, la quantificazione della distribuzione intracellulare delle nanoparticelle viene eseguita utilizzando il pacchetto software MRS.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunomicroscopico, è che le cellule infette vengono analizzate con metodo, può fornire informazioni sullo stile di vita intracellulare della terica. Tuttavia, può essere applicato anche ad altri patogeni intracellulari come le specie Gaia, Ella Prolia o il micobatterio tubercolosi. Può anche essere applicato ad altri tipi di cellule ospiti come micro feh, linee cellulari o cellule primarie.

La sintesi di nanoparticelle d'oro a 10 nanometri o NPS richiede due soluzioni, la soluzione A e la soluzione B.To preparare la soluzione A, aggiungere due millilitri di cloruro d'oro acquoso all'1% in 160 millilitri di acqua milli Q. Preparare la soluzione B aggiungendo otto millilitri di citrato trisodico diidrato all'1% e 160 microlitri di acido tannico all'1% in 32 millilitri di acqua milli Q. Riscaldare le soluzioni A e B a 60 gradi Celsius e poi mescolarle mescolando.

Un colore blu scuro dovrebbe essere osservato immediatamente dopo circa 15 minuti. A questo punto la soluzione dovrebbe diventare di colore rosso. Riscaldare la soluzione a 95 gradi Celsius.

Tienilo a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffredda la soluzione a temperatura ambiente. Preparare il pezzo d'oro per il rivestimento e l'etichettatura aggiungendo 900 microlitri di MPS d'oro in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugando a 15.000 Gs per 30 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 900 microlitri di acqua MQ sterilizzata.

Aggiungere 100 microlitri di soluzione di A BSA e mescolare a vortice a 800 giri/min per 30 minuti. Rimuovere l'eccesso di BSA centrifugando il preparato a 15.000 G per 60 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere l'oro BSA NPS e 125 microlitri di PBS.

Aggiungere 12,5 microlitri di un molare di bicarbonato. La soluzione di R domino n idrossi CIN estere o NHS viene preparata in DMSO immediatamente prima. Utilizzare a 15 microlitri di soluzione R DOMINE N-H-S-D-M-S-O a 0,5 millilitri della sospensione d'oro BSA NP.

Incubare la reazione per due ore a temperatura ambiente mescolando a 800 giri/min ed evitando l'esposizione alla luce. Successivamente, purificare l'NPS di rumina BSA d'oro attraverso la dialisi contro PBS a quattro gradi Celsius con cinque cambi di tampone in un periodo da 36 a 48 ore dopo la purificazione, stabilizzare l'NPS aggiungendo 10 microlitri di B-S-A-P-B-S in ogni millilitro di nps di rumina BSA D'ORO per rimuovere la centrifuga di rumina BSA libera o rilasciata a 15, 000 GS per 16 minuti a quattro gradi Celsius. Resus sospendere il pellet in due milligrammi per millilitro di B-S-A-P-B-S dopo aver misurato la densità ottica a 520 nanometri o OD cinque 20.

Conservare l'oro BSA Rod Domine NPS a quattro gradi Celsius, evitando l'esposizione alla luce le cellule he a per questo esperimento esprimono permanentemente una proteina fluorescente verde taggata glicoproteina lisosomiale lampada uno GFP e sono coltivate in DMEM con il 10% di siero fetale di vitello a 37 gradi Celsius in un'atmosfera contenente il 5% di anidride carbonica seme le cellule a una densità di 50, 000 per pozzetto in un vetrino a camera a otto pozzetti e incubare durante la notte. Il batterio per infettare le cellule hela è l'agente patogeno gastrointestinale umano, salmonella e tarica. Per confronto, vengono utilizzati due ceppi mutanti.

Tutti e tre i ceppi ospitano un plasmide per l'espressione costitutiva di GFP potenziata e sono coltivati in brodo LB con gli antibiotici appropriati per mantenere i plasmidi per ciascun ceppo. Inoculare una singola colonia di batteri in tre millilitri di brodo LB con l'antibiotico appropriato e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius. In condizioni di agitazione per l'aerazione il giorno successivo, diluire ogni coltura da uno a 31 in brodo LB fresco e continuare a crescere per tre ore e mezza.

Per iniziare questa procedura, misurare l'OD 600 dei batteri di sottocoltura e diluire a un OD 600 di 0,2. In un millilitro di PBS, aggiungere quantità appropriate di batteri alle cellule hela nel vetrino della camera A 12 per ottenere una molteplicità di infezioni di 100. Incubare per 30 minuti nell'incubatore cellulare.

Lavare le cellule hela tre volte con PBS per rimuovere i batteri non internalizzati. Questo punto temporale è impostato come zero ora dopo l'infezione o zero ora pi greco. Aggiungere alle cellule 300 microlitri di terreno di coltura fresco contenente 100 microgrammi per millilitro di gentamicina e mantenere per un'ora.

Dopo un'ora. Sostituire il terreno con un terreno di imaging contenente 10 microgrammi per millilitro di gentamicina. Aggiungere l'oro BSA rumina NPS alle cellule hela per ottenere una concentrazione finale di OD cinque 20 di 0,1.

Incubare per un'ora dopo un'ora. Rimuovere il mezzo e lavare tre volte con PBS. Infine, aggiungere 300 microlitri di terreno di imaging fresco contenente il 10% di FCS e 10 microgrammi per millilitro di gentamicina.

Per il resto del tempo di incubazione, l'imaging ad alta risoluzione delle cellule in diversi punti temporali viene realizzato utilizzando un sistema di imaging confocale come una scansione laser confocale o un microscopio a disco rotante con una camera in ambiente umidificato, accendere il sistema di controllo della temperatura e attendere che sia stabile. Ottimizza le impostazioni di imaging come l'ingrandimento, la scansione, la velocità, la risoluzione e la dimensione del passo Z. Utilizzare le impostazioni di emissione di eccitazione appropriate per GFP e NPS di rumina BSA oro nei punti temporali indicati dopo l'infezione.

Montare il vetrino da camera A 12 contenente le cellule infette sul tavolino del microscopio e registrare le immagini per analizzare le immagini e studiare il rimodellamento del sistema endosomiale da parte della salmonella intracellulare. Utilizzare un software di analisi delle immagini. Aprire i dati facendo clic su Apri e scegliendo il file nella barra degli strumenti degli oggetti della vista di superamento.

Fare clic sull'icona per aggiungere un nuovo elemento di superficie. Per analizzare un'area di interesse o un ROI, selezionare Segmenta solo un'area di interesse, quindi fare clic su Avanti come canale di origine. Seleziona il canale tre.

Seleziona l'opzione liscia per impostare la levigatezza dell'area risultante. Definire un valore manualmente o accettare il valore generato automaticamente. Per la soglia.

Selezionare l'opzione di intensità assoluta per la regolazione della soglia. Selezionare l'opzione manuale e impostare un valore nell'area di visualizzazione. L'anteprima della soglia della superficie viene visualizzata in grigio.

Fare clic su Avanti nella scheda Classifica superfici. La superficie risultante può essere filtrata in base a vari criteri. Un filtro predefinito è il numero di fori a V maggiore di 10, è possibile includere anche altri filtri facendo clic su Aggiungi.

In questo esempio, il filtro di default viene utilizzato per completare la creazione della superficie. Fare clic su Fine nell'elenco degli oggetti. Deseleziona la casella relativa al volume dell'articolo.

Nell'area di visualizzazione viene visualizzata una nuova superficie creata. In rosso, esporta le statistiche in un file Excel facendo clic su Salva. Le NPS d'oro sintetizzate da questo protocollo erano di forma quasi sferica e di circa 10 nanometri di dimensione.

Il rivestimento BSA e l'etichettatura rho domine non hanno influenzato la loro morfologia o dimensione. Studiare il rimodellamento del sistema endosomiale cellulare ospite da parte della salmonella intracellulare. Le cellule Hela sono state fintamente infettate o infettate con salmonella wild type o due ceppi mutanti e inseguite a impulsi con oro a 10 nanometri.

BSA rod domino n piselli in cellule non infette, l'NPS uniformemente distribuito negli endosomi tardivi o lisosomi. Al contrario, l'NPS nelle cellule infette da salmonella wild type è stato in gran parte riorganizzato a otto ore dopo l'infezione. Si è formata una rete stabilizzata di filamenti o setacci indotti da salmonella e la maggior parte delle mp sono state trovate accumulate all'interno delle strutture tubolari.

I ceppi mutanti hanno mostrato comportamenti distinti a otto ore dopo l'infezione. Il ceppo mutante SSAV era confinato all'interno della salmonella contenente VAE o SCV. Sebbene non si siano formati setacci, la maggior parte dei mp era ancora localizzata in endosomi tardivi liberi o lisosomi per il sif.

Si è verificata una fuga di salmonella nel citoplasma da parte di un ceppo mutante e non è stata osservata alcuna associazione tra NPS e batteri. Quando è stata esaminata l'accessibilità del sistema lisosomiale terminale nelle varie fasi dell'infezione da salmonella, i risultati mostrano che in tutti i casi, la maggior parte delle NPS internalizzate si è accumulata nel SCV o nelle SIF Seguendo questa procedura. Altri metodi, trasmissione del collo microscopica, possono essere eseguiti.

Questo può rispondere a ulteriori domande come l'ultrastruttura o i compartimenti di membrana in alcune cellule ospiti nano infette. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le nanoparticelle fluorescenti. Questi possono essere utilizzati per etichettare i compartimenti hoster modificati dalla salmonella intracellulare.