Imaging con cellule vive del trasporto endocitico utilizzando nanocorpi funzionalizzati in cellule in coltura

Stiamo studiando il traffico endocitotico e retrogrado delle proteine transmembrana, così come i meccanismi che conferiscono il trasporto. Per indagare il traffico proteico dalla superficie cellulare, si usano tipicamente anticorpi convenzionali, ma potrebbero favorire il reticolamento e il targeting lisosomico. Per cominciare, ottieni una pellet di batteri Escherichia coli trasformata con VHH-mCherry.

Aggiungi 30 millilitri di buffer di legaggio a freddo ghiacciato contenente 20 millimolari imidazolo in PBS alla pellet delle cellule batteriche. Con una pipetta, sospezioni accuratamente il pellet pipettando su e giù. Trasferire la miscela sospesa in un tubo centrifuga da 50 millilitri etichettato.

Integrare le cellule risospese con 200 microgrammi per millilitro di lisozima, 20 microgrammi per millilitro di DNasi I, un millimolare cloruro di magnesio e un millimolare fenilmetilsulfonil fluoruro. Dopo aver incubato il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti, posizionalo su un rotatore estremo su estremo e prosegue l'incubazione a quattro gradi Celsius per un'ora. Successivamente, inserire direttamente una punta solida del sondatore da sei millimetri nella sospensione della cella.

Interrompere meccanicamente le cellule batteriche usando tre impulsi di sonicazione di un minuto al 40% di ampiezza e un ciclo di lavoro di un secondo acceso e uno spento. Permettendo un intervallo di raffreddamento di un minuto tra ogni impulso. Dopo la centrifugazione, mantenere il lisato liberato sul ghiaccio mentre si prepara alla cromatografia di affinità metallica immobilizzata utilizzando colonne di purificazione con tag preconfezionate e monouso, progettate per il funzionamento a flusso gravitazionale.

Fissare le colonne di acido nichel-nitrilotriacetico su un supporto metallico o su un supporto per colonne appropriato. Poi svuota completamente il buffer di stoccaggio dalla colonna. Bilanciare la colonna aggiungendo 10 millilitri di buffer di legame contenente 20 millimolari imidazoli in PBS.

Lascia che il buffer passi per gravità. Applicare gradualmente circa 30 millilitri del lisato batterico eliminato sulla colonna equilibrata. Lascia che passi per gravità e scarta il flusso.

Successivamente si lava la colonna applicando due volumi consecutivi da 10 millilitri di tampone di legame contenente 20 millimolari imidazolo in PBS. Eludi i nanocorpi legati applicando due millilitri di tampone di eluzione contenenti 500 millimolari imidazolo in PBS in un tubo microcentrifuga da due millilitri. Bilanciare una colonna di desalinizzazione inserita in un adattatore da tubo da 50 millilitri risciacquando cinque volte con cinque millilitri di PBS.

Lascia che il buffer entri completamente nella resina compatta, poi scarta il flusso attraverso. Dopo il risciacquo finale, centrifuga la colonna a 1000 x g per due minuti. Ora sposta la colonna con il suo adattatore su un nuovo tubo di raccolta da 50 millilitri dopo aver scartato il flusso attraversato.

Carica due millilitri del nanocorpo funzionale eluzionato sulla colonna di desalinizzazione pre-equilibrata. Poi centrifugare nuovamente a 1000 x g per due minuti per raccogliere l'eluato prima di verificare l'espressione e la purezza di VHH-mCherry. Lancia il software del sistema automatizzato di imaging delle cellule vive.

Trasferire la camera di microscopia ibidi sul palco del microscopio. Installare due canali di imaging utilizzando filtri di eccitazione ed emissione per EGFP e mCherry. Scegli un tempo di esposizione breve e un'intensità di illuminazione bassa per evitare lo sbiancamento fotografico.

Mantieni le impostazioni costanti per tutti gli esperimenti. Le impostazioni possono variare tra i giornalisti. Per ogni condizione, memorizza le coordinate di 10 diversi campi visivi contenenti da tre a quattro celle messe a fuoco in una lista di punti.

Poi cattura una singola istantanea di ogni posizione nella lista dei punti da utilizzare come immagine di riferimento prima di aggiungere VHH-mCherry. Per avviare l'endocitosi, aggiungere delicatamente 350 microlitri di soluzione VHH-mCherry preriscaldata in ciascun pozzo minimizzando il disturbo al monostrato. Poi procedi con l'acquisizione dell'immagine.

Eseguire un'acquisizione in time-lapse per 100 fotogrammi a intervalli di 32 mantenendo 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per analizzare l'assorbimento endocitotico di VHH-mCherry, carichi i set di immagini time-lapse nel software di analisi delle immagini. Applica strumenti di segmentazione e tracciamento per quantificare la fluorescenza interiorizzata nel tempo tra diverse regioni di interesse.

Tutte le varianti dei nanocorpi funzionalizzati sono state purificate ad alta resa e purezza, con solo il VHH-mCherry che ha mostrato una lieve degradazione proteolitica. I prodotti di degradazione di VHH-mCherry sono stati confermati come singoli domini VHH-mCherry utilizzando la rilevazione di immunoblot specifica per epitopi. In assenza di BirA, il VHH-mCherry è stato recuperato a circa 20 milligrammi per preparazione.

E la biotinilazione è stata confermata da pulldown di straptavidina agarosio di miscele di nanocorpi BSA. Le proteine di fusione contrassegnate con EGFP espresse nelle cellule HeLa hanno mostrato schemi di localizzazione subcellulari coerenti con i loro corrispettivi endogeni, inclusa la localizzazione perinucleare di EGFP-CDMPR ed EGFP-CIMPR. Localizzazione perinucleare esclusiva di EGFP-TGN46 e localizzazione periferica di TfR-EGFP.

VHH-mCherry ha permesso la visualizzazione delle cellule vive del trasporto endocitotico di EGFP-CDMPR, mostrando un aumento della colocalizzazione in 60 minuti. L'assorbimento di VHH-mCherry nelle cellule che esprimono EGFP-CDMPR ha raggiunto un plateau dopo circa 43 minuti, con un'emivita di nove minuti. Nelle cellule che esprimono TfR-EGFP, VHH-mCherry si è accumulata rapidamente intercellularmente con un tempo di dimezza di quattro minuti e una saturazione dopo 20 minuti.

Abbiamo sviluppato un versatile toolkit basato su nanocorpi per analizzare il trasporto di qualsiasi proteina transmembrana dalla superficie cellulare. Utilizziamo nanocorpi fluorescenti per marchiare le proteine di carico superficiali e poi ne studiamo il traffico endocitotico tramite microscopia a cellule vive. Con il nostro approccio di imaging di cellule vive basato su nanocorpi, vogliamo scoprire percorsi che guidano il trasporto merci dalla rete dalla superficie verso la rete trans-Golgi.