Name: Imaging con cellule vive del trasporto endocitico utilizzando nanocorpi funzionalizzati in cellule in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Scopri il trasporto endocitico in cellule HeLa utilizzando nanocorpi VHH-mCherry funzionalizzati e microscopia a cellule vive. Questo metodo consente di visualizzare e quantificare la dinamica delle proteine transmembrana.

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<table><tbody><tr><td>Anticorpi anti-GFP &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>Il prodotto è distribuito da Sigma-Aldrich, ma prodotto da Roche</td></tr><tr><td>Antamiche da 100 mm per coltura cellulare</td><td>TPP</td><td>TPP93100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-attina</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-HA</td><td>Dal laboratorio</td><td>Realizzato con 12CA5 ibridoma</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-His6</td><td>Laboratori Bethyl & nbsp;</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi anti-T7 &nbsp;</td><td>Laboratori Bethyl & nbsp;</td><td>A190-117A</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>disciolto in acqua sterile, il stock è 1 M</td></tr><tr><td>Carbenicillina sale disodico</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>disciolto in acqua sterile, il stock è 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Blu brillante)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>D-biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>sciolto in NaH2PO4 4 sterile o DMSO</td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione usa e getta PD10</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM GlutaMAX-I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, niente glutammina, niente fenolo rosso</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053028</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>disciolti in acqua sterile</td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfato salare tamponata (DPBS) senza Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S, PES, Porengr&ouml; &szlig; e: 0,45 & micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione FuGENE HD</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Copertine in vetro (n. 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>HRP anti-topo di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Il suo kit di protezione</td><td>Cytvia</td><td>11003400</td><td></td></tr><tr><td>Le sue colonne GraviTrap</td><td>Cytvia</td><td>11003399</td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 4 well, ibiTreat</td><td>80426-IBI</td><td>ibidi</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D-tiogalattiopiranoside (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>disciolto in acqua sterile, il stock è 1 M</td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>disciolto in acqua sterile, il stock è 100 mg/mL</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Il prodotto è distribuito da Sigma-Aldrich, ma prodotto da Roche</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>disciolto in acqua sterile, il stock è 1 M</td></tr><tr><td>Mini gel TGX proteici, 4-20%, 15-pozzi</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Kyoto modificata</td><td>Dal laboratorio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB5-alpha Competent&nbsp;E. coli</td><td>NEB</td><td>C2987U</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 preparativi</td><td>Macherey-Nagel &nbsp;</td><td>740412.1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Bioconcept&nbsp;</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsolsolfinilfluoro (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>disciolto in DMSO al 60% isopropanolo, stock in 500 mM</td></tr><tr><td>Linea cellulare Phoenix ampho</td><td>Laboratorio Nolan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polibrene (bromuro di esadimetrina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invivogen</td><td>ANT-PR-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio &nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>disciolto in acqua sterile, il stock è di 5 M</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Pack, mini</td><td>Bio-Rad</td><td>1704158</td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito &nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging con cellule vive del trasporto endocitico utilizzando nanocorpi funzionalizzati in cellule in coltura

Live-cell Imaging of Endocytic Transport using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Per studiare il traffico di proteine retrograde verso vari compartimenti intracellulari, abbiamo recentemente messo a punto uno strumento basato su nanocorpi anti-GFP per l'etichettatura e il tracciamento delle proteine di fusione ricombinanti dalla superficie cellulare17. Qui, descriviamo la produzione batterica di tali nanocorpi derivatizzati e dimostriamo la loro utilità nel monitoraggio dell'assorbimento endocitico mediante imaging di cellule vive. In combinazione con un reporter fluorescente residente nel Golgi, questo protocollo offre una solida piattaforma per studiare quantitativamente il trasporto retrogrado di proteine cargo selezionate alla rete trans-Golgi (TGN) in tempo reale.
Abbiamo generato una collezione di nanocorpi anti-GFP funzionalizzati distinti che condividono un'architettura modulare comune, utilizzando tecniche di clonaggio molecolare standard17. Sebbene l'attuale studio si concentri sulla variante fluorescente VHH-mCherry, includiamo anche ulteriori nanocorpi derivatizzati per illustrare la versatilità di questo set di strumenti ed evidenziare il loro potenziale per applicazioni future. Il nostro costrutto più elementare, VHH-std (std per standard), comprende il dominio VHH, gli epitopi T7 e HA per la rilevazione basata sugli anticorpi, un tag C-terminale esaistidina (His6) per la purificazione e una sequenza di peptide accettore di biotina (BAP) per consentire la biotinilazione enzimatica e i saggi di pulldown basati su streptavidina ad alta affinità (Figura 1A). Da questo progetto di base, sono stati sviluppati vari derivati di nanocorpi per facilitare lo studio del traffico endocitico e retrogrado attraverso l'analisi biochimica, l'imaging di cellule fisse e vive e la microscopia elettronica.
Per l'imaging del trasporto endocitico su cellule vive, abbiamo ingegnerizzato un nanocorpo fluorescente anti-GFP che incorpora un fluoroforo con spettri di eccitazione ed emissione distinti da quelli della GFP, garantendo così una separazione spettrale ottimale durante la microscopia a fluorescenza. Sulla base delle sue proprietà di ripiegamento superiori in E. coli indotta da IPTG e delle sue proprietà fotofisiche ben caratterizzate, abbiamo selezionato mCherry come tag fluorescente di scelta. Anche altri fluorofori spostati verso il rosso, come la proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP), sarebbero in linea di principio alternative adatte, ma mCherry si è dimostrato particolarmente robusto ed efficace in questo sistema.
Qual è il potenziale di altri nanocorpi funzionalizzati oltre a VHH-mCherry? Per studiare il traffico proteico dalla membrana plasmatica alla rete trans-Golgi (TGN), abbiamo sfruttato la localizzazione compartimentale specifica delle TPST, che risiedono esclusivamente nelle cisterne TGN e trans-Golgi. A tal fine, abbiamo modificato VHH-std con un motivo tandem di solfatazione tirosina (2xTS) derivato dalla proholecistochinina29 di ratto, consentendo così una lettura biochimica dell'arrivo del carico in questi compartimenti. Mentre la fusione di VHH-std con mCherry consente la visualizzazione diretta del trasporto retrogrado mediante imaging di cellule fisse o vive, la funzionalizzazione con perossidasi come APEX230 consente la localizzazione ultrastrutturale mediante microscopia elettronica, ablazione citochimica mirata o saggi di biotinilazione basati sulla prossimità. Inoltre, l'incorporazione di un sito di scissione della proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEV) nell'impalcatura del nanocorpo fornisce un mezzo biochimico per distinguere tra nanocorpi internalizzati e legati alla superficie (Figura 1A). In precedenza abbiamo impiegato il costrutto VHH-tev per monitorare la cinetica di riciclaggio di EGFP-CDMPR e TfR-EGFP17 legati a nanocorpi. La ricomparsa di recettori marcati con nanocorpi sulla superficie cellulare potrebbe essere facilmente rilevata applicando la proteasi TEV ricombinante per via extracellulare, con conseguente perdita specifica della cassetta dell'epitopo C-terminale del nanocorpo. Analogamente, l'inclusione di un sito di scissione TEV all'interno del nanocorpo VHH-mCherry qui presentato consente una valutazione dinamica del riciclo del reporter EGFP mediante imaging di cellule vive. La funzionalizzazione con domini proteici alternativi - come fluorofori aggiuntivi, tag enzimatici o motivi di sequenza per la modifica post-traduzionale - può essere facilmente realizzata subclonando gli inserti desiderati nella spina dorsale VHH-std dai siti di restrizione SpeI ed EcoRI. Tutti i costrutti di nanocorpi anti-GFP funzionalizzati utilizzati nello studio originale17 sono stati depositati con Addgene per la distribuzione pubblica.
Utilizzando il protocollo sopra descritto, tutte le varianti di nanocorpi qui illustrate sono state purificate ad alta resa e purezza (Figura 1B). Solo la fusione di mCherry ha mostrato un minore clipping proteolitico dei domini proteici dopo la purificazione (Figura 1B, corsia 5). I due prodotti di degradazione osservati corrispondono molto probabilmente ai singoli domini VHH e mCherry, come dedotto dai loro pesi molecolari apparenti e verificato dalla rilevazione di immunoblot specifici per epitopo (Figura 1C). In assenza di BirA co-espresso, VHH-mCherry si riprende tipicamente a rese di circa 20 mg per preparazione. Sulla base della nostra esperienza, la co-espressione di BirA riducecostantemente la resa dei nanocorpi di circa 1/3-1/2. La biotinilazione è stata abbastanza completa perché i nanocorpi di una miscela 1:1 con BSA sono stati completamente recuperati dalla streptavidina-agarosio (Figura 1D).
Per valutare l'idoneità di questo kit di strumenti di nanocorpi per lo studio del trasporto endocitico, abbiamo generato linee cellulari HeLa stabili che esprimono proteine del recettore di superficie marcate con EGFP con vie di traffico intracellulare distinte. Questi includevano il TfR, che passa dalla membrana plasmatica agli endosomi precoci (smistamento e riciclaggio); TGN46, che passa tra la membrana plasmatica e il TGN attraverso gli endosomi precoci; ed entrambi gli MPR, che fanno la spola tra il TGN, la membrana plasmatica e gli endosomi precoci e tardivi17. L'EGFP è stato fuso al dominio extracellulare di ciascun recettore - in particolare, inserito tra il peptide segnale e la sequenza recettoriale per CDMPR, CIMPR e TGN46 - e al C-terminale di TfR. Questo design ha preservato i domini citoplasmatici nativi, assicurando che tutti i segnali di smistamento noti rimanessero intatti e che il tag EGFP fosse accessibile per il legame da parte dei nanocorpi anti-GFP extracellulari (Figura 1E). Per la CIMPR, il cui dominio extracellulare è insolitamente grande, è stata utilizzata una versione tronca, coerentemente con studi precedenti che dimostravano che tale troncamento preserva il normale comportamento di traffico31,32.
Le linee cellulari stabili sono state stabilite mediante trasduzione retrovirale, seguita da smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per isolare popolazioni cellulari omogenee con livelli di espressione moderati e comparabili. Da notare che EGFP-CDMPR è apparso costantemente come una doppia banda negli immunoblots, simile alla sua controparte endogena33, indicativa di glicosilazione eterogenea. Per valutare se le proteine di fusione EGFP ricapitolano la localizzazione allo stato stazionario e i pattern di espressione delle proteine endogene, le cellule che esprimono stabilmente sono state co-coltivate con cellule HeLa parentali e analizzate mediante microscopia a fluorescenza confocale (Figura 2B). Il segnale EGFP rispecchiava fedelmente la distribuzione delle corrispondenti proteine endogene. Come previsto, CDMPR, CIMPR e le loro versioni marcate con EGFP sono localizzate prevalentemente nella regione perinucleare - riflettendo TGN e compartimenti endosomiali tardivi - con marcatura aggiuntiva negli endosomi periferici. Sia il TGN46 endogeno che quello marcato con EGFP sono stati trovati quasi esclusivamente nel TGN perinucleare, mentre TfR e TfR-EGFP hanno mostrato la caratteristica distribuzione precoce degli endosomi, con prominenti endosomi periferici di smistamento e riciclaggio perinucleare. Sebbene gli anticorpi utilizzati abbiano rilevato sia la forma endogena che quella marcata con EGFP (ad eccezione di CIMPR), l'intensità complessiva della colorazione non è risultata marcatamente aumentata nelle cellule che esprimono le proteine di fusione, suggerendo che i costrutti di EGFP non erano sostanzialmente sovraespressi. Abbiamo incluso EGFP-TGN46 e EGFP-CIMPR nella Figura 2B per un confronto diretto con EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. I protocolli utilizzati per la fissazione cellulare e l'imaging al microscopio a fluorescenza sono descritti in studi precedenti17,19.
Utilizzando VHH-mCherry, il trasporto endocitico delle proteine reporter marcate con EGFP può essere monitorato mediante imaging su cellule vive. Per questo, abbiamo usato come esempi cellule che esprimono EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. Le cellule sono state acquisite nel tempo con un microscopio fluorescente a campo largo invertito dopo l'aggiunta di VHH-mCherry al mezzo (Video 1 e Video 2). Nella Figura 3 sono mostrate le immagini fisse in vari punti temporali. L'assorbimento è stato quantificato misurando il segnale nel canale mCherry, sottraendo il fondo di autofluorescenza e normalizzando il segnale EGFP per eliminare le fluttuazioni dovute al movimento dei compartimenti marcati o a potenziali piccoli spostamenti nel piano focale. La fluorescenza di VHH-mCherry nel mezzo a 25 nM era trascurabile e non interferiva con le misurazioni. L'analisi del trasporto dei reporter dalla superficie cellulare ai loro compartimenti intracellulari, alla distribuzione allo stato stazionario, ha prodotto gli stessi risultati cinetici degli esperimenti biochimici mostrati nella Figura 2 della precedente pubblicazione17, con emivite apparenti di assorbimento di ~9 min per EGFP-CDMPR e ~4 min per TfR-EGFP, e saturazione dopo ~43 min e ~20 min, rispettivamente. Questi valori sono stati confrontabili con i valori ottenuti da esperimenti di captazione biochimica utilizzando saggi di immunoblotting17. In linea di principio, può essere analizzata anche la cinetica del trasporto retrogrado nelle regioni subcellulari di interesse, come la regione perinucleare con la più alta concentrazione di MPR. Tuttavia, la regione perinucleare contiene non solo Golgi/TGN, ma è anche arricchita in endosomi tardivi e endosomi di riciclo. La cinetica dell'assorbimento dei nanocorpi nella regione perinucleare non è sufficientemente specifica per analizzare il trasporto retrogrado verso un organello definito. Per valutare in modo più affidabile il trasporto tra membrana plasmatica e TGN, un'altra proteina fluorescente, una proteina transmembrana residente nel TGN, deve essere co-espressa stabilmente insieme alla proteina reporter GFP, in modo che non vi sia sovrapposizione spettrale delle proprietà del fluoroforo. L'utilizzo di questo marcatore aggiuntivo consente la rilevazione di VHH-mCherry importato dal reporter, analogamente alla solfatazione della tirosina mediata dai TPST, come precedentemente documentato19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig1.jpg"> 
Figura 1: Progettazione e produzione di nanocorpi derivatizzati per il tracciamento di proteine di superficie cellulare marcate con EGFP. (A) Panoramica schematica dei nanocorpi derivatizzati. Il costrutto standard del nanocorpo comprende un dominio VHH specifico per GFP, tag di epitopi T7 e HA, un peptide accettore di biotina (BAP) e un tag di esaistidina C-terminale (His6) per la purificazione. Ulteriori varianti di nanocorpi includono modifiche con siti tandem di solfatazione della tirosina (2xTS), la perossidasi ingegnerizzata APEX2 o la proteina fluorescente mCherry. La barra della scala indica la lunghezza dell'amminoacido (aa). (B) I nanocorpi espressi battericamente e purificati per affinità (20-50 μg) sono stati analizzati mediante gradiente SDS-PAGE e visualizzati mediante colorazione Coomassie. Gli standard di peso molecolare (in kDa) sono indicati a sinistra. Un piccolo clipping proteolitico è stato osservato solo per VHH-mCherry, probabilmente tra i domini VHH e mCherry. (C) Analisi immunoblot di preparati di nanocorpi (10 ng) utilizzando anticorpi diretti contro gli epitopi T7, HA oHis 6 , o rilevati da streptavidina-HRP (SA-HRP) per la valutazione della biotinilazione. (D) L'entità della biotinilazione dei nanocorpi è stata valutata incubando nanocorpi in un rapporto 1:1 con BSA, seguita da pulldown streptavidina-agarosio, pellettazione e lavaggio delle perle. Volumi uguali del surnatante (S) e del materiale legato a perline (B) sono stati successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e colorazione di Coomassie. Il recupero quantitativo del nanocorpo nella frazione legata alle perle indica una biotinilazione completa. La presenza di frammenti VHH e mCherry nella frazione legata suggerisce una degradazione parziale, che probabilmente si verifica durante la preparazione del campione per l'analisi SDS-PAGE. La linea bianca tra le corsie 2 e 3 indica la soppressione di due corsie non correlate. Questa cifra è stata modificata da17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig2.jpg"> 
Figura 2: Espressione e localizzazione intracellulare di recettori cargo marcati con EGFP marcati in fluorescenza. (A) Rappresentazione schematica dei costrutti di fusione di EGFP. Le sequenze derivate da proteine transmembrana secretorie sono rappresentate in nero, con peptidi segnale N-terminali e domini transmembrana interni evidenziati in giallo. La porzione EGFP è illustrata in verde. Sono stati generati costrutti a lunghezza intera per CDMPR, TfR e TGN46, mentre una variante troncata ben caratterizzata è stata utilizzata per CIMPR per preservare il normale comportamento di traffico. La barra della scala indica la lunghezza dell'amminoacido (aa). EGFP-CDMPR e TfR-EGFP sono stati descritti in precedenza17. (B) Per valutare la localizzazione subcellulare, le cellule HeLa che esprimono stabilmente le proteine di fusione EGFP sono state co-coltivate con cellule HeLa parentali e analizzate mediante microscopia a fluorescenza. La barra della scala rappresenta 10 μm. (C) Le cellule HeLa che esprimono stabilmente proteine reporter marcate con EGFP sono state lisate e gli estratti proteici sono stati sottoposti a SDS-PAGE seguito da immunoblotting utilizzando anticorpi contro GFP e actina. I marcatori di peso molecolare (in kDa) sono indicati a destra. Questa cifra è stata modificata da17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69284/69284fig3.jpg"> 
Figura 3: Imaging su cellule vive della cinetica di captazione endocitica dei nanocorpi mediata da EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. L'imaging su cellule vive è stato eseguito in seguito all'aggiunta di 25 nM di VHH-mCherry a cellule HeLa che esprimono stabilmente (A) EGFP-CDMPR o (B) TfR-EGFP in terreno completo privo di rosso fenolo a 37 °C. Le cellule sono state visualizzate nei canali GFP e mCherry utilizzando un microscopio a fluorescenza semiautomatico a campo largo a intervalli di 36 s. Vengono mostrate immagini fisse unite rappresentative, accompagnate da viste ingrandite della regione perinucleare (ingrandimento: 2,2x) nei singoli canali sottostanti. (Barre della scala, 10 μm.) Vedere anche Video 1 e Video 2. L'analisi quantitativa della cinetica di assorbimento dei nanocorpi in (C) EGFP-CDMPR e (D) TfR-EGFP è stata eseguita utilizzando i dati di tre esperimenti indipendenti, ciascuno dei quali ha catturato circa 40 singole cellule. Per tenere conto del movimento degli organelli e della variabilità del piano focale, l'intensità della fluorescenza di mCherry è stata normalizzata (norma) al segnale GFP e tracciata come media ± SD in tutte le cellule dei tre esperimenti. Il segnale medio di assorbimento massimo è stato normalizzato a 1. La cinetica di assorbimento per ciascuna cellula è stata adattata individualmente utilizzando un modello cinetico del primo ordine. Le linee tracciate rappresentano le curve medie derivate dalla media delle costanti di velocità corrispondenti. Questa cifra è stata modificata da17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/69284fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Imaging su cellule vive dell'assorbimento del nanocorpo mCherry da parte di EGFP-CDMPR. Le cellule HeLa che esprimono stabilmente EGFP-CDMPR sono state incubate a 37 °C in un terreno completo contenente 25 nM di VHH-mCherry e sottoposte a imaging in entrambi i canali di fluorescenza EGFP e mCherry a intervalli di 36 s. Il filmato è stato renderizzato a una velocità di riproduzione di 5 fotogrammi/s, corrispondente a una compressione in tempo reale di 3 minuti/s. Questo film è stato modificato da17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%201.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Imaging su cellule vive dell'assorbimento del nanocorpo mCherry da parte di TfR-EGFP. Le cellule HeLa che esprimono stabilmente TfR-EGFP sono state incubate a 37 °C in terreno completo integrato con 25 nM di VHH-mCherry e sottoposte a imaging per EGFP e fluorescenza mCherry a intervalli di 36 s. Il filmato è stato renderizzato a 5 fotogrammi/s, che rappresenta una velocità time-lapse di 3 minuti/s. Questo film è stato modificato da17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69284/MOVIE%202.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

Imaging con cellule vive del trasporto endocitico utilizzando nanocorpi funzionalizzati in cellule in coltura

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