Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla Aedes aegypti
30 dicembre 2014
Utilizzando due metodi per stimare l'espressione genica nei principali appendici gustative di Aedes aegypti, abbiamo individuato il set di geni putativamente sottostanti le risposte neuronali di composti amari e ripugnanti, come determinato da un esame elettrofisiologico.
L'obiettivo generale di questa procedura è osservare le risposte dei neuroni gustativi negli insetti e misurare l'espressione genica nei tessuti gustativi. Ciò si ottiene registrando prima le risposte di specifici peli gustativi a diversi gusti a diverse concentrazioni. Il secondo passo consiste nel sezionare attentamente i tessuti gustativi.
Quindi separare i campioni per sesso e appendice. Successivamente, isolare l'RNA totale da ciascun campione di tessuto e creare preparazioni di CD NA per il sequenziamento di nuova generazione e la QPCR. Il passo finale consiste nell'analizzare i dati di espressione genica e formulare ipotesi, come ad esempio il modo in cui i geni sensoriali espressi dalla chemio mediano le risposte fisiologiche ai sapori negli insetti.
In definitiva, le registrazioni elettrofisiologiche vengono utilizzate per mostrare la gamma ricettiva del sistema gustativo dell'insetto e il sequenziamento dell'RNA del tessuto gustativo viene utilizzato per evidenziare le componenti genetiche più importanti della ricezione gustativa. In generale, gli individui che non conoscono questi metodi avranno difficoltà a causa delle piccole dimensioni della chemioterapia degli insetti. Appendici sensoriali.
Che si tratti di sezionare o registrare da piccoli organi di insetti, la pratica nei pazienti è la chiave per padroneggiare queste tecniche. Per iniziare questa procedura, estrarre un elettrodo di registrazione a punta sottile in un estrattore per pipette con un capillare di vetro sotto il microscopio da dissezione. Rompere con cautela la punta dell'elettrodo in modo che la sua apertura sia abbastanza ampia da avvolgere il centum bersaglio, ma abbastanza piccola da evitare il contatto con le strutture vicine.
Quindi, anestetizzare da due a quattro insetti adulti nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per 20 secondi. Dopodiché, immobilizza uno degli insetti usando un vetrino coprioggetti con piccole strisce di nastro di cellophane. Al microscopio.
Identificare il senso bersaglio in base alla sua morfologia e posizione e orientare l'animale in modo da consentirne il libero accesso dall'angolo di ingresso dell'elettrodo. Quindi inserire un filo di tungsteno nel torace dorsale. Per fungere da elettrodo di terra, riempire l'elettrodo di vetro dalla punta con una soluzione stimolante di interesse.
Espellere le bolle d'aria tenendo la punta verso il basso. Inserire un filo d'argento nell'elettrodo che funga da elettrodo di registrazione e stimolazione. Successivamente, collegare gli elettrodi a un preamplificatore, che consente la riduzione del tempo di assestamento per catturare l'attività neuronale.
Il preamplificatore è collegato a un computer dotato di software di registrazione dei picchi per raccogliere, memorizzare e analizzare i segnali elettrici. Ora stimola il centum con una soluzione di controllo per garantirne la funzionalità. Conta i picchi a partire da 200 millisecondi dopo l'artefatto dello stimolo.
Per ottenere i risultati dose-risposta. Esporre il centum a concentrazioni crescenti della sostanza chimica sperimentale e lasciare intervalli minimi di tre minuti tra le stimolazioni per garantire un recupero adeguato. In questa procedura, preparare un refrigeratore poco profondo con ghiaccio secco.
Per le provette per la raccolta dei tessuti, etichettare le provette con tappo a scatto da 1,5 millilitri senza RNA per la raccolta di diversi tipi di tessuto. Tenere i tubi chiusi per evitare un'eccessiva formazione di condensa. Successivamente, anestetizzare da 30 a 40 zanzare nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per 15-30 secondi.
Quindi trasferire le zanzare anestetizzate in una fase fredda e ordinarle per sesso. Capovolgere gli insetti con la parte dorsale verso il basso afferrando le loro ali, facendo attenzione a non danneggiare le appendici gustative. Al microscopio da dissezione, sezionare l'etichetta accoppiata Bella o tarsi da maschi o femmine afferrando delicatamente la zanzara pro Bois appena vicino all'etichetta.
Bella con un paio di pinze per esporre lo stilo interno e rimuovere l'etichetta con l'altro paio di pinze. Quindi posizionare il tessuto nella provetta di raccolta a freddo per il tessuto tarsale. Afferrare delicatamente la zampa della zanzara all'incrocio tra la tibia e il primo segmento tarsale e rimuovere i tarsi.
Quindi posizionare il fazzoletto nella provetta etichettata a freddo. Centrifugare le provette di raccolta per un minuto in una centrifuga a zero gradi Celsius a 9.000 volte la gravità per mantenere il tessuto sul fondo della provetta. Se durante la dissezione si accumula umidità nelle provette di raccolta, aggiungere 50 microlitri di reagente triolo freddo per coprire e proteggere il tessuto raccolto.
Congelare le provette nel rack per provette da 1,5 millilitri contenente azoto liquido. Successivamente, prepara i pestelli privi di RNA ben aderenti raffreddandoli su ghiaccio secco prima della rottura dei tessuti. Quindi macinare il fazzoletto in polvere fine e ripetere ancora una volta.
Portare il volume totale del triolo a un millilitro e risus. Sospendi il tessuto macinato mediante vortici. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di cloroformio al tessuto macinato e mescolare accuratamente.
Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, farlo girare nella centrifuga a quattro gradi Celsius a 11.000 volte la gravità per 15 minuti. Aggiungere con cautela lo strato acquoso direttamente a una colonna filtrante del DNA genomico. Quindi farlo girare verso il basso a 11.000 volte la gravità per cinque minuti.
Aggiungere un volume uguale di RNA liberi al 70% di etanolo al flusso e mescolare mediante pipettaggio. Trasferire il liquido in una colonna di raccolta dell'RNA e continuare l'estrazione dell'RNA. Successivamente, quantificare e valutare la purezza dell'RNA totale su uno spettrofotometro di precisione e procedere con qualsiasi metodo standard di sequenziamento dell'RNA.
Le tracce di potenziali d'azione dell'illa gustativa E GTI di aide dimostrano l'efficacia della stimolazione diretta con la gamma di sostanze chimiche. Questa tecnica può essere utilizzata per quantificare le risposte a qualsiasi sostanza chimica stimolante contando i picchi di una data ampiezza e durata in un intervallo di tempo ragionevole inferiore a 500 millisecondi. Questi tre picchi corrispondono a tre sottotipi di neuroni sensoriali con sensibilità diverse.
Le repliche biologiche per i set di dati RNA-Seq possono essere limitate dal costo o dalla difficoltà della raccolta dei tessuti. Q-R-T-P-C-R offre la capacità di convalidare piccoli sottoinsiemi di espressione genica totale a costi inferiori e richiede meno fonti. L'RNA mostrato nel pannello di sinistra fianco a fianco è un confronto tra l'espressione relativa determinata da RN Aeq e l'espressione relativa determinata da Q-R-T-P-C-R.
Questi due metodi si basano su chimiche diverse per la stima dell'abbondanza genica. Le funzioni di equivalenza statistica visualizzate graficamente nel pannello di destra dimostrano i limiti di certezza in ogni caso. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sezionare il tessuto degli insetti per l'isolamento dell'RNA e registrare i segnali neurali dai peli gustativi degli insetti vivi.
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Panoramica
Questo studio analizza le risposte dei neuroni gustativi di Aedes aegypti a diversi sapori e misura l'espressione genica nei tessuti gustativi. Mediante l'impiego di tecniche elettrofisiologiche, la ricerca identifica geni associati alle risposte neuronali a composti amari e repellenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Entomologia
- Espressione genica
Sfondo
- Il sistema gustativo negli insetti svolge un ruolo fondamentale nella percezione del gusto.
- Aedes aegypti rappresenta un organismo modello per lo studio delle risposte sensoriali.
- Comprendere l'espressione genica può rivelare i meccanismi alla base della percezione del gusto.
- I metodi elettrofisiologici sono essenziali per misurare l'attività neuronale.
Scopo dello studio
- Osservare le risposte dei neuroni gustativi a diversi composti del gusto.
- Misurare l'espressione genica nei tessuti gustativi di Aedes aegypti.
- Formulare un'ipotesi su come i geni chemiosensoriali influenzino le risposte fisiologiche ai sapori.
Metodi Utilizzati
- Registrazione delle risposte dei peli gustativi a diversi sapori a varie concentrazioni.
- Dissezione dei tessuti gustativi e separazione dei campioni per sesso e ap pendice.
- Isolamento dell'RNA totale da ciascun campione di tessuto.
- Preparazione di preparazioni di cDNA per il sequenziamento di nuova generazione e QPCR.
Risultati principali
- Identificazione di geni associati alle risposte neuronali a composti amari.
- Approfondimenti sulla base genetica della percezione del gusto in Aedes aegypti.
- L'analisi dei dati sostiene ipotesi riguardanti le funzioni dei geni chemiosensoriali.
- I risultati elettrofisiologici si correlano con i dati sull'espressione genica.
Conclusioni
- Lo studio migliora la comprensione della funzione dei neuroni gustativi negli insetti.
- I risultati contribuiscono alla conoscenza più ampia della biologia sensoriale.
- Ricerche future potrebbero esplorare applicazioni nelle strategie di controllo dei parassiti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Comprendere la base molecolare della percezione chemosensoriale in vettori di malattie come Aedes aegypti permette la validazione di bersagli per lo sviluppo di nuovi repellenti. Il profilo elettrofisiologico e trascrittomico dei tessuti gustativi fornisce una riduzione del rischio meccanicistica collegando l'espressione genica a risultati comportamentali come l'interruzione della ricerca dell'ospite. Questo approccio integrato sostiene la fiducia predittiva nella selezione di composti che interferiscono con le vie sensoriali delle zanzare, orientando strategie di controllo dei vettori nelle fasi iniziali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Identifica i neuroni recettori del gusto responsivi al DEET e alla chinina, permettendo l'analisi dei percorsi sensoriali del gusto amaro nei vettori di malattie.
- Valore operativo: Fornisce un'osservazione fisiologica validata per lo screening di composti che modulano i neuroni chemiosensoriali delle zanzare.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Il sequenziamento dell'RNA di tessuti labellari e dei tarso rivela profili di espressione genica legati alla chemioricezione, supportando lo sviluppo di saggi allineati a biomarcatori.
- Valore operativo: La validazione mediante qRT-PCR garantisce riproducibilità e accuratezza quantitativa nei confronti incrociati dell'espressione genica tra piattaforme diverse.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega l'espressione genica chemiosensoriale alla percezione dei repellenti, consentendo lo screening basato su target per l'interruzione del comportamento di ricerca dell'ospite.
- Valore operativo: Il campionamento specifico per tessuto (tarso pro-, meso- e metatoracico) supporta modelli di screening scalabili e stratificati per sesso.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo collega la scoperta precoce di bersagli attraverso lo screening fenotipico alla validazione preclinica, mettendo in relazione l'attività neuronale con i bersagli molecolari nei tessuti chemosensoriali.
- Biologia della scoperta: Le registrazioni elettrofisiologiche permettono di verificare ipotesi sugli effetti dei composti sui tassi di scarica e sulla sensibilità dei neuroni gustativi.
- Screening: I risultati di RNA-seq e qRT-PCR forniscono letture quantitative standardizzate dell'espressione genica per la valutazione del legame al bersaglio.
- Analisi: Il conteggio degli impulsi e i test statistici di equivalenza consentono il confronto delle risposte neuronali e dell'espressione genica tra diverse condizioni e metodi.
- Ricerca traslazionale: La validazione dei geni chemiosensoriali supporta l'allineamento dei biomarcatori per prevedere l'efficacia dei repellenti in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Il flusso di lavoro combinato di elettrofisiologia e trascrittomica è riutilizzabile su diverse specie di insetti e librerie chimiche per ridurre i rischi associati ai bersagli nel controllo dei vettori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione del rischio meccanicistica dei bersagli repellenti attraverso la diretta correlazione tra attività neuronale ed espressione genica.
- Valore operativo: Protocolli standardizzati di dissezione del tessuto, isolamento dell'RNA e di elettrofisiologia garantiscono la riproducibilità tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Consente decisioni precoci di tipo go/no-go sui candidati repellenti, validando l'interazione con il bersaglio in tessuti chemiosensoriali rilevanti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione di composti aggiustata in base al rischio, che modulano specifiche vie recettoriali del gusto associate al comportamento di ricerca dell'ospite.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza in elettrofisiologia degli insetti e dissezione dei tessuti al microscopio per ottenere registrazioni affidabili dei peli gustativi.
- È necessario disporre di attrezzature libere da RNA, centrifughe e spettrofotometria per isolare RNA di alta qualità da piccoli campioni di tessuto.
- La standardizzazione tra i gruppi di lavoro richiede un'accurata determinazione del sesso del tessuto, la separazione degli ap pendici e il mantenimento della catena del freddo per prevenire il degrado dell'RNA.
- L'adattamento ad altre specie di zanzare o ad altri tessuti potrebbe richiedere un'ottimizzazione della posizione degli elettrodi e delle tecniche di dissezione a causa delle variazioni morfologiche.
- I limiti nel numero di repliche biologiche nell'analisi RNA-seq, dovuti alla scarsità di tessuto, possono essere attenuati mediante la validazione tramite qRT-PCR di bersagli chiave, come dimostrato nello studio.
