La tecnica infiltrazione-centrifugazione per l'estrazione di apoplastico fluido da foglie delle piante Utilizzo Phaseolus vulgaris Come un esempio

L'obiettivo di questa procedura è dimostrare l'estrazione di fluido aplastico dalle foglie delle piante utilizzando la tecnica della centrifugazione per infiltrazione. Ciò si ottiene immergendo prima una foglia nel fluido di infiltrazione e utilizzando le differenze di pressione generate utilizzando una siringa o una pompa a vuoto per infiltrarla completamente. Il secondo passo consiste nel preparare la foglia da centrifugare utilizzando un apparecchio di supporto.

Successivamente, la foglia viene centrifugata delicatamente per ottenere il fluido di lavaggio APO plast. Il passaggio finale consiste nel determinare il fattore di diluizione del plast APO e nel dosare la qualità del fluido di lavaggio dell'alast. In definitiva, il test di centrifugazione per infiltrazione viene utilizzato per ottenere campioni rappresentativi di APO plast che possono essere utilizzati per una varietà di analisi a valle.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti è che è semplice da ottimizzare per una varietà di tipi di foglie al fine di ottenere campioni superiori plus che hanno una contaminazione minima con composti citoplasmatici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campi come la fisiologia vegetale e le interazioni tra i microbi delle piante, dove è importante capire come la composizione degli APL varia tra le piante e cambia in diverse condizioni fisiologiche o stress. Come primo passo, prendi precauzioni di sicurezza indossando un camice da laboratorio, guanti e occhiali da laboratorio.

Successivamente, preparare un volume di acqua distillata in cui immergere il campione di foglia. Tieni pronta una lama di rasoio per raccogliere un campione in questo caso, una foglia della cultivar di fagiolo verde tenero. Posiziona la lama del rasoio contro l'animale domestico di una foglia e attacca la foglia dalla pianta.

Una volta raccolta, immergere la foglia appena asportata in acqua distillata per rimuovere i contaminanti della superficie fogliare. Quindi utilizzare un fazzoletto assorbente o carta per bloccare delicatamente l'asciugatura della foglia. Misurare il peso delle foglie prima di procedere con l'infiltrazione.

Questo aiuterà in seguito ad approssimare il volume di infiltrazione. Iniziare il processo di infiltrazione con una siringa da 60 millilitri. Con lo stantuffo rimosso, arrotolare e/o piegare con cautela la foglia nella siringa.

Quindi, riempire la siringa con liquido di infiltrazione. Qui viene utilizzata acqua distillata. Inserire lo stantuffo e capovolgere la siringa per espellere l'aria al suo interno.

Annota il colore delle foglie per un confronto successivo. Spostare lo stantuffo fino al segno di 40 millilitri usando un piccolo pezzo di para param. Coprire la punta della siringa.

Quindi tirare lo stantuffo fino al segno di 60 millilitri per creare una pressione negativa. Capovolgere la siringa per rilasciare le bolle d'aria dalla superficie fogliare. Riportare lentamente lo stantuffo nella posizione di partenza per circa due secondi.

Scoprire la punta della siringa ed espellere l'aria. Quindi coprire nuovamente la punta e premere sullo stantuffo per creare una modesta quantità di pressione positiva. Continuare ad applicare una pressione negativa espellendo aria e applicando una pressione positiva fino a quando l'anta non è completamente infiltrata.

La prova di un'infiltrazione completa è il colore scuro delle aree infiltrate. Una volta che questo è visibile, rimuovere la foglia dalla siringa. Bloccare delicatamente la foglia con carta assorbente per rimuovere il liquido superficiale.

Quindi misurare il peso della foglia infiltrata e un metodo di infiltrazione alternativo utilizza un pallone a vuoto. Ancora una volta, raccogli una foglia e sciacquala in acqua distillata. Dopo averlo asciugato, misurare il peso della foglia.

Procurarsi un pallone da arma laterale con una capacità minima di 250 millilitri. Mettere la foglia nel pallone e coprirlo con acqua distillata. Quindi, posizionare un tappo nel pallone e collegare una pompa a vuoto all'arma laterale.

Applicare un vuoto al pallone abbastanza a lungo da raggiungere una pressione. Circa 650 millimetri di mercurio. Agitare delicatamente il pallone per rilasciare le bolle d'aria dalla foglia mentre si è a pressione ridotta.

Quindi rilasciare con cautela e lentamente l'aspirapolvere nel corso di circa 10 secondi. Ripetere il processo di applicazione del vuoto, agitazione del pallone e rilascio del vuoto fino a quando la foglia non è completamente infiltrata. La prova di un'infiltrazione completa è il colore scuro delle aree infiltrate.

Rimuovere la foglia completamente infiltrata dal pallone e tamponare delicatamente la foglia con carta assorbente. Per rimuovere il liquido superficiale, misurare il peso della foglia infiltrata per consentire la determinazione del volume approssimativo di infiltrazione. Dopo che una foglia è stata completamente infiltrata, prepararla per la centrifugazione.

Stendere un pezzo di pellicola para larga quattro pollici. Posizionare la foglia sulla pellicola para. Quindi, utilizzando un puntale per pipetta da cinque millilitri, arrotolare la foglia nella pellicola para.

Prendere un corpo siringa da 20 millilitri con lo stantuffo rimosso e inserire la foglia arrotolata con la punta della pipetta. Posizionare i bordi delle foglie tagliati e rivolti verso l'estremità dello stantuffo. Procurarsi un tubo da 50 millilitri in polietilene o policarbonato e inserirvi la siringa.

Utilizzare una centrifuga con rotore a secchiello oscillante. Caricare la provetta contenente la foglia infiltrata e centrifugare a quattro gradi Celsius e 1000 G per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, esaminare la foglia per determinare se la maggior parte del fluido di infiltrazione è stata espulsa.

La provetta da centrifuga contiene ora il liquido di lavaggio APO plast recuperato, continuare pipettando il liquido di lavaggio alast recuperato in provette fresche da 1,5 millilitri. Posizionare i campioni di liquido di lavaggio APO plast nella centrifuga e centrifugare a 15.000 G per cinque minuti per rimuovere eventuali cellule o particolato. Dopo la centrifugazione, pipettare il supinato in provette fresche.

Conservare i campioni in ghiaccio fino a quando non possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius. Un metodo per valutare la qualità del fluido di lavaggio della piastra APO consiste nel calcolare il fattore di diluizione della piastra APO. Per fare ciò, preparare due volumi di acqua distillata del fluido di infiltrazione, in questo caso ciascuno sufficiente per diverse infiltrazioni ad un volume.

Aggiungere la polvere di indaco carminio fino a una concentrazione finale di 50 micromolari. Non aggiungere nulla all'altro. Ottenere una micropiastra da 96 pozzetti, riempire tre pozzetti con 200 microlitri di soluzione di infiltrazione.

Con indaco carminio, riempire altri tre con 200 microlitri della soluzione di infiltrazione non adulterata alla base della micropiastra nel lettore per misurare l'assorbanza di ciascun fluido. A 610 nanometri, l'assorbanza media per il fluido con indaco carminio meno l'assorbente medio per il fluido senza fornisce l'assorbanza corretta dell'infiltrato. Quindi, replicare il protocollo di infiltrazione fogliare tre volte per ciascuna delle soluzioni di infiltrazione.

Immergere un campione di foglie in acqua. Applicare una pressione negativa e positiva quando si utilizza la soluzione di infiltrazione indaco carminio, sciacquare le foglie in acqua distillata dopo l'infiltrazione per rimuovere eventuali residui di indaco carminio dalla superficie fogliare. Recuperare il liquido di lavaggio dell'alast mediante centrifugazione.

Dopo aver recuperato il liquido di lavaggio dell'alast, rimetterlo al lettore di piastre nei pozzetti della micropiastra. Collocati 200 microlitri di ciascuna delle estrazioni prive di indaco carminio, e anche 200 microlitri di ciascuna estrazione del liquido di lavaggio indaco carminio. Misurare l'assorbanza dei campioni a 610 nanometri per ottenere l'assorbanza corretta.

Fai la media di ogni serie di numeri e prendi la differenza. Utilizzare l'assorbanza corretta dell'infiltrato e l'assorbanza corretta del fluido di lavaggio aplastico per determinare il fattore di diluizione APL per ottenere stime delle concentrazioni o delle attività nel fluido aplastico. L'impiantatore moltiplica i valori di concentrazione o attività del liquido di lavaggio dell'alast per il fattore di diluizione estratto dal fluido di lavaggio dell'alast dalla cultivar fasi vulgaris.

Il verde tenero è stato utilizzato per produrre questa gascromatografia di acidi organici a spettro di massa. Gli zuccheri semplici e gli amminoacidi rappresentano la maggior parte dei metaboliti identificabili. Ecco un confronto tra la pagina SDS, i gel coloranti Kumasi di fasi vulgarus alast estratti di foglie fluide di lavaggio.

Le estrazioni differiscono per la quantità di contaminazione citoplasmatica. Questo si osserva come diverse quantità dell'enzima del gesso rubis. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di essere il più delicati possibile almeno per evitare di causare danni ai tessuti o contaminazione citoplasmatica Dopo questa procedura.

Altri metodi, come la spettrometria di massa di proteine o metaboliti, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti la composizione del fluido aplastico. Il liquido di lavaggio aplastico può anche essere utilizzato come mezzo grossolano per studiare l'effetto di sostanze chimiche aplastiche sui microrganismi che colonizzano i tessuti vegetali.