Name: Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Impara a derivare cellule staminali pluripotenti indotte umane senza fattori di riprogrammazione e a convertirle in condizioni cliniche di grado GMP partendo da fibroblasti dermici adulti.

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Vorremmo ringraziare Patrick C. Lee, Cyril Ramathal, e Saravanan Karumbayaram (SK) per la loro assistenza nell'esecuzione degli esperimenti di derivazione e caratterizzazione delle iPSC; Aaron Cooper per l'esecuzione degli esperimenti di analisi delle iPSC; Vittorio Sebastiano e Renee A. Reijo Pera per aver diretto gli sforzi iniziali di riprogrammazione; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack e Donald B. Kohn per aver diretto l'istituzione delle strutture GMP dell'UCLA che consentono la conversione e la caratterizzazione di iPSC di grado clinico; Gustavo Mostoslavsky per averci fornito il vettore di riprogrammazione policistronica STEMCCA. Questo lavoro si basa su una collaborazione di ricerca con Fibrocell Science e l'iniziativa CIDMOD (Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives) per generare terapie cellulari personalizzate e sicure. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti dell'Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research dell'UCLA, della Phelps Family Foundation, della Fibrocell Science, Inc. e dell'UCLA CTSI Scholar's Award to JAB.

NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata nel Awe et al 10.. 1. Riprogrammazione umano adulto Dermal fibroblasti con STEMCCA <ol><li> Fibroblasti dermici Thaw adulti umani (HUFS), di passaggio a 4 o inferiore, in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per 2 minuti, avendo cura di non immergere la parte superiore del flaconcino con l&#39;acqua. </li><li> Posizionare la poltiglia 1 ml di fibroblasti umani in una fiala conica 15 ml e posizionare lentamente 4 ml di supporti HUF standard preriscaldata a 37 ° C, in un modo goccia a goccia, per diluire le dimetil solfossido (DMSO) e risospendere le cellule. </li><li> Centrifugare la fiala a 200 xg per 10 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in un volume adeguato di media per creare una sospensione di 100.000 cellule / ml e aggiungere 2 ml in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, pre-rivestito per 20 minuti con 0,2% di gelatina. NOTA: Una sorella bene con un numero uguale di cellule per linea e condizione deve essere seminato for il conteggio delle cellule / molteplicità di infezione (MOI) di calcolo. </li><li> Oscillare la piastra di lato all&#39;altro e avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li> Il giorno di trasduzione, ottenere conta delle cellule (s) dalla sorella ben (s) circa 24 ore dopo la placcatura HUF iniziale. </li><li> Scongelare 2 x 10 8 TU, o, concentrato lentiviral equivalente (STEMCCA) e portare a 1 x 10 8 TU / ml in HUF media. </li><li> Trasdurre cellule con un rapporto di 10-MOI in HUF multimediale integrato con 8 mg / ml agente trasfezione. Mescolare pozzi trasdotte uniformemente e incubare una notte a 37 ° C, 5% CO 2 in un incubatore umidificato. </li><li> Circa 24 ore dopo la trasduzione lentivirale, passare i mezzi di HUF di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) medie standard. </li><li> Nei giorni 2 a 6, cambiare i media quotidiana di media PSC umana. </li><li> Il giorno 6, piatto due 0,2% di gelatina rivestite piatti da 10 cm di1,5-1,75 x 10 6 MEF derivati ​​da CF1 topi in HUF supporti 12. </li><li> Il giorno 7, facendo attenzione a non centrifugare più di 100 grammi, l&#39;uso della temperatura ambiente tripsina per sollevare la giornata 7 fibroblasti riprogrammate da un pozzetto della piastra sei bene e il passaggio ad un rapporto di 01:16, placcando tutte le cellule in modo uniforme tra due piastre 10 cm, con i media PSC umano fresco, che sono stati placcati con MEF il giorno prima. Distribuire aggregati di cellule in un movimento a spirale in senso orario e posto a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato notte. </li><li> Circa 48 ore dopo la semina le cellule riprogrammate sul MEF e ogni giorno dopo, cambiare fuori trascorsi supporti PSC umani con mezzi freschi. </li><li> Dopo 3 o 4 settimane, prendere le singole colonie con tipico ESC come la morfologia con un ago 21-gauge e subclone fuori in un 24-pozzetti stipulando circa 8 a 10 pezzi singoli di colonie specifiche nei singoli pozzetti in un 0,2% di gelatina rivestita 24 pozzetti pre-seeded con MEF derivate da topi CF1 a medio PSC umana. NOTA: Dopo l&#39;espansione delle colonie raccolte, le colonie devono essere caratterizzato come pluripotenti dalla formazione corpo embrioide e analisi di espressione di marcatori pluripotenza a livello proteico. </li></ol> 2. Vector Integrazione analisi in loco e STEMCCA Excision <ol><li> Analizzare il sito di integrazione STEMCCA da amplificazione lineare non restrittiva PCR come descritto 10. </li><li> Dopo saggiare per garantire una integrazione in una zona desiderata del genoma, STEMCCA accise aspirando il vecchio supporto ESC umana. Poi, unire 45 ml di virus adeno-Cre-PuroR concentrato con 8 mg / ml agente trasfezione in 3 ml di media PSC standard per la 24 ore. </li><li> Dopo il periodo di incubazione di 24 ore, aspirare il surnatante virale mista e lavare le cellule due volte con i media PSC umani. Inserire supporti PSC umani freschi insieme con 2 ug / ml puromicina per un periodo di 5 giorni, cambiando i media ingegno giornalierah mezzi freschi e antibiotici. </li><li> Dopo 5 giorni, subclone rimanendo colonie con un ago 21-gauge su 0,2% pozzi gelatina rivestite, in un 12-pozzetti pre-rivestito con MEF derivati ​​da CF1mice ed espandere come sopra. NOTA: Dopo l&#39;espansione sufficiente per ottenere un titolo congelato, è necessaria la conversione in condizioni di assenza di alimentazione. Aspettatevi almeno il 95% la morte colonia di cellule staminali, come la maggior parte delle cellule non saranno trasdotte con successo e si soccombere antibiotico nel periodo di 5 giorni di incubazione. Sebbene adeno-Cre-PuroR integra in un efficienza 0,001-1% in cromosomi di accoglienza delle cellule infette, reexposing un campione di colonie senza fattore di puromicina per assicurare la morte cellulare 100% confermerà nessuna integrazione è verificato 13. </li><li> Scongelare una fiala di pre-aliquotati matrice membrana basale su ghiaccio, per un periodo di circa 2 ore (raccomandazioni del produttore) finché la matrice è un liquido e diluire ad una concentrazione finale di 1:30 fredda mezzi basale. Coal numero desiderato di pozzetti in una piastra a sei pozzetti di 1 ml per pozzetto. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Cross-botola (con un ago calibro 18, o un bicchiere di plastica o &quot;punta&quot;), almeno 20 o 30 colonie da un pozzo in precedenza rivestito con MEF. Fare attenzione a ridurre MEF edificante e trasferire dalla piastra. <ol><li> Generare il dispositivo tratteggio attraverso un certo numero di approcci differenti, dal riscaldamento più complicato, tirando, e la finitura di una pipetta Pasteur di vetro su una fiamma libera, per il semplice utilizzo di una punta di plastica pipetta sterile o, come nel nostro caso, 21- e / o calibro 18 aghi. </li></ol></li><li> Aspirare la matrice dal rivestito ben dopo incubazione. </li><li> Togliere i pezzi delle colonie delicatamente raschiando dal vecchio piatto con una pipetta 200 microlitri e posizionare con cura in 3 ml di mezzi freschi combinate 1 nel piatto di matrice rivestita. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore umidificato. Cambia i media 48 ore dopo passaging. </li><li> Estratto DNA genomico da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore, a più del 80% di confluenza, con kit di estrazione del DNA commerciale. </li><li> Analizzare per una corretta asportazione con primer specifici per le integrazioni esogeni del lentivirus STEMCCA: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5&#39;-acgagcacaagctcacctct-3 &#39;; gDNA-hWPRE-reverse, 5&#39;-tcagcaaacacagtgcacacc-3 &#39;. Ricostituire primer liofilizzati con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 10 micron. </li><li> Eseguire una PCR con il seguente protocollo cinque fasi: denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 35 cicli di ciascuno dei seguenti: denaturazione a 98 ° C per 20 sec, ricottura di primer a 62 ° C per 15 sec, ed estensione a 72 ° C per 15 sec; seguito da un singolo ciclo di estensione finale a 72 ° C per 3 min. </li><li> Effettuare un gel di agarosio al 3% in peso su 1,5 g di agarosio e l&#39;immissione in 50 ml di tampone Tris-acetato 1x-EDTA. Forno a microonde fino agarosio è sciolto e posto in gel macchia DNA a pdiluizione Roper, mescolare e dispensare il volume corretto in cassette gel a solidificare per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Carico 12 ml di prodotto di PCR mescolato con 3 ml di colorante di caricamento in un gel di agarosio al 3%. Eseguire il gel per 30 minuti a 80 V. </li><li> Visualizza con luce ultravioletta per l&#39;assenza di una banda che indica il corretto escissione. </li></ol> 3. La quantificazione di differenze di espressione genica utilizzando PCR quantitativa di pre e post-hiPSCs asportati <ol><li> Estratto RNA totale da hiPSCs convertiti post- asportato e senza alimentatore utilizzando kit di estrazione RNA commerciali. </li><li> Reverse-trascrivere fino a 1 mg di RNA totale utilizzando kit commerciali in conformità con le istruzioni del produttore. Utilizzare ancorato-oligo (dT) 18 e primer esameriche casuali. NOTA: Assicurarsi che il protocollo PCR è su misura per le trascrizioni gene di più o di meno di 4 kb. Dovranno essere fatti per i qualsiasi gene STEMCCA originariamente integrato primer specificinto. </li><li> Ricostituire il primer liofilizzato con acqua PCR-grade ad una soluzione stock di 20 micron. </li><li> Utilizzare 5 ng di campione per 20 microlitri di reazione che consiste di sonda UPL 10 micron, 2x LightCycler 480 Sonde Maestro, e 20 micron avanti e indietro primer. </li></ol> 4. Conversione in condizioni GMP-grade <ol><li> Il primo giorno di transizione i hiPSCs post- asportato verso condizioni di GMP-grade, fare una miscela di mezzi composto da PSC umana combinata multimediali 1 (i media combinata 1) e di grado clinico buone pratiche di fabbricazione (GMP) di media compatibile (supporti combinate 2 ) ad un rapporto di 80:20. </li><li> Aspirare off i vecchi media combinato 1 e collocare 3 ml di nuovi media combinati 1 e 2, pre-riscaldato, al rapporto di 80:20. Cambiare i media al giorno per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno 4, rendere il supporto combinato 1 e 2 con un rapporto 50:50. Aspirare il vecchio media e soste con i media pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 al rapporto di 50:50. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno 7, rendere i media combinata 1 e 2 con un rapporto 20:80. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinati 1 e 2 al rapporto di 20:80. Cambiare i media per 3 giorni con questo rapporto specifico. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno 10, effettuare i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Aspirare il vecchio media e sostituirli con supporti pre-riscaldato, con i media combinata 1 e 2 a 0: rapporto di 100. Cambiare media ogni giorno a questo rapporto specifico. Le cellule sono ora in media liberi-xeno completamente definito. Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. NOTA: Durante l&#39;intero processo di conversione, è necessario passaging routine con un ago calibro 18 per mantenere la giusta dimensione delle colonie e la densità. Piano su passaging cellule ogni 4 o 5 giorni sulla base della dimensione delle colonie, confluenza, e differenziazione. </li><li> Coat un pozzetto in una piastra a sei pozzetti con un substrato senza xeno definito come raccomandato dal produttore. </li><li> Passaggio meccanicamente un confluente bene, già convertito in-Xeno gratuita condizioni di media, da una piastra di sei bene con un ago 18-gauge. È importante sottolineare che, posizionare nuovi media (supporti combinati 2) sulle cellule con un inibitore ROCK 1x per 1 ora, prima passaging pre-condizione di media. </li><li> Aspirare la soluzione substrato sintetico largo della nuova piastra che le cellule vengono trasferiti. Rimuovere tutti i supporti contenenti i grumi di cellule staminali dal vecchio piatto e trasferimento a nuova piastra. </li><li> Cellule posto di nuovo in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 2 giorni con il minimo disturbo fisico (idealmente piatti, una volta all&#39;interno dell&#39;incubatrice, non sono direttamente toccati in alcun modo) per una massima attaccamento. NOTA: Le cellule richiederanno cambiamenti di media al giorno. Passagin continuag ogni 4 giorni saranno importanti. Utilizzando un ago 21-gauge, passaggio solo le parti di colonie con ottima morfologia ESC-like (elevato rapporto nucleocytoplasmic). Ciò garantirà la selezione per le colonie hiPSC corretto che crescerà bene e alla fine produrranno colonie omogenee. Tempo complessivo di derivazione del CES come colonie è tra 15-20 giorni dopo il cambio di supporto iniziale combinato. </li><li> Congelare le hiPSCs post- asportato GMP-grade per primo tratteggio incrociato tutte le colonie utilizzando un ago calibro 18. Sollevare tutte le parti fuori utilizzando una pipetta 200 microlitri e trasferire tutti i supporti contenenti le cellule ad una fiala conica 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Mentre le cellule sono centrifugazione, fare un supporto congelamento costituito da volumi uguali di supporto combinato freddo 2 e congelamento media con una concentrazione finale di DMSO del 7,5%. </li><li> Dopo le cellule sono pellettizzati, aspirare off vecchia medio e goccia a goccia risospendere il pellet con i media di congelamento. Immediatamente transfer di fiale congelamento e mettere in un -80 ° C freezer. </li></ol> 5. hiPSCs Characterizing GMP-grade Post-asportati <ol><li> Per garantire una corretta espressione dei marcatori pluripotenza post-conversione, utilizzare QPCR per quantificare l&#39;espressione di marcatori pluripotenza chiave (SOX2, OCT4, e Nanog) utilizzando i primer elencati nella tabella 1 con la stessa procedura di cui al punto 3. metodologie QPCR seguire la stessi passaggi elencati al punto 3. </li><li> Utilizzare citometria a flusso per rilevare l&#39;acido non umano sialico Neu5Gc (N acido -glycolylneuraminic) in base a condizioni standard elencati nel kit come precedentemente pubblicato 10. </li><li> Lavare delicatamente le piastre di coltura cellulare con cellule utilizzando PBS 1x (PBS). </li><li> Dissociate colonie utilizzando 1x reagente di dissociazione per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Durante il tempo di incubazione di 5 minuti di passo 5.4, preparare la soluzione di blocco (disponibile inkit) facendo un 0,5% agente di blocco in ghiacciata PBS. </li><li> Etichettare la seguente serie di tubi per citometria a flusso di analisi: senza macchia; 4 &#39;, 6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) DAPI; Controllo anticorpo 1: 200; Anticorpo primario 1: 200; Anticorpo secondario 1: 200 Donkey Anti-Pollo IgG (H + L); MEF campione; Cellule post-asportato esempio a matrice; e celle su supporto sintetico Campione post-asportato. </li><li> Scuotendo leggermente aggregati di cellule dal punto 5.4 con l&#39;aggiunta di 2 ml di soluzione bloccante e trasferire il contenuto di un tubo da 15 ml. Centrifugare a 80 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte con soluzione bloccante e centrifugare come indicato al punto 5.7. </li><li> Delicatamente risospendere circa 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri di soluzione bloccante con il corrispondente volume di diluizione di ciascun anticorpo. Incubare con dolce dondolo a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Ripetere lava tre volte al punto 5.8. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 400 ml di diluente Buffer (dal kit) con 1: 100 di DAPI per tubi 2, 6, 7, e 8 come elencato passo 5.6. </li><li> Cellule filtrare con un colino 40 micron e attraversano citofluorimetro. </li></ol>

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James A. Byrne (JAB) e Agustin Vega-Crespo ricevono finanziamenti per la ricerca da Fibrocell Science, Inc. JAB è un consulente scientifico per Fibrocell Science, Inc. Nessun altro autore ha interessi concorrenti da rivelare.

Descriviamo una metodologia di derivazione hiPSCs senza fattore e renderli clinicamente rilevante convertendo queste cellule in condizioni GMP-grade per la differenziazione delle cellule a valle in future terapie umane. Sebbene questo protocollo è ampiamente applicabile ad una varietà di tipi cellulari, abbiamo scelto di riprogrammare fibroblasti dermici umani, a causa della facilità di estrazione dal paziente e la loro applicabilità alle terapie umane personalizzati. Una volta che le limitazioni sono state sanate, per ...

Le cellule umane adulte hanno dimostrato di essere in grado di subire rimodellamento e riprogrammazione epigenetica, come risultato dell'espressione lentivirale di quattro fattori di trascrizione chiave4,5. Un importante progresso nel campo della riprogrammazione è stato l'uso di una singola cassetta di cellule staminali lentivirali essociabili (STEMCCA), che ospitava tutti e quattro i fattori di trascrizione di riprogrammazione che consentivano un preciso rapporto stechiometrico di espressione proteica6. Inoltre, quando trasdotta in una specifica molteplicità di intervalli di infezione, STEMCCA può portare a eventi di integrazione genomica prevalentemente singoli durante il processo di riprogrammazione7. L'introduzione di una versione accisabile di STEMCCA, che utilizza la tecnologia Cre/loxP seguita dall'escissione del vettore di riprogrammazione dopo la derivazione della linea di cellule staminali, ha permesso di derivare linee di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) prive di fattori8. Inoltre, al fine di migliorare le applicazioni terapeutiche delle hiPSC, era necessario implementare una metodologia nuova, rapida e facilmente applicabile per la conversione di linee cellulari di grado GMP (Good Manufacturing Practice), da condizioni contenenti xeno a condizioni prive di xeno. Qui, discutiamo una metodologia pertinente che valuta in modo più preciso le differenze di espressione genica integrata, in particolare quando integrata in un introne, e la conversione cellulare di livello clinico in condizioni GMP putative. 
Ricerche precedenti hanno utilizzato solo l'analisi trascrizionale microarray relativamente insensibile per analizzare le differenze di espressione genica nei geni integrati dopo la trasduzione STEMCCA3,9. Qui, introduciamo la metodologia dell'analisi quantitativa sensibile della reazione a catena della polimerasi (PCR), per esaminare ulteriormente le differenze di espressione genica integrata. È importante sottolineare che gli attuali criteri di approdo sicuro scartano le hiPSC che hanno geni con integrazioni virali, limitando così l'applicabilità di queste cellule per le terapie cellulari umane a valle9. Proponiamo che lo status quo possa cambiare con l'uso di hiPSC riprogrammate intronicamente completamente caratterizzate e prive di transgeni. Inoltre, introduciamo un robusto protocollo di conversione cellulare di grado GMP che può essere facilmente applicato a una varietà di tipi di cellule diverse, originariamente derivate in condizioni contenenti xeno10. Ciò offre opportunità significative per lo sviluppo di futuri esperimenti di riprogrammazione cellulare, che richiedono condizioni di livello clinico per mantenere la rilevanza terapeutica umana. 
Queste metodologie forniscono una base su cui gli attuali criteri di approdo sicuro possono essere ampliati per includere linee hiPSC riprogrammate STEMCCA caratterizzate che mantengono un profilo di espressione genica normale dopo l'escissione di STEMCCA dall'introne integrato. Inoltre, la conversione completa in condizioni cliniche, prive di antigeni animali non umani, aiuterà a incorporare molti più tipi di cellule, che sono state precedentemente riprogrammate e caratterizzate solo in condizioni contenenti xeno. Queste metodologie, combinate, sono motivi convincenti per la Food and Drug Administration (FDA) statunitense per prendere in considerazione l'estensione della loro approvazione limitata dalle terapie basate su cellule staminali embrionali umane (ESC) alle terapie basate su hiPSC11. 
Abbiamo recentemente dettagliato la derivazione di una linea hiPSC priva di fattori che è stata completamente caratterizzata e convertita in condizioni di grado clinico putativo10. Qui, dettagliamo il protocollo per la derivazione di hiPSC utilizzando il lentivirus STEMCCA. Queste cellule staminali subiscono quindi un processo di escissione seguito da caratterizzazione dell'espressione genica. Infine, le hiPSC vengono convertite in condizioni di grado GMP mediante una metodologia di conversione lenta.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Terreni e reagenti</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (terreni basali)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Terreno essenziale minimo (MEM) aminoacidi non essenziali (NEAA), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep, penicillina-streptomicina, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Scongelare a 4 gradi; C, aliquotare e conservare a &meno; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Siero di ricambio knockout</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a &meno; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA, 0,5%</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Diluire il brodo fino allo 0,05% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti di base</td><td>GlobalStem (Rockville, MD, USA)</td><td>GSR-2001</td><td>Ricostituire a 10 &; g/ml di pasta in albumina sierica bovina allo 0,1% disciolta in 1x PBS e conservare a &meno; 80 gradi C</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Millipore (Billerica, MA, USA)</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (matrice della membrana basale)</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td><td>356231</td><td>Diluire il flaconcino madre Matrigel con 10 ml di DMEM/F12 mentre è in ghiaccio per una diluizione 1:2. Aliquot e conservare a &meno; 20 &deg;C.</td></tr><tr><td>CELLstart (Substrato sintetico)</td><td>Invitrogen</td><td>A1014201</td><td></td></tr><tr><td>Stemmolecule Y27632</td><td>Stemgent (Cambridge, MA, USA)</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Probes Master</td><td>Roche (Basilea, Svizzera)</td><td>4707494001</td><td></td></tr><tr><td>ProFreeze-CDM Medium/mezzo di congelamento</td><td>Lonza (Basilea, Svizzera)</td><td>12-769E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>15628019</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain 10.000x</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)</td><td>161-3101</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina, da pelle suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Produrre brodo allo 0,2% in PBS, autoclavare e conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)</td><td>5850</td><td>Combina l'integratore 5x con il terreno di base, aliquote e conserva a 4 gradi; C per un massimo di 2 settimane.</td></tr><tr><td>Stemedia NutriStem XF/FF Terreno di coltura</td><td>Stelo</td><td>05-100-1A</td><td>Scongelare a 4 gradi C O/N, aliquotare e conservare a 4 gradi C per un massimo di 2 settimane.</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen (San Diego, CA, USA)</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (reagente di dissociazione)</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)</td><td>703-546-155</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene/agente di trasfezione</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</ piastre strong></td></tr><tr><td>12 pozzetti</td><td>VWR (West Chester, PA, USA)</td><td>29442-038</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>piastre da 10 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z688819</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 18</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)</td><td>148265D</td><td></td></tr><tr><td>ago calibro 21</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-10D</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>BD LSRII Flow Cytometer</td><td>KSystem by Nikon (Tokyo, Giappone)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Versione 6.1.3 Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kits</td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K182000</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)</td><td>KK2601</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Roche</td><td>4379012001</td><td></td></tr><tr><td>Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit</td><td>Sialix (Newton, MA, USA)</td>Basic <td>Pack</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Media</td></tr><tr><td>Combined media 1</td><td>StemCell Technologies e Stemgent</td><td></td><td>È costituito da parti uguali di mTeSR1 e Nutristem</td></tr><tr><td>Terreni combinati 2</td><td>StemCell Technologies e Stemgent</td><td></td><td>È costituito da parti uguali di TeSR2 e</td></tr><tr><td>Nutristem HUF Media</td><td></td><td></td><td>Dulbecco' s Eagle modificato' s medium/F12 [DMEM/F12] integrato con il 10% di siero fetale bovino, 1x aminoacidi non essenziali, 1x Glutamax e 1x Primocin</td></tr><tr><td>Human Pluripotent Stem Cell Media</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 integrato con il 20% di siero sostitutivo knockout, 1x Glutamax, 1x aminoacidi non essenziali, 1x Primocin, 1x &beta;-mercaptoetanolo e 10 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti.</td></tr><tr><td colspan="4">DMEM/F12, Dulbecco' s Eagle modificato' s medio/F12; PBS, soluzione salina tamponata con fosfato.</td></tr></tbody></table>

derivazione e caratterizzazione di un free-transgene umana indotta pluripotenti staminali cell line e conversione in definite condizioni clinico-grade

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Umane pluripotenti indotte (cellule staminali hiPSCs) possono essere generati con le metodologie di riprogrammazione basata lentivirali-. Tuttavia, tracce di geni potenzialmente oncogeni rimanenti nelle regioni attivamente trascritti del genoma, limitano il loro potenziale per l&#39;uso in applicazioni terapeutiche umani 1. Inoltre, antigeni non umani derivanti dalla riprogrammazione di cellule staminali o di differenziazione in derivati ​​terapeuticamente rilevanti escludono questi hiPSCs vengano utilizzati in un contesto clinico umano 2. In questo video, vi presentiamo una procedura per la riprogrammazione e l&#39;analisi hiPSCs senza fattore gratuitamente transgeni esogeni. Questi hiPSCs poi possono essere analizzati per alterazioni di espressione genica nel introne specifica l&#39;lentivirus. Questa analisi può essere condotta utilizzando sensibile reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR), che ha un vantaggio rispetto meno sensibili tecniche precedentemente utilizzato per rilevare le differenze di espressione genica 3. La conversione completa inbuone prassi di fabbricazione clinica-grade (GMP) condizioni, permette di rilevanza clinica umana. Il nostro protocollo offre un altro metodo, a condizione che i criteri esenti attuali espandere e comprendono caratterizzati derivati ​​basati hiPSC senza fattore di applicazioni, ad terapeutiche umane derivanti hiPSCs GMP-grade, che dovrebbero eliminare qualsiasi rischio di immunogenicità a causa di antigeni non-umani. Questo protocollo è ampiamente applicabile per lentivirali riprogrammato cellule di qualsiasi tipo e fornisce un metodo riproducibile per la conversione di cellule riprogrammate in condizioni di GMP-grade.

Vi presentiamo un protocollo per derivare clinico-grade hiPSCs senza fattore utilizzando l'approccio basato riprogrammazione-lentivirali STEMCCA. La figura 1A mostra un quadro rappresentativo di tre diverse linee di pre-asportato hiPSC, dopo la riprogrammazione con l'approccio STEMCCA su uno strato di MEF. Il vantaggio principale del metodo riprogrammazione STEMCCA risiede nel successo riprogrammazione coerente ottenuto da più scienziati, in diversi gruppi di ricerca e posizioni. Figura 1B</stro...

Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di derivare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo prive di fattori riprogrammati basati su lentivirali e convertire queste cellule in condizioni di grado clinico putativo. Ciò si ottiene riprogrammando prima i fibroblasti umani dermici adulti con una singola cassetta di cellule staminali lentivirali ex di dimensioni considerevoli o auto staminale in HI PSC. Successivamente, le PSC HI riprogrammate vengono esposte al virus adeno Cree purr per l'escissione completa e la rimozione dell'auto staminale dal genoma ospite.Quindi l'estrazione del DNA genomico dalle PSC HI libere dall'alimentatore, seguita dall'analisi agel conferma la corretta escissione del carrello dello stelo. Infine, il fattore tre H IPC viene convertito in condizioni putative di grado GMP mediante una metodologia di conversione lenta in condizioni prive di xeno completamente definite. In definitiva, la riprogrammazione virale dei fibroblasti dermici adulti umani e la conversione completa degli IPC H in condizioni di grado clinico sottolineano l'ampia applicabilità di questa metodologia per la riprogrammazione delle cellule umane adulte e la loro conversione in condizioni clinicamente rilevanti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle applicazioni cliniche delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in quanto sono completamente prive di fattori e convertite in condizioni di grado clinico, rendendole compatibili con le terapie umane. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di riprogrammazione, escissione e conversione di grado clinico sono difficili da apprendere a causa delle principali procedure intricate e specifiche che devono essere seguite per produrre il fattore tre e le cellule staminali pluripotenti indotte umane di grado clinico per iniziare lo scongelamento. Fibroblasti umani dermici adulti o HAF in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per due minuti.Facendo attenzione a non immergere la parte superiore del flaconcino nell'acqua. Posizionare l'impasto di un millilitro di cellule in una fiala di cronaca da 15 millilitri per risospendere le cellule e diluire il DMSO in modo gocciolante. Aggiungere lentamente quattro millilitri di soffice medio preriscaldato, centrifugare la violetta 200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.Aspirare quindi il sup, il nacent e il reus. Sospendere le cellule in terreno a 100.000 cellule per millilitro in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti preco allo 0,2% di gelatina. Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare, quindi aggiungere due millilitri di sospensione a un secondo.Bene, per essere utilizzato per misurare la molteplicità dell'infezione o MOI, far oscillare la piastra da un lato all'altro e avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule prima di incubarle durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in una camera umidificata. 24 ore dopo, dopo aver contato le cellule, scongelare due volte centrare le otto unità di trasduzione o S di concentrato lentivirale equivalente e utilizzare il mezzo di sbuffo per diluirlo a una volta 10 agli otto T per millilitro utilizzando mezzo terreno integrato con otto microgrammi per millilitro di reagente di trasfezione. Trasdurre le cellule con un rapporto di molteplicità di infezione di 10.Mescolare i pozzetti di trasduzione in modo uniforme e incubare per una notte circa 24 ore dopo la trasduzione lentivirale. Rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con cellule staminali pluripotenti umane standard o terreno PSC. Cambia il mezzo ogni giorno dal secondo al sesto giorno in due piatti da 10 centimetri rivestiti di gelatina da 1,5 a 1,75 volte 10 ai sei fibroblasti embrionali di topo derivati dal fattore componente del complemento uno o dai topi CF uno in mezzo terreno il settimo giorno.Aggiungere i viaggi a temperatura ambiente in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti dei fibroblasti riprogrammati. Solleva delicatamente le cellule e gira a 100 volte G con una piastra media PSC umana fresca tutte le cellule in un rapporto da uno a 16 su due piastre di metanfetamina CFI da 10 centimetri. Distribuire gli aggregati con un movimento a spirale in senso orario e incubare per circa 48 ore prima di sostituire il terreno.Dopo tre o quattro settimane, utilizzare un ago calibro 21 per prelevare da otto a 10 singoli pezzi di colonie specifiche con morfologia tipica delle ESC e subclonarli in singoli pozzetti di CFI MFS dopo l'espansione. Confermare che le cellule sono pluripotenti mediante formazione del corpo embrionale e analisi dell'espressione del marcatore dopo aver verificato il sito di integrazione dell'auto staminale come descritto nel protocollo di testo allegato. Accisa l'auto con stelo aspirando prima il vecchio terreno PSC umano in tre millilitri di terreno PSC standard combinato.45 microlitri di adeno Cree pur concentrato o virus con otto microgrammi per millilitro di agenti di trasfezione. Quindi aggiungere alle cellule e incubare per 24 ore dopo l'incubazione, aspirare il supinato virale, indurre il terreno PSC umano a lavare le cellule due volte. Quindi aggiungere il terreno HPSC con due microgrammi per millilitro di micina pura e sostituire quotidianamente dopo cinque giorni, subclonare le colonie rimanenti ed espanderle come descritto in precedenza nel video.Quindi scongelare una fiala di matrice della membrana basale pre Eloqua su ghiaccio e diluire il terreno basale freddo fino a una concentrazione finale di uno a 30. Utilizzare un millilitro per pozzetto per rivestire il numero desiderato di pozzetti di una piastra a sei pozzetti e lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, utilizzando un ago calibro 18, tratteggiare almeno 20-30 colonie da un pozzo precedentemente rivestito di mes.Fare attenzione a ridurre l'elevazione dei mes e il trasferimento delle cellule dalla piastra. Dopo l'incubazione di un'ora, aspirare la matrice dal pozzetto rivestito con una pipetta da 200 microlitri. Rimuovere i pezzi delle colonie raschiandoli delicatamente dalla vecchia piastra e posizionarli con cura in tre millilitri di terreno appena combinato, uno in una piastra rivestita di matrice.Dopo l'incubazione per 48 ore, cambiare il terreno ogni giorno quando le PSC HI convertite senza post-asportato e senza feeder raggiungono l'80% di fluenza. Utilizzare un kit di estrazione del DNA commerciale per estrarre il DNA genomico utilizzando i primer mostrati qui che sono specifici per le integrazioni esogene del lentivirus dell'auto staminale. Analizzare il DNA mediante PCR per una corretta escissione per la transizione delle PSC HI post-asportate alle condizioni di grado GMP.Miscelare il terreno combinato HPSC uno e il terreno conforme alle GMP di grado clinico o il terreno combinato due con un rapporto compreso tra 80 e 20 preriscaldato a 37 gradi Celsius. Aspirare il vecchio mezzo combinato dalle celle e sostituirlo con tre millilitri della nuova soluzione di terreno caldo. Sostituire il terreno ogni giorno per tre giorni passando secondo il protocollo di testo per mantenere le dimensioni e la densità della colonia adeguate il quarto giorno, sostituire il terreno con una miscela 50 50 di terreni caldi combinati uno e due incubare per tre giorni.Sostituendo il mezzo ogni giorno al settimo giorno, passare a un rapporto da 20 a 80 dei mezzi combinati riscaldati rispettivamente uno e due e sostituire ogni giorno per tre giorni. Il giorno 10, passa a caldo, 100% combinato medio due e cambia ogni giorno. Le cellule sono ora in un mezzo completamente privo di xeno.Successivamente, dopo aver utilizzato un substrato privo di xeno definito per rivestire un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, sostituire il terreno privo di xeno in un pozzetto di celle di confluenza con un terreno fresco contenente una x roccia. Dopo l'incubazione per un'ora, utilizzare un ago calibro 18 per inserire meccanicamente le cellule nella cella appena preparata. Lasciare bene che le cellule incubino indisturbate per due giorni per consentire il massimo attaccamento prima di caratterizzare le cellule secondo il protocollo di testo.Questa figura mostra un'immagine rappresentativa di tre diverse linee H-I-P-S-C pre-asportate dopo la riprogrammazione con l'approccio stem car su uno strato di mes mostrato qui è il gel PCR a trascrizione inversa post escissione che mostra un particolare subclone completamente libero dal lentivirus stem car, come evidenziato dalla mancanza di una banda amplicanica specifica per una particolare sequenza endogena a stem car. In questa figura, le IPC pre-con convertite su una matrice contenente xeno e le IPC di grado H GMP prive di xeno post escisse su matrice sintetica mostrano la quantificazione di fattori associati alla pluripotenza standard, tra cui SOX due, OCT quattro e nanog. L'uso della QPCR è illustrato qui.Infine, come si vede qui, le PSC HI pre-con e post-convertite in condizioni di grado GMP sono state testate attraverso la citometria a flusso per l'acido sialico e l'acido glicole neuronico indicativi di antigeni non umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riprogrammare i fibroblasti dermici adulti umani con il virus di riprogrammazione stemco, asportare il virus dal genoma e quindi convertire completamente queste PSC HI in condizioni di grado clinico pienamente compatibili con le terapie umane. Non dimenticare che lavorare con staca, un vettore antivirale di terza generazione, può essere estremamente pericoloso e precauzionale.Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario utilizzare un DPI adeguato e una sala di coltura tissutale VSL two plus.

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Nonostante i recenti progressi nella modificazione genetica, trasfezione di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimane un processo capriccioso. A nostra conoscenza, metodi sistematici ed efficiente per trasfettare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) non sono stati segnalati. Qui, descriviamo i protocolli affidabili per trasfettare in modo efficiente e nucleofect iPSCs umani.

Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Questo protocollo descrive come generare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule T periferiche umane in condizioni di feeder-free utilizzando una combinazione di vettori virali matrigel e Sendai contenenti fattori di riprogrammazione.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

La caratterizzazione regolare delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), per accertare il mantenimento del loro stato pluripotente, è un passo importante prima che queste cellule vengano utilizzate per altre applicazioni. Qui descriviamo un metodo per la propagazione su piccola scala di iPSC umane specificamente progettato per consentire la loro facile e routinaria caratterizzazione tramite immunocitochimica.

Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica

Questo protocollo descrive la riprogrammazione di primaria amniotico liquido e membrana di cellule staminali mesenchimali in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un approccio episomal non-integrazione in condizioni completamente chimicamente definite. Procedure di estrazione, cultura, riprogrammazione e caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte risultanti dai rigorosi metodi sono dettagliate.

Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Qui, presentiamo un protocollo per formare con precisione l'endotelio emogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione senza alimentatore e xeno. Questo metodo avrà ampie applicazioni nella modellazione della malattia e nello screening per i composti terapeutici.

Differenziazione dell'endotelio endogenico dalle cellule staminali pluripotenti umane in una condizione definita senza alimentatore e Xeno

Impara a derivare cellule staminali pluripotenti indotte umane senza fattori di riprogrammazione e a convertirle in condizioni cliniche di grado GMP partendo da fibroblasti dermici adulti.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade (Video) | JoVE Journal

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

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