Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di derivare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo prive di fattori riprogrammati basati su lentivirali e convertire queste cellule in condizioni di grado clinico putativo. Ciò si ottiene riprogrammando prima i fibroblasti umani dermici adulti con una singola cassetta di cellule staminali lentivirali ex di dimensioni considerevoli o auto staminale in HI PSC. Successivamente, le PSC HI riprogrammate vengono esposte al virus adeno Cree purr per l'escissione completa e la rimozione dell'auto staminale dal genoma ospite.

Quindi l'estrazione del DNA genomico dalle PSC HI libere dall'alimentatore, seguita dall'analisi agel conferma la corretta escissione del carrello dello stelo. Infine, il fattore tre H IPC viene convertito in condizioni putative di grado GMP mediante una metodologia di conversione lenta in condizioni prive di xeno completamente definite. In definitiva, la riprogrammazione virale dei fibroblasti dermici adulti umani e la conversione completa degli IPC H in condizioni di grado clinico sottolineano l'ampia applicabilità di questa metodologia per la riprogrammazione delle cellule umane adulte e la loro conversione in condizioni clinicamente rilevanti.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle applicazioni cliniche delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in quanto sono completamente prive di fattori e convertite in condizioni di grado clinico, rendendole compatibili con le terapie umane. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di riprogrammazione, escissione e conversione di grado clinico sono difficili da apprendere a causa delle principali procedure intricate e specifiche che devono essere seguite per produrre il fattore tre e le cellule staminali pluripotenti indotte umane di grado clinico per iniziare lo scongelamento. Fibroblasti umani dermici adulti o HAF in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per due minuti.

Facendo attenzione a non immergere la parte superiore del flaconcino nell'acqua. Posizionare l'impasto di un millilitro di cellule in una fiala di cronaca da 15 millilitri per risospendere le cellule e diluire il DMSO in modo gocciolante. Aggiungere lentamente quattro millilitri di soffice medio preriscaldato, centrifugare la violetta 200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.

Aspirare quindi il sup, il nacent e il reus. Sospendere le cellule in terreno a 100.000 cellule per millilitro in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti preco allo 0,2% di gelatina. Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare, quindi aggiungere due millilitri di sospensione a un secondo.

Bene, per essere utilizzato per misurare la molteplicità dell'infezione o MOI, far oscillare la piastra da un lato all'altro e avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule prima di incubarle durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in una camera umidificata. 24 ore dopo, dopo aver contato le cellule, scongelare due volte centrare le otto unità di trasduzione o S di concentrato lentivirale equivalente e utilizzare il mezzo di sbuffo per diluirlo a una volta 10 agli otto T per millilitro utilizzando mezzo terreno integrato con otto microgrammi per millilitro di reagente di trasfezione. Trasdurre le cellule con un rapporto di molteplicità di infezione di 10.

Mescolare i pozzetti di trasduzione in modo uniforme e incubare per una notte circa 24 ore dopo la trasduzione lentivirale. Rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con cellule staminali pluripotenti umane standard o terreno PSC. Cambia il mezzo ogni giorno dal secondo al sesto giorno in due piatti da 10 centimetri rivestiti di gelatina da 1,5 a 1,75 volte 10 ai sei fibroblasti embrionali di topo derivati dal fattore componente del complemento uno o dai topi CF uno in mezzo terreno il settimo giorno.

Aggiungere i viaggi a temperatura ambiente in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti dei fibroblasti riprogrammati. Solleva delicatamente le cellule e gira a 100 volte G con una piastra media PSC umana fresca tutte le cellule in un rapporto da uno a 16 su due piastre di metanfetamina CFI da 10 centimetri. Distribuire gli aggregati con un movimento a spirale in senso orario e incubare per circa 48 ore prima di sostituire il terreno.

Dopo tre o quattro settimane, utilizzare un ago calibro 21 per prelevare da otto a 10 singoli pezzi di colonie specifiche con morfologia tipica delle ESC e subclonarli in singoli pozzetti di CFI MFS dopo l'espansione. Confermare che le cellule sono pluripotenti mediante formazione del corpo embrionale e analisi dell'espressione del marcatore dopo aver verificato il sito di integrazione dell'auto staminale come descritto nel protocollo di testo allegato. Accisa l'auto con stelo aspirando prima il vecchio terreno PSC umano in tre millilitri di terreno PSC standard combinato.

45 microlitri di adeno Cree pur concentrato o virus con otto microgrammi per millilitro di agenti di trasfezione. Quindi aggiungere alle cellule e incubare per 24 ore dopo l'incubazione, aspirare il supinato virale, indurre il terreno PSC umano a lavare le cellule due volte. Quindi aggiungere il terreno HPSC con due microgrammi per millilitro di micina pura e sostituire quotidianamente dopo cinque giorni, subclonare le colonie rimanenti ed espanderle come descritto in precedenza nel video.

Quindi scongelare una fiala di matrice della membrana basale pre Eloqua su ghiaccio e diluire il terreno basale freddo fino a una concentrazione finale di uno a 30. Utilizzare un millilitro per pozzetto per rivestire il numero desiderato di pozzetti di una piastra a sei pozzetti e lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, utilizzando un ago calibro 18, tratteggiare almeno 20-30 colonie da un pozzo precedentemente rivestito di mes.

Fare attenzione a ridurre l'elevazione dei mes e il trasferimento delle cellule dalla piastra. Dopo l'incubazione di un'ora, aspirare la matrice dal pozzetto rivestito con una pipetta da 200 microlitri. Rimuovere i pezzi delle colonie raschiandoli delicatamente dalla vecchia piastra e posizionarli con cura in tre millilitri di terreno appena combinato, uno in una piastra rivestita di matrice.

Dopo l'incubazione per 48 ore, cambiare il terreno ogni giorno quando le PSC HI convertite senza post-asportato e senza feeder raggiungono l'80% di fluenza. Utilizzare un kit di estrazione del DNA commerciale per estrarre il DNA genomico utilizzando i primer mostrati qui che sono specifici per le integrazioni esogene del lentivirus dell'auto staminale. Analizzare il DNA mediante PCR per una corretta escissione per la transizione delle PSC HI post-asportate alle condizioni di grado GMP.

Miscelare il terreno combinato HPSC uno e il terreno conforme alle GMP di grado clinico o il terreno combinato due con un rapporto compreso tra 80 e 20 preriscaldato a 37 gradi Celsius. Aspirare il vecchio mezzo combinato dalle celle e sostituirlo con tre millilitri della nuova soluzione di terreno caldo. Sostituire il terreno ogni giorno per tre giorni passando secondo il protocollo di testo per mantenere le dimensioni e la densità della colonia adeguate il quarto giorno, sostituire il terreno con una miscela 50 50 di terreni caldi combinati uno e due incubare per tre giorni.

Sostituendo il mezzo ogni giorno al settimo giorno, passare a un rapporto da 20 a 80 dei mezzi combinati riscaldati rispettivamente uno e due e sostituire ogni giorno per tre giorni. Il giorno 10, passa a caldo, 100% combinato medio due e cambia ogni giorno. Le cellule sono ora in un mezzo completamente privo di xeno

Successivamente, dopo aver utilizzato un substrato privo di xeno definito per rivestire un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, sostituire il terreno privo di xeno in un pozzetto di celle di confluenza con un terreno fresco contenente una x roccia. Dopo l'incubazione per un'ora, utilizzare un ago calibro 18 per inserire meccanicamente le cellule nella cella appena preparata. Lasciare bene che le cellule incubino indisturbate per due giorni per consentire il massimo attaccamento prima di caratterizzare le cellule secondo il protocollo di testo.

Questa figura mostra un'immagine rappresentativa di tre diverse linee H-I-P-S-C pre-asportate dopo la riprogrammazione con l'approccio stem car su uno strato di mes mostrato qui è il gel PCR a trascrizione inversa post escissione che mostra un particolare subclone completamente libero dal lentivirus stem car, come evidenziato dalla mancanza di una banda amplicanica specifica per una particolare sequenza endogena a stem car. In questa figura, le IPC pre-con convertite su una matrice contenente xeno e le IPC di grado H GMP prive di xeno post escisse su matrice sintetica mostrano la quantificazione di fattori associati alla pluripotenza standard, tra cui SOX due, OCT quattro e nanog. L'uso della QPCR è illustrato qui.

Infine, come si vede qui, le PSC HI pre-con e post-convertite in condizioni di grado GMP sono state testate attraverso la citometria a flusso per l'acido sialico e l'acido glicole neuronico indicativi di antigeni non umani. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riprogrammare i fibroblasti dermici adulti umani con il virus di riprogrammazione stemco, asportare il virus dal genoma e quindi convertire completamente queste PSC HI in condizioni di grado clinico pienamente compatibili con le terapie umane. Non dimenticare che lavorare con staca, un vettore antivirale di terza generazione, può essere estremamente pericoloso e precauzionale.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario utilizzare un DPI adeguato e una sala di coltura tissutale VSL two plus.