Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare i cambiamenti nel processo fagocitario o agire nella polimerizzazione in seguito all'aggiunta di agonisti o antagonisti. Ciò si ottiene aggiungendo particelle marcate in fluorescenza alle cellule fagocitiche e lasciando un tempo sufficiente per la fagocitosi. Come secondo passo per fermare la fagocitosi, le cellule vengono trattate con triam blue per estinguere la fluorescenza delle particelle non internalizzate, lavate e successivamente fissate con paraldeide.

Il passo successivo è la colorazione e la quantificazione. Al fine di facilitare la rilevazione fluorescente di cellule e particelle, cellule sostenute con DPI o actina, i risultati mostrano l'effetto del trattamento sulla fagocitosi e sulla polimerizzazione dell'actina quantificato attraverso un rapporto tra fluorescenza verde rosso e blu basato sull'analisi fluorimetrica. Il vantaggio principale della tecnica fluorometrica rispetto ai metodi esistenti è che si tratta di un metodo economico ad alto rendimento per la valutazione della fagocitosi.

Consente una manipolazione minima del campione e una rapida quantificazione dell'intensità fluorescente per cellula. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia e della biologia cellulare, come ad esempio l'efficacia e la velocità di eliminazione di questo patogeno. Azione che cambia la polimerizzazione durante la fagocitosi e come viene modulata la fagocitosi o la polimerizzazione degli assoni da agonisti o antagonisti.

Per iniziare la piastra procedurale, i macrofagi della linea cellulare Murine J 7 74 in una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente o nero incubano le cellule di aderenza a 37 gradi Celsius per una o due ore per consentire l'adione alla piastra. Quindi aggiungere gli agonisti o gli antagonisti desiderati o il controllo del veicolo alle cellule a due x concentrazione in 50 microlitri di PBS o terreni integrati e incubare per un periodo di tempo desiderato. In questa fase, assicurarsi che le particelle fluorescenti e le etichette siano sempre protette dalla luce durante la lavorazione, il lavaggio e l'incubazione.

Al fine di prevenire il fotosbiancamento, utilizzare le particelle in sospensione, come le perle dextra marcate in modo fluorescente, utilizzare la soluzione madre per un minuto. Quindi, aggiungere una quantità uguale di reagente opsonante alle particelle fluorescenti e agitare vigorosamente per un altro minuto. Successivamente, incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora dopo la centrifuga di incubazione le particelle sono state cinque minuti.

A 500 volte G.Rimuovere il surnatante S contenente un eccesso di reagente opsonante. Successivamente, lavare le particelle con 100 microlitri di PBS. Agitare il campione per risospendere il pellet e centrifugarlo per cinque minuti da 500 a volte G.Ripetere questi passaggi altre due volte per garantire una corretta ottimizzazione e rimozione dell'anticorpo non legato.

Per preparare la soluzione di lavoro delle particelle ionizzate, risospendere le particelle in cinque millilitri di terreno. Quindi riporlo al riparo dalla luce fino a nuovo utilizzo. A questo punto, mettere la soluzione di lavoro delle particelle in un serbatoio di reagenti sterile.

Aggiungere 50 microlitri di particelle di opsonizzazione alle cellule preparate in precedenza a una concentrazione finale di 15 nanogrammi per millilitro e lasciare che la fagocitosi avvenga in condizioni standard di coltura cellulare. Per il metodo di fagocitosi continua, attendere da 30 minuti a un'ora affinché le particelle fluorescenti raggiungano il fondo del pozzetto ed entrino in contatto con le cellule. Se si conduce un esperimento sull'andamento del tempo, aggiungere batteri a intervalli di tempo diversi e interrompere l'intera piastra di reazioni allo stesso tempo.

Per migliorare la velocità di elaborazione delle cellule di aderenza, rimuovere il sennet e aggiungere 50 microlitri di blu triam diluito con PBS per estinguere la fluorescenza dei batteri non internalizzati dopo l'incubazione del trian. Lavare la piastra due volte con PBS per rimuovere eventuali residui di trian. Successivamente, fissare le cellule con 50 microlitri di paraldeide al 4% e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi lavare la piastra con PBS. Rimuovere tutto il liquido e aggiungere 50 microlitri di DPI Dopo cinque minuti di colorazione, lavare la piastra due volte con PBS. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di PBS a ciascun pozzetto e registrare la fagocitosi dopo la fissazione della paraldeide.

Lavare la piastra due volte con 100 microlitri di PBS per pozzetto per ogni lavaggio. Quindi aggiungere 50 microlitri di Triton X 100 allo 0,1% in PBS alle cellule per la permeazione e incubarle per tre-cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare via il Triton X allo 0,1% con PBS due volte.

Successivamente bloccare le celle con l'1% di BSA per 20 minuti per evitare il legame non specifico dell'etichetta. Ora prepara la soluzione di lavoro della colorazione Rod domine aggiungendo 100 microlitri di soluzione madre di metanolo in cinque millilitri di PBS. Dopo il blocco, rimuovere immediatamente la soluzione di BSA.

Aggiungere 50 microlitri di foide di rumina e soluzione di lavoro in ogni pozzetto e incubare le cellule al buio per 20 minuti a temperatura ambiente. Per quantificare la fagocitosi, posizionare la piastra in un lettore di piastre fluorescenti Registrare la fluorescenza verde utilizzando un filtro di eccitazione a una lunghezza d'onda di 488 nanometri e un filtro di emissione a una lunghezza d'onda di 518 nanometri e la fluorescenza blu utilizzando un filtro di eccitazione a una lunghezza d'onda di 355 nanometri e un filtro di emissione a una lunghezza d'onda di 460 nanometri. Per quantificare la polimerizzazione dell'actina utilizzando un lettore di piastre fluorescenti, registrare la fluorescenza rossa tramite un filtro di eccitazione a una lunghezza d'onda di 584 nanometri e un filtro di emissione a una lunghezza d'onda di 620 nanometri e fluorescenza blu.

Filtro di fuoco ed eccitazione a una lunghezza d'onda di 355 nanometri e un filtro di emissione a una lunghezza d'onda di 460 nanometri. Quindi, dividere l'RFU totale della fluorescenza verde o rossa per la lettura della fluorescenza blu a seconda dell'etichetta della particella o della quantificazione fagocitaria rispetto all'actina dovuta all'alta piastra. Per definire la varianza, utilizzare indici relativi per illustrare al meglio le tendenze osservate e per facilitare un'analisi statistica più affidabile.

Questa immagine illustra i cambiamenti nella polimerizzazione dell'actina in seguito all'aggiunta di inibitore. Questi sono la formazione degli pseudopodi e qui ci sono i cambiamenti nell'arruffamento della membrana. In questa immagine, le cellule sono state autorizzate a internalizzare perline X coniugate fitzy con un rapporto perlina/cellula di 20 a uno per 60 minuti.

Quindi le cellule si lavano con trian e PBS fissati con paraldeide, permeabile con acetone e colorante per F actina Utilizzando il domine a bastoncello, il lombo F e il dpi, la fagocitosi continua di opsonize e particelle non ossidate è abbastanza comparabile. Dove J 7 74 cellule internalizzano le perle dextra. È interessante notare che la polimerizzazione dell'actina dopo la fagocitosi aumenta rallentando nei punti temporali successivi, mentre la polimerizzazione dell'actina dopo l'internalizzazione delle particelle unop non aumenta. Nessuno dei metodi fagocitici che utilizzano particelle dextra provoca cambiamenti nella vitalità cellulare Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una o due ore con più piastre alla volta se viene eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'analisi metrica del fluoro come metodo efficiente ed economico ad alto rendimento per analizzare la fagocitosi e altri processi cellulari.