Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di tracciare le cellule fotocommutate in un embrione di pesce zebra vivente. Ciò si ottiene incorporando prima un embrione, esprimendo una proteina fluorescente convertibile fotospecifica del tessuto in aros a bassa temperatura di fusione. Successivamente, la proteina all'interno della regione di interesse viene completamente fotoconvertita.

Quindi l'embrione viene accuratamente rimosso dall'aros e mantenuto in acqua d'uovo a 28,5 gradi Celsius fino alle fasi successive. Infine, l'embrione fotoconvertito viene nuovamente incorporato in aros a bassa temperatura di fusione. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano che le cellule fotoconvertite possono essere rilevate con precisione nelle fasi successive grazie alla presenza stabile della proteina fotoconvertita attraverso la microscopia confocale.

Quindi pensiamo che il metodo che presenteremo oggi sarà molto utile nel contesto della biologia cellulare e dello sviluppo. Quindi pensiamo che l'utilizzo di questa metodologia nel contesto della migrazione cellulare, della dinamica dei tessuti e di altri comportamenti cellulari sarà molto utile. A dimostrare la procedura sarà Veronica Lombardo, una postdoc del mio laboratorio Dopo aver incrociato il pesce zebra transgenico, esprimendo una proteina fluorescente fotoconvertibile.

Scegli gli embrioni omozigoti più brillanti e crescili a 28,5 gradi Celsius quando hanno raggiunto lo stadio desiderato. Usa una pinza per ricoprirli in un contenitore di vetro con acqua d'uovo per anestetizzare gli embrioni. Utilizzare una pipetta di vetro o una punta di pipetta tagliata per trasferirli uno alla volta in trica.

Trasferire un embrione anestetizzato sul coperchio di una piastra di coltura e mantenere l'embrione entro il volume più piccolo possibile di terreno. Trasferire l'embrione in aros pipettandolo con agros a bassa temperatura di fusione all'1% con trica a 30 gradi Celsius e metterlo in un piatto di coltura con fondo di vetro. Utilizzare una punta di plastica liscia per orientare l'embrione quando l'agros si è polimerizzato.

Coprirlo con la soluzione Trica su un microscopio confocale invertito dotato di sorgenti laser da 405, 488 e 561 nanometri e un obiettivo 20x. Utilizzare i laser a 488 e 561 nanometri per generare una pila Z dell'intera struttura del campione, che include la regione di interesse. Seleziona lo strumento serie temporale e imposta due cicli senza intervallo, uno per la pre e uno per la conversione post foto.

Seleziona lo strumento della regione e definisci una o più regioni di interesse per la conversione delle foto. Quindi, selezionare lo strumento di sbiancamento e impostare per avviare lo sbiancamento dopo la scansione. Uno dei due utilizzati qui è un laser a diodi da 30 milliwatt a 405 nanometri.

Accuratamente ottimizzato per la quantità minima di luce laser necessaria per la conversione completa delle foto, che si ottiene variando l'intensità della luce laser, le iterazioni di scansione della regione di interesse e la velocità di scansione. Scansiona il campione con i laser a 488 nanometri e 561 nanometri per visualizzare l'eventuale fluorescenza verde rimanente e la fluorescenza rossa fotoconvertita della proteina fluorescente fotoconvertibile. Dopo la fotoconversione, scartare la soluzione e utilizzando un ago o una punta di plastica liscia rimuovere con cura l'embrione dall'agros.

Mantenere l'embrione in acqua d'uovo al buio a 28,5 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato. Incorporare l'embrione una seconda volta, quindi generare uno Zack del campione, compresa la regione di interesse, utilizzando nuovamente i laser a 488 e 561 nanometri. Poiché questo protocollo non influisce sul normale sviluppo, è possibile osservare l'embrione fotoconvertito nelle fasi successive.

Ecco un esempio di un saggio di conversione fotografica. Le cellule endoteliali sono state tracciate durante lo sviluppo del pesce zebra da 48 a 72 ore dopo la fecondazione utilizzando una linea reporter transgenica che esprime il calcio G all'interno dei nuclei endoteliali come mostrato qui prima della fotoconversione Il calcio G è stato espresso all'interno del tessuto endoteliale ed era rilevabile solo come fluorescenza verde utilizzando una scansione di controllo laser ad argon a 488 nanometri con un laser a 561 nanometri per la fluorescenza rossa. Non è stato rilevato alcun GR di calcio convertito con foto prima della conversione della foto.

Successivamente, la regione di interesse è stata completamente fotoconvertita utilizzando un laser a diodi da 405 nanometri al 10% di intensità, 20 iterazioni e i vasi di testa sono stati nuovamente scansionati utilizzando i laser a 488 nanometri e 561 nanometri. In questo pannello, il calcio verde G era completamente passato al rosso all'interno della regione di interesse per tracciare le cellule endoteliali fotoconvertite nelle fasi successive. L'embrione è stato osservato a 24 ore dopo la fotoconversione, che è circa 72 ore dopo la fecondazione all'interno dei tessuti endoteliali derivanti dalla regione di interesse fotoconvertita.

Sia le proteine G del calcio non convertite che quelle fotoconvertite sono state osservate a causa della stabilità del calcio g fotoconvertito fluorescente rosso e della sintesi di un nuovo calcio verde non convertito G dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per esplorare la biologia cellulare e il rimodellamento dei tessuti in diversi pesci.