Modellazione 3D del laterale ventricoli e istologica Caratterizzazione del Tissue periventricolare di esseri umani e il mouse

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è quello di fornire un mezzo per consentire indagini sulla causa e l'effetto della magaly ventricolare e di evidenziare le tecniche che consentono lo studio della salute del sistema ventricolare e delle sue importanti funzioni di barriera e filtrazione all'interno del cervello. Ciò si ottiene raccogliendo sezioni coronali del cervello del topo o scansioni MRI del cervello umano per generare ricostruzioni 3D dei ventricoli e per calcolare i volumi dei ventricoli come secondo passo, il tessuto post mortem che include preparazioni en foss della superficie apicale dei ventricoli viene colorato con anticorpi specifici per le cellule per rivelare l'integrità cellulare del rivestimento del ventricolo. Successivamente, viene preparato un montaggio dell'organizzazione cellulare sull'intera superficie del ventricolo e renderizzato sul modello 3D del ventricolo per dimostrare le regioni di gliosi rispetto alle cellule di aggiunta intatte.

I risultati mostrano regioni di espansione ventricolare basate sulla modellazione 3D longitudinale dei ventricoli e aree in cui lo strato di cellule tematiche aggiunte del rivestimento ventricolare non è più intatto, ma sostituito da cicatrici gliali. Combinando i dati di modellazione 3D con i dati immunoistochimici, è possibile generare una mappa 3D specifica della regione della composizione cellulare del rivestimento ventricolare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di lesioni cerebrali, malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e il normale invecchiamento, che in genere mostrano un certo livello di espansione ventricolare e quindi probabilmente scoliosi della superficie ventricolare.

A dimostrare le procedure nel topo sarà Richard Wolffer e studente universitario del nostro laboratorio, le procedure eseguite utilizzando dati di risonanza magnetica umana e il tessuto umano post mortem saranno dimostrati da yeun. Attualmente sono una studentessa di medicina e Rebecca Chu, una studentessa laureata in laboratorio. Preparare i vetrini da visualizzare fissando il sezionamento, l'immunocolorazione e montando il cervello del topo come indicato nella parte scritta del protocollo. Per iniziare la procedura, per tracciare i ventricoli laterali del topo, accendere il microscopio a fluorescenza verticale e il computer, il microscopio deve essere dotato di un tavolino automatizzato e di una fotocamera CCD digitale.

Avvia il software di mappatura in modalità fluorescenza, apri le opzioni di visualizzazione per caricare le barre degli strumenti e agganciare i pannelli del pool necessari per il tracciamento. Quindi fare clic su opzioni, visualizzare gli accessori delle opzioni e selezionare le barre degli strumenti principale e dei marcatori nello stesso menu. In Pannelli del pool di docking, selezionare l'istogramma della telecamera, il controllo multicanale, le impostazioni della telecamera e l'acquisizione delle immagini.

Identificare il primo pezzo di tessuto contenente i ventricoli laterali in base alla forte fluorescenza beta S 100 che etichetta le cellule di aggiunta. Rivestimento del ventricolo laterale. Orientare gli emisferi sinistro e destro individuando la piccola incisione praticata durante il sezionamento.

Creare ora un nuovo file di dati e designare un punto di riferimento per il movimento del tavolino facendo clic nella finestra dell'immagine sopra il ventricolo laterale sinistro. Mantenere questo punto di riferimento in una posizione coerente rispetto ai ventricoli laterali nei file di tracciamento. Per facilitare l'importazione dei contorni per la ricostruzione seriale, selezionare il tipo di contorno preimpostato appropriato dal menu a discesa del contorno.

Utilizzare un colore univoco per ciascuno dei tracciati del ventricolo laterale sinistro e destro. Ora fai clic lungo l'intera superficie apicale del rivestimento dell'appendice per tracciare il contorno del ventricolo. Spostare la finestra di tracciamento utilizzando i tasti freccia.

Dopo aver tracciato il contorno, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Chiudi contorno. Ripeti il tracciato per il ventricolo destro usando un colore diverso. Quindi, seleziona il marcatore appropriato dalla barra degli strumenti dei marcatori a sinistra e fai clic per rilasciare un marcatore sullo schermo di tracciamento lungo la linea mediana per aiutare ad allineare i contorni seriali per la ricostruzione 3D.

Ripetere questa procedura per fare un secondo segno. Salva le tracce di tessuto selezionando il file Salva file di dati con nome e crea una nuova cartella e un nuovo numero di nome file, i tracciati secondo la convenzione, il numero di diapositiva, il numero di tessuto trattino per una facile identificazione delle tracce dalle sezioni seriali. Quindi ripetere la procedura appena mostrata per tutte le sezioni contenenti un ventricolo.

Per eseguire la ricostruzione 3D del ventricolo laterale. Aprire il programma di ricostruzione 3D. Quindi fare clic su file Apri e selezionare il file di contorno della prima sezione seriale di traccia.

Importa tutti i tracciati di contorno del ventricolo sinistro e destro, nonché tutti i marcatori aggiunti. Allineare i contorni secondo le istruzioni nella parte scritta del protocollo. Quindi selezionare tutti i contorni nel pannello di sinistra, quindi fare clic sul pulsante di visualizzazione 3D per visualizzare la ricostruzione 3D finale.

Questa immagine mostra la sezione cerebrale coronale del topo, compresi i ventricoli laterali, delineata da cellule di aggiunta immunoreattiva beta S 100. L'asterisco indica i ventricoli laterali. Le staffe delineano l'adesione e la barra della scala rappresenta 500 micron.

I ventricoli laterali del topo sono tracciati come contorni e disposti come sezioni di sottosegmenti. Le regioni intraventricolari vengono eliminate interferendo con l'analisi volumetrica. Questa immagine mostra la ricostruzione 3D finale dei contorni del ventricolo laterale.

Il colore giallo rappresenta il contorno dell'intero volume cerebrale che attraversa la regione di interesse contenente i ventricoli laterali. Dovresti avere una buona comprensione di come creare ricostruzioni 3D del tessuto cerebrale affettato Corona I protocolli sono elencati per creare la ricostruzione dell'immagine 3D e la quantificazione volumetrica dei ventricoli laterali e per valutare le variazioni volumetriche nel tempo utilizzando l'analisi di sovrapposizione longitudinale, è importante notare che la coerenza nella risonanza magnetica. La raccolta dei dati R e l'elaborazione post-acquisizione sono criteri estremamente importanti per l'inclusione dei set di dati Per eseguire la segmentazione ventricolare, ITK SNAP viene utilizzato per segmentare i ventricoli da immagini RM pesate T one ad alta risoluzione. Dopo aver avviato il programma, apri l'immagine in scala di grigi, seleziona il file desiderato e aprilo come file elegante.

Quindi scorrere ogni piano anatomico e notare anomalie ventricolari come regioni del naso, corna temporali grandi o piccole o simili. Successivamente, nella casella degli strumenti principale, fai clic su serpente, strumento ROI. Quindi segmentare 3D e selezionare l'opzione della regione di intensità.

Ora fai clic sull'immagine di pre-elaborazione e seleziona sopra. Registrare l'intensità massima utilizzando la barra di scorrimento. Quindi impostare la soglia al 15% dell'intensità massima e registrare questo valore.

Questo dovrebbe evidenziare il ROI in bianco. Impostare il parametro di levigatezza su 10. Fare clic su OK.

Poi il prossimo. Quindi, aggiungi da 10 a 12 bolle di piccole dimensioni a ciascun ventricolo. Due nel corno frontale anteriore, sette uniformemente distanziati lungo la superficie superiore del corpo del ventricolo laterale, uno nel corno occipitale e uno nel corno temporale del ventricolo laterale.

Quindi, selezionare i parametri e impostare la forza di curvatura su 0,4. Quindi fare clic sul simbolo di riproduzione per iniziare l'evoluzione attiva del contorno. Ora fai clic su Aggiorna mesh per visualizzare la superficie.

Quindi controlla l'aggiornamento automatico. Interrompere il processo di segmentazione quando tutte le aree del ventricolo laterale sono incluse nella regione di interesse. Evitare l'inclusione del terzo ventricolo.

Infine, fai clic su Fine e salva i risultati della segmentazione in un elegante formato di file. Per ottenere il volume totale del ventricolo, selezionare la segmentazione, il volume e le statistiche ottengono il volume totale del ventricolo utilizzando l'etichetta del colore impostato. In questo segmento, le ROI longitudinali vengono sovrapposte utilizzando il software mango per dimostrare qualitativamente e quantitativamente i cambiamenti nel volume ventricolare all'interno dei soggetti nel tempo.

Dopo aver aperto il software, fare clic su Apri, aprire il file caricare il file nifty salvato in precedenza. Dopo aver caricato il file immagine, fare clic su ROI caricamento file e caricare la ROI del punto temporale ROI di base in verde. Fai clic su carica file ROI e carica il secondo punto temporale ROI in rosso.

Salva la sovrapposizione longitudinale selezionando file, salva ROI, assegna a ciascuna immagine un nome file secondo la convenzione ora mostrata sullo schermo. Quindi, apri ITK snap. Quindi riaprire la ROI combinata come ROI combinata del carico dell'immagine in scala di grigi selezionando il carico di segmentazione dal file ROI combinato dell'immagine per ottenere i dati del volume longitudinale, eseguire il seguente volume di segmentazione e le statistiche.

L'etichetta uno rosso è uguale al volume di espansione, l'etichetta due è verde è uguale al volume della stenosi, l'etichetta tre blu è uguale al volume di base, iniziando con un emisfero intatto che è stato fissato al 10% di formina per un massimo di sei settimane e risciacquato accuratamente con una fetta di PBS 0,1 molare, sezioni coronali spesse 1,5 centimetri attraverso l'intero emisfero utilizzando un grande coltello utilizzando un bisturi microchirurgico. Sezionare la parete del ventricolo a un centimetro di profondità, mantenendo una sezione continua per l'intera parete laterale, suddividere la parete secondo necessità per creare sezioni di dimensioni adeguate per la colorazione. Incidi bene la sezione sul lato opposto della parete del ventricolo.

Per identificare l'orientamento superiore inferiore, eseguire l'immunoistochimica e montare le sezioni secondo il protocollo scritto. Sotto un cannocchiale da dissezione, fissare il tessuto utilizzando dei perni con un coltello da taglio microchirurgico, creare una sezione uniformemente sottile della parete del ventricolo laterale e montare un penema su un vetrino Quando i vetrini sono completamente asciutti, esaminare le sezioni mediante microscopia confocale a immunofluorescenza. Impostare il piano focale dell'imaging sulla superficie del ventricolo come determinato dall'uso della beta-catenina, un marcatore per l'aderenza apicale.

Proteine di giunzione delle cellule di appendice. Quindi delineare le regioni di copertura cellulare di aggiunta e l'astrogliosi superficiale secondo la colorazione GFAP sulla superficie del ventricolo per documentare e montare l'intera superficie del ventricolo. Utilizzare immagini sovrapposte dell'intera superficie per creare un montaggio di immagini seriali.

Apri Adobe Photoshop e usa il layout interattivo di emersione automatica dei file per selezionare le immagini da sovrapporre, effettuando regolazioni manuali se necessario. Crea un nuovo livello per tracciare il montaggio per generare una rappresentazione a fumetti di intatto. Dipende dalla copertura cellulare o dalla superficie del ventricolo G scoliosi, compila tutte le sezioni per ricostruire la mappa della parete del ventricolo e collega la regione corrispondente sulla ricostruzione della risonanza magnetica.

Questo è l'assemblaggio di immagini RM umane qui. Il ventricolo laterale è stato definito come la regione di interesse in rosso. La ricostruzione dell'immagine 3D, come mostrato qui, consente la quantificazione volumetrica e la visualizzazione qualitativa del ventricolo laterale.

Questa immagine mostra la valutazione dell'espansione del ventricolo longitudinale in un paziente anziano. Le risonanze magnetiche longitudinali da più punti possono essere allineate e sovrapposte per visualizzare e quantificare l'espansione del volume ventricolare all'interno dei soggetti nel tempo. Queste ultime tre immagini mostrano la valutazione immunoistochimica e la mappatura regionale della superficie del ventricolo laterale umano. Qui.

Le aree delle cellule di appendice intatte delineate dalla beta catenina e dalla colorazione mostrano un aspetto di ciottoli come indicato dall'asterisco e sono delimitate da una linea tratteggiata dalle regioni di astrogliosi sulla superficie del ventricolo delineate dalla colorazione GFAP. Le immagini confocali seriali vengono sovrapposte per generare un montaggio regionale e tracciate utilizzando Adobe Photoshop o una rappresentazione a fumetti dell'organizzazione cellulare sulla superficie del ventricolo. Questa immagine a fumetti del montaggio è mappata sulla superficie del ventricolo nella corrispondente ricostruzione del ventricolo 3D basata sulla risonanza magnetica.

Come mostrato il colore verde indica l'aggiunta intatta e le aree rosse della gliosi. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante mantenere un'attenta documentazione di ogni campione di tessuto al fine di eseguire la ricostruzione seriale e la mappatura dell'integrità cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la sottosegmentazione dei ventricoli laterali per rispondere a ulteriori domande riguardanti l'espansione specifica della regione nel tempo.