Un metodo per la selezione di aptameri-struttura di commutazione Applicato ad una colorimetrico oro nanoparticelle Assay

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare apti di commutazione della struttura per l'integrazione come elementi di riconoscimento su piattaforme di rilevamento che funzionano segnalando un cambiamento nella conferma dell'aptamero al momento del binding del bersaglio. Ciò si ottiene aggiungendo una sonda di cattura biotinilata e una libreria di DNA complementare alle microsfere magnetiche rivestite di tabina streptica per immobilizzare la libreria di DNA sulla superficie della perlina. Successivamente, un magnete viene applicato alla soluzione per dividere le sequenze di legame dalle sequenze non leganti rimaste sulle perline.

Le sequenze trattenute vengono quindi purificate e amplificate per il successivo ciclo di selezione. Dopo alcuni turni di selezione, viene aggiunto un passaggio di selezione negativo al processo. Dopo diversi cicli di selezione, l'aptr selezionato dimostra un cambiamento strutturale al momento del legame del bersaglio sulla base di un saggio di rilevamento del bersaglio di nanoparticelle d'oro.

Il vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come la cella X basata sulla soluzione, è che non dobbiamo immobilizzare il bersaglio su un supporto solido. Quindi le implicazioni di questa tecnica sono nella valutazione del rischio dello stato fisiologico di un individuo, ed è dovuto al fatto che il cortisolo è un indicatore di stress, che può portare alla valutazione dei problemi di salute. Utilizzare sempre soluzioni di DNA appena preparate per questo protocollo, in particolare per il target e il controllo.

La preparazione del DNA richiede un'attenzione particolare. Trasferire un'aliquota di 100 microlitri della libreria di DNA in una provetta per termociclatore e riscaldarla a 95 gradi Celsius per cinque minuti in un termomiscelatore. Quindi trasferire il tubo nel ghiaccio fino a quando non è necessario, prima di utilizzare questo DNA, determinare la sua esatta concentrazione su uno spettrofotometro.

Quindi, prepara le perle magnetiche, le perle magnetiche codificate con vortice e trasferisci 400 microlitri di esse in una nuova provetta per microcentrifuga. Posiziona questo tubo sul magnete per due minuti e rimuovi il surnatante, quindi lava le perline. Aggiungere 400 microlitri di tampone legante e agitarli per completare il lavaggio.

Usa un magnete per separare le perline e scartare il surnatante. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte. Quindi, immobilizzare la sonda di cattura sulle perline magnetiche.

Inizia con Resus sospendendo le perle e 400 microlitri di tampone di legame con una sonda di cattura da 50 micromolari. Quindi incubare le perle per 10 minuti con una leggera agitazione a temperatura ambiente. Per rimuovere la sonda di cattura libera, lavare le perle altre tre volte come prima, utilizzando 400 microlitri di tampone legante per lavaggio.

Dopo i tre lavaggi, aggiungere altri 400 microlitri di tampone e raccogliere 100 microlitri di soluzione di perline per i passaggi rimanenti, conservando il resto a quattro gradi Celsius. Il resto può essere utilizzato per i successivi turni di selezione per un massimo di tre settimane. Quando sono necessarie più perline, possono essere preparate con sonde più lunghe per una maggiore rigore in questo schema di selezione.

Ad esempio, dopo il round 13 sono state utilizzate sonde più lunghe, a quel punto è stato ottenuto un arricchimento significativo utilizzando altri rigori. Quando si utilizzano perle prelevate dal magazzino, iniziare lavando due volte l'aliquota di lavoro, utilizzando 200 microlitri di tampone legante per lavaggio. Altrimenti, le perline appena fatte sono già pulite.

Ora aggiungi 100 microlitri di DNA freddo alle perle e incubale per mezz'ora a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Dopo l'incubazione, isolare le perle prima di scartare il surnatante. Calcola la concentrazione di DNA contenuta per determinare quanto DNA si lega alle perline.

Successivamente, lavare le perline tre volte con 200 microlitri di tampone legante. Lasciare che il tampone legante lavi le perle con una leggera agitazione per cinque minuti ogni volta. Quindi preparare la molecola bersaglio nel tampone legante a 100 micromolari e risospendere le perle in 200 microlitri di questa preparazione, la molecola bersaglio.

In questo caso, il cortisolo è in genere altamente concentrato nel primo turno di selezione. Incubare le perle con il bersaglio per mezz'ora con una leggera agitazione in condizioni ambientali. Dopo l'incubazione, conservare la trappola contenente le sequenze bersaglio alluse.

Dopo ogni altro ciclo di arricchimento, prelevare un campione dal surnatante finale per monitorare il processo di monitoraggio. Rimuovere il cortisolo dal surnatante mediante dialisi. Questo può essere saltato se la molecola bersaglio non interferisce con la misurazione dell'assorbanza del DNA a 260 nanometri dopo ogni ciclo, amplificare il DNA legante il bersaglio mediante PCR utilizzando il surnatante raccolto dalla fase di selezione positiva come modello.

Preliminarmente, eseguire sempre un piccolo test PCR per determinare il numero ottimale di amplificazioni. Prelevare campioni da 10 microlitri dopo ogni ciclo e confrontare i campioni con una scala da 25 coppie di basi. In questo caso, la libreria dovrebbe funzionare a 85 coppie di basi su prodotti amplificati che si vedono dopo il 10° ciclo, quindi dovrebbero essere utilizzati meno cicli.

Questo risultato può variare da un round all'altro, quindi è sempre necessario un test. Quindi eseguire una PCR su larga scala utilizzando il numero selezionato di cicli utilizzando otto provette a strisce. Amplifica da sei a otto millilitri di miscela di reazione per ottenere la quantità richiesta di amplicone per il successivo ciclo di selezione, che è compresa tra uno e 2,5 nanomoli di DNA.

Ricontrolla un campione dei prodotti PCR usando un gel. Quindi convertire la maggior parte dei prodotti in DNA a filamento singolo utilizzando perle rivestite di strept non magnetiche. Caricare 300 microlitri di perline in una piccola colonna bloccata da fritz.

Quindi, utilizzando una siringa con blocco esca, lavare delicatamente le perle con cinque millilitri di tampone legante. Quando si cambia la soluzione per lavare la colonna, rimuovere la siringa dalla colonna e rimuovere lo stantuffo dalla siringa. In questo modo si evita un inutile disturbo delle perline.

Creare e lavare un numero sufficiente di colonne di perline per un millilitro di prodotto PCR per colonna. Far passare un prodotto PCR attraverso le colonne esercitando una leggera pressione. I prodotti del DNA saranno trattenuti dalle perle attaccate dai loro filamenti antisenso.

Quindi lavare le colonne legate al DNA con cinque millilitri di tampone legante per rimuovere tutti i componenti della PCR, lasciando solo il DNA del pool di legame per deibridare il DNA dalla colonna e aggiungere 0,5 millilitri di idrossido di sodio 0,2 molare. Quindi desalinizzare il DNA a singolo filamento nell'eit utilizzando una colonna di desalinizzazione preparata con acqua priva di nucleasi. Scartare i 0,5 millilitri iniziali di flusso.

Quindi passare un millilitro di acqua priva di nucleasi attraverso la colonna per raccogliere il DNA dissalato. Misurare l'assorbanza del DNA raccolto e prepararlo per il successivo ciclo di selezione. Come descritto nel protocollo di testo, il DNA a filamento singolo raccolto viene ora aggiunto a un'aliquota di perle appena preparata con sonda di cattura.

Il secondo turno di selezione è simile al primo con una concentrazione di cortisolo inferiore impiegata. Tuttavia, a partire dal terzo turno, incorporare un passaggio di selezione negativo prima della selezione positiva. Per il primo ciclo di selezione negativa, aggiungere 200 microlitri di un progesterone micromolare in tampone legante alle perline.

È strutturalmente simile ma distinto dal cortisolo. Nei giri successivi, aumentare la concentrazione di progesterone dopo aver agitato delicatamente la miscela per mezz'ora a temperatura ambiente. Scartare il supinato e lavare le perle due volte utilizzando 200 microlitri di tampone legante.

Procedere quindi con la selezione positiva. Come descritto in precedenza, durante l'avanzare dei giri, la concentrazione del substrato variava per influenzare il rigore del processo di selezione. I dettagli sono discussi nel protocollo di testo.

Successivamente, seguire il protocollo di testo per eseguire il test delle nanoparticelle d'oro per il rilevamento del cortisolo. Questa lettura metrica del colore rapida e semplice si basa su una modifica strutturale dell'aptamero al momento dell'associazione del bersaglio. Pertanto, fornisce una metrica per valutare la capacità del metodo di selezionare aber con proprietà di commutazione della struttura.

Un altro vantaggio del saggio delle nanoparticelle d'oro è che amplifica un segnale tale che un aptamero di affinità micromolare comune alle piccole molecole può essere rilevato a livelli, ordini di grandezza inferiori alla costante di dissociazione. Il seguente protocollo di selezione è stato utilizzato per isolare gli aberi specifici per il cortisolo. La dialisi e il monitoraggio dell'arricchimento sono stati utilizzati per mostrare un aumento dell'eluizione della molecola bersaglio dopo le successive fasi di selezione.

Una diminuzione dell'eluizione è stata osservata quando nelle fasi finali sono state utilizzate meno molecole bersaglio e sonde di cattura più lunghe. Il sequenziamento di nuova generazione è stato utilizzato per analizzare il DNA eluso dopo diversi cicli. All'inizio, dopo il sesto turno di selezione, una bassa percentuale delle sequenze aveva aumentato il numero di copie, che è stato classificato in 20 contenitori dopo 13 turni.

Una percentuale molto più grande degli abers aveva un alto numero di copie. Quindi rendendo il processo di selezione più rigoroso. Nei round 14 e 15, quasi la metà degli aber selezionati erano al primo rango della frequenza del numero di copie.

A questo punto c'erano circa 3000 sequenze uniche in 30.000 esecuzioni. L'AP selezionato è stato incubato con nanoparticelle d'oro seguite dall'aggiunta di substrati target o per il controllo del confronto. Questo test ha dimostrato che l'AP aveva una maggiore specificità per il cortisolo rispetto all'acido colico o per Durante il tentativo di questa procedura.

È importante controllare il rigore della selezione in ogni round e ottimizzare il numero di cicli PCR. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare un AP di commutazione della struttura ed eseguire un saggio di rilevamento di nanoparticelle d'oro.