Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d'oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field

L'obiettivo generale è fornire un approccio generale per lo sviluppo di un saggio colorimetrico basato su nanoparticelle di aptamer-oro per la rilevazione delle molecole bersaglio, e fornire approcci per migliorare la conservazione a lungo termine e ridurre i tassi di risposta ai falsi positivi. Questo metodo risponde a domande chiave nel campo dei saggi colorimetrici con nanoparticelle d'oro, aptamer, come la riproducibilità degli saghi sul campo per la conservazione a lungo termine e la riduzione del tasso di falsi positivi. Questi saghi possono essere soggetti a problemi di durata e risposte falsamente positive.

In questo lavoro, miglioriamo su entrambi questi temi. Pulire una fiaschetta Erlenmeyer da 500 millilitri e una grande barra di agitazione con cinque millilitri di acido nitrico concentrato e 15 millilitri di acido cloridrico concentrato in un cappuccio di sicurezza chimica. Bagna tutta la superficie della fiaschetta con il lavaggio acido.

Poi risciacqua la fiaschetta con acqua senza nucleasi e lascia asciugare la fiaschetta. Aggiungi 100 millilitri di un millimolare d'oro tre cloruro. Usa un foglio di alluminio per coprire la parte superiore della fiaschetta Erlenmeyer pulita con acido e riscalda con una mescolata continua su una piastra calda fino all'ebollizione.

Successivamente, aggiungi 10 millilitri di citrato di sodio a 38,8 millimolari. Il colore cambia da chiaro o grigio a blu scuro o nero, e infine da scuro a rosso nel corso di diversi minuti. Continua a mescolare con il fuoco spento per 10 minuti.

Lascia raffreddare la sospensione a nanoparticelle d'oro a temperatura ambiente e aggiungi 110 microlitri di DEPC con mescolamento continuo. Copri l'intera fiaschetta con carta stagnola e lascia incubare il trattamento DEPC durante la notte. Il giorno dopo, autoclave della sospensione a nanoparticelle d'oro.

Poi raffredda a temperatura ambiente e filtra attraverso una membrana acetata di cellulosa da 0,22 micron. Conserva la soluzione di nanoparticelle d'oro filtrata e autoclavata al buio a quattro gradi Celsius. Calcola la concentrazione di nanoparticelle d'oro come descritto nel protocollo testuale.

Qui, la concentrazione è stata calcolata a 10 nanomolari con una dimensione di 15 nanometri, determinata dalla diffusione dinamica della luce. Acquista o sintetizza le sequenze di aptamer che legano la cocaina utilizzando la chimica standard della fosforamidite. Dopo aver purificato gli aptameri con la desalinizzazione standard, ricostituire gli oligonucleotidi in acqua priva di nucleasi a soluzioni di stock da 100 micromolari o a un millimolare.

Gli aptameri purificati alliciti possono essere conservati a 20 gradi Celsius per diversi mesi. Combinare il DNA con la soluzione di nanoparticelle d'oro a 10 nanomolari di stocco, variando il volume di nanoparticelle d'oro a piacimento, per fornire un campione sufficiente per l'esecuzione del test. Incubare la miscela per tre o quattro ore a temperatura ambiente e proteggerla dalla luce.

Aggiungi un volume uguale di 20 millimolari HEPES, due millimolari cloruro di magnesio e un tampone pH 7,4, e posiziona il campione a quattro gradi Celsius al buio durante la notte. La concentrazione iniziale di sale necessaria per indurre la risposta colore del saggio tramite titolazione salina viene determinata con il blank del saggio. Aggiungi 20 microlitri di metanolo a 180 microlitri di aliquote del saggio aptamer-cloruro d'oro in una piastra da 96 pozzi.

Un passaggio cruciale nella performance di questi saghi è determinare la concentrazione di cloruro di sodio per destabilizzare le nanoparticelle d'oro una volta aggiunto il bersaglio. Titolare i campioni con volumi crescenti di soluzione di cloruro di sodio e determinare il punto di equivalenza. Qui, si determina il volume di cloruro di sodio necessario per causare il minimo cambiamento di colore tramite osservazione visiva.

Ottimizzando la risposta al saggio, aggiungere 20 microlitri di molecole di analita diluite in metanolo a aliquote da 180 microlitri di analisi delle nanoparticelle di astamo-oro in una piastra da 96 pozzi a temperatura ambiente. Immediatamente, aggiungere la concentrazione di cloruro di sodio determinata nel passaggio precedente per avviare la risposta colorante del saggio. Ottenere il massimo cambiamento di colore possibile aumentando o diminuendo la concentrazione di cloruro di sodio e confrontando la risposta target con la risposta di blank.

Usa la concentrazione di cloruro di sodio che fornisce la maggiore differenza di risposta. Osserva o misura la risposta al test 150 secondi dopo l'aggiunta del cloruro di sodio. Analizza l'assorbanza a 650 e 530 nanometri, utilizzando uno spettrofotometro.

Traccia i risultati come il rapporto di assorbanza ottenuto a 650 nanometri e 530 nanometri in funzione della concentrazione dell'analita. Normalizza la risposta del test al segnale vuoto. Prepara i componenti del test delle nanoparticelle aptamer-oro come descritto in precedenza nel video.

Realizzare soluzioni separate contenenti un grammo per millilitro di trealosio e un grammo per millilitro di saccarosio in acqua priva di nucleasi per produrre la soluzione criogenica. Quindi un passaggio fondamentale nel congelare questi saghi è determinare quanta trealosio e saccarosio aggiungere ai campioni per garantire il congelamento totale e uniforme. Realizzare una soluzione che contenga 19,2 milligrammi per millilitro di trealosio e 4,8 milligrammi per millilitro di saccarosio con il saggio di 60 MN4 DNA per nanoparticella d'oro a un volume finale di 200 microlitri in tubi microcentrifughe da 1,5 millilitri.

Le concentrazioni finali della soluzione criogenica variano in base alla copertura di DNA. Congelare rapidamente i campioni utilizzando un congelatore a 146 gradi Celsius o in azoto liquido. Conserva i campioni congelati fino all'uso.

Per questo lavoro, lasciare i campioni nel congelatore a 146 gradi Celsius per tutta la notte e poi trasferirli in un congelatore a 20 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine. Qui sono mostrati risultati rappresentativi delle curve di titolazione del cloruro di sodio per nanoparticelle d'oro non trattate e trattate con DNA aptamer. La concentrazione iniziale di cloruro di sodio utilizzata nel saggio è stata determinata tramite titolazione.

Qui sono mostrati risultati rappresentativi del saggio colorimetrico delle nanoparticelle aptamer-oro per la cocaina e le molecole di controllo. I grafici rivelano l'effetto che l'aumento della densità di copertura del DNA ha sul tasso di risposta falsamente positiva del test sulla cocaina. Qui sono mostrati i grafici della curva di calibrazione ottenuti dall'analisi fotoimetrica del saggio colorimetrico sulla cocaina.

Foto ottenute con smartphone. Qui sono presentati risultati rappresentativi della risposta al saggio della nanoparticella di aptamer-oro per la cocaina e le molecole di controllo. I dati confrontano campioni appena preparati con quelli conservati congelati fino a quattro settimane.

Durante questa procedura, è molto importante determinare la giusta concentrazione di cloruro di sodio per destabilizzare le nanoparticelle d'oro e favorire il tipico cambiamento di colore all'aggiunta del bersaglio. Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare saggi colorimetrici a nanoparticelle d'oro con aptamero per la rilevazione di bersagli di interesse. Puoi utilizzare gli approcci descritti qui per ridurre i tassi di risposta ai falsi positivi e mantenere i tuoi saggi validi per più di un mese.