Name: Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Scopri la microscopia multiphoton intravitale per studiare le cellule immunitarie nel fegato di topi reporter CXCR6.Gfp. Questo metodo consente l'imaging a lungo termine delle dinamiche dei leucociti.

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Gli autori ringraziano la struttura Central Animal dell'Ospedale Universitario di Aquisgrana per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) e dal Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) di Aquisgrana. Questo lavoro è stato ulteriormente supportato dalla Core Facility "Two-Photon Imaging", una struttura centrale del Centro interdisciplinare per la ricerca clinica (IZKF) di Aquisgrana all'interno della Facoltà di Medicina dell'Università RWTH di Aquisgrana.

NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la normativa tedesca in materia di studi sugli animali in seguito alla &#39;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio &quot;(pubblicazione NIH, 8 ° edizione, 2011) e la direttiva 2010/63 / UE sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (Gazzetta ufficiale dell&#39;Unione europea, 2010). Permesso ufficiale è stata concessa dal governativa cura degli animali e uso ufficio (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Germania). NOTA: I passaggi che possono essere omessi per l&#39;imaging a breve termine (ad esempio, scattare colpi, 3-D pile o anche breve durata microscopia time-lapse) sono contrassegnati con un asterisco (*) per ridurre i tempi di preparazione e semplificare il protocollo chirurgico. Imaging può anche venire eseguito senza ampio controllo e monitoraggio circolazione se necessario, tuttavia, il tempo di sopravvivenza sarà notevolmente ridotto. 1. Setup Microscopio e Pre-chirurgia Preparazione (5-10 kmn) <ol><li> Sistema Accendere (microscopio, potere Lab, laser, rilievo di riscaldamento, camera climatica, web cam, dispositivo pompa a siringa, respiratore). </li><li> Collegare O 2 alimentazione isoflurano vapore e impostare il livello Isoflurano al 1,5 Vol% (v / v), la connessione a un piccolo respiratore animali. <ol><li> Per l&#39;imaging a breve termine, a mantenere l&#39;anestesia con isoflurano solo dopo l&#39;induzione dell&#39;anestesia iniziale ip (vedi punto 2.2). Quindi utilizzare 2 Vol% (v / v) isoflurano, e tenere il tempo di imaging di sotto di 2 ore per garantire la stabilità microcircolazione fegato. </li></ol></li><li> La respirazione a 120-140 cicli respiratori / min Set con un volume di 150-200 ml. </li><li> Impostare palco del mouse agarosio. Preparare 100 ml di 3% (w / v) agarosio, versando in un piatto (di circa 10 cm x 15 cm base) con un angolo di 40 °. </li><li> Impostare area di lavoro chirurgica raccogliere la strumentazione necessaria. Per prevenire l&#39;infezione microbica, disinfettare strumenti utilizzando una soluzione all&#39;1% di Sekusept Forte S (9,9% w / v), Glutaral 9,8% w / v, Formaldeide per 5 minuti prima dell&#39;esperimento (Figura 1A). </li><li> Ottenere rimanenti componenti: disinfettante della pelle (ad esempio, 10% di soluzione di povidone iodio), fegato (fase pile e bridge), soluzione di agarosio (3% (w / v) in PBS), pompa a siringa con 5% (w / v) soluzione di glucosio (G-5), pompa a siringa con soluzione anestetica I (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 0,5 mg / ml, fentanil 5 mg / ml), tamponi di cotone, n-butil-2-Cyanoacrylat, e 1x PBS. Mettere piatto fase agarosio nella camera di incubazione per il preriscaldamento. </li></ol> 2. tracheotomia (10-15 min) <ol><li> Utilizzare C57BL / 6 topi da casa da riproduzione di almeno 25-28 g. Casa topi in condizioni specifiche esenti da organismi patogeni, in conformità con le linee guida FELASA, in un ambiente a temperatura e umidità controllata con 12 ore di luce / 12 hr ciclo scuro. Consentire animali l&#39;accesso gratuito alla dieta standard topi (Sniff standard roditore Diet) e acqua ad libitum. </li><li> Anestetizzare il mouse initial intraperitoneale (ip) iniezione di 250 microlitri della soluzione di anestetico II (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 1 mg / ml, Buprenorfina 10 mcg / ml). <ol><li> * Per manutenzione durante l&#39;imaging intravitale, continuamente amministrare soluzione anestetica I di iniezione continua ip (ketamina 0,1 mg / ml, Xilazina 0,5 mg / ml, fentanil 5 mg / ml) utilizzando un dispositivo pompa a siringa con una portata di 0,2 ml / hr in combinazione con inalazione isoflurano 0,5 Vol% (v / v). </li><li> Controllare riflessi dopo 5 min (es pizzico zampe con le pinze), disinfettare la pelle per tracheotomia, iniziare la preparazione se il mouse è in stato di anestesia chirurgica tollerante. </li><li> Applicare occhio crema protettiva (ad esempio, Dexpantenolo 50 mg / g) per evitare di cornea si secchi (Figura 1B). </li></ol></li><li> Fissare il mouse sulla tabella di preparazione esporre lato ventrale con del nastro adesivo per le estremità; tirare troppo delicatamente collo, fissare in questa posizione, ad es., usando un elastico agganciato to gli incisivi. <ol><li> Disinfettare la pelle e la pelliccia con una soluzione di iodio povidone, applicando il disinfettante con un batuffolo di cotone. </li></ol></li><li> Eseguire il taglio della pelle iniziale (0,5-1 cm di lunghezza) direttamente sotto il mento (Figura 1C) <ol><li> Sezionare con cura il tessuto connettivo tra ghiandole salivari (Figura 1D). </li><li> Attenzione allo strappo aperto muscolare tubo circostante trachea (Figura 1E, F). </li></ol></li><li> Mettere filo chirurgico sotto la trachea per dopo tubo di ventilazione fissaggio (Figura 1G). <ol><li> Aprire trachea con micro-forbici tra gli anelli cartilaginei che svolgono una incisione a forma di T (Figura 1 H) </li></ol></li><li> Inserire tubo di ventilazione nella trachea attraverso l&#39;incisione (~ 0.5 cm). Per spingere il tubo in avanti, afferrare fine caudale con piccole pinze anatomiche e far avanzare delicatamente il tubo nella trachea (Figura 1I) </li><li> Fissare il tubo con filo chirurgico (es </em&gt;, 5-0) con filo inserito nel passo 2.5 un nodo intorno tubo all&#39;interno della trachea; effettuare secondo fissaggio craniale del tubo alla pelle per evitare accidentali depositioning (Figura 1J, K). </li><li> Taglio Seal con colla tissutale (ad esempio, n-butil-2-Cyanoacrylat) (Figura 1L). </li><li> Fissare il tubo alla testa con del nastro adesivo. </li></ol> 3. laparotomia (15-20 min) <ol><li> Posizionare il mouse sul tappetino di riscaldamento per evitare l&#39;ipotermia. Shave addome, rimuovere con attenzione i capelli dalla pelle. Disinfettare la pelle rasata e pelliccia utilizzando una soluzione di iodio povidone. </li><li> Eseguire una piccola pelle tagliata sotto lo sterno con le forbici chirurgiche (Figura 2a). Estendere il taglio lateralmente sotto le costole su entrambi i lati, cauterizzare tutti i vasi sanguigni visibili per prevenire le emorragie. </li><li> Eseguire accuratamente un piccolo taglio alla linea alba sotto lo sterno, aprendo il peritoneo (Figura 2B). Estendere il taglio di entrambi i lati con cauterizzione per prevenire le emorragie (Figura 2C, D). </li><li> Posizionare il mouse nel piatto fase agarosio (Figura 2E). Inserire pile di altezza adeguata su entrambi i lati del mouse (solitamente 12-14 coprioggetto) (Figura 2F). </li><li> Posizionare sensore di trigger respiratorio sotto parte superiore della schiena per sincronizzare il microscopio con la respirazione. Attivare unità di innesco (Figura 2G). </li><li> Mettere filo chirurgico (5-0) con lo sterno di ritrattare costole (Figura 2i). </li><li> Tagliare con cautela legamento che collega il fegato e il diaframma (Legamento falciforme), così come il fegato e il tratto gastrointestinale con le forbici chirurgiche curve. Tagliare il legamento falciforme verso l&#39;aorta (Figura 2J). </li></ol> 4. Configurazione di esempio (10-15 min) <ol><li> Posizionare il mouse sul lato destro con un angolo di 45 ° per un facile accesso al grande lobo epatico. </li><li> Aggiungere scena ponte sotto le costole, che copre il addominalecavità. Fabbricazione un ponte utilizzando un vetrino di serie con rivestimento del nastro adesivo per coprire spigoli vivi (Figura 2K). </li><li> Luogo grande lobo epatico sul palco. Scivolare delicatamente doppia sfera della sonda stilo o una spatola imbottita sotto il fegato e tenere la parte superiore dell&#39;organo con un tampone di cotone bagnato o tessuto bagnato. Sollevare lobo sul vetrino e applicare gentile trascinare. Lobe può essere piegato o piegata. Fornire attenzione a solo delicata manipolazione del fegato (Figura 2L). </li><li> Posizionare pali laterali di supporto, ad esempio, pile di piccoli slittamenti di copertura (20 mm x 20 mm), pari a circa la stessa altezza del lobo epatico accanto ad essa per sostenere vetrino. </li><li> Mettere grande vetrino (24 mm x 50 mm) sul lobo epatico. Assicurarsi che la copertura di slittamento è orientato più orizzontale possibile (Figura 2M). NOTA: Il vetrino deve essere in contatto con il tessuto senza schiacciarla. Verificare la presenza di segni visibili di compromissione del flusso sanguigno (tessuto bianco). Se MICROCIRClamento è perturbato, aggiungere ulteriore supporto pali. </li><li> * Inserire due cateteri intraperitoneali indipendenti (Figura 2N) per l&#39;anestesia a lungo termine e G-5 applicazione. Installare cateteri lateralmente nel basso addome accanto agli arti posteriori. NOTA: I cateteri intraperitoneale possono essere fatto da sé, collegando 27 aghi G con tubi in silicone flessibile (Figura 3). </li><li> * Fixate ago con un anello di 5-0 filo chirurgico alla pelle per evitare spostamenti accidentali. </li><li> * Collegare pompa a siringa con soluzione di anestesia I CATETERE 1, portata impostato a 0,2 ml / h; collegare pompa a siringa con G-5 a catetere 2, portata impostato a 0,1 ml / h. </li></ol> 5. Monitoraggio mouse <ol><li> * Elettrodi ECG posto in estremità anteriore e posteriori (figura 4a). </li><li> * Collegare il tubo di scadenza di CO 2 sensore di livello. </li><li> Aggiungi il sensore di temperatura esterna collegata al pad di calore (Figura 4C). </li></ol> 6. Integrazione e Tissue Fixation (5-10 min) <ol><li> Preparare 100 ml di 3% (w / v) agarosio in 1X PBS. Incorpora fegato quando la temperatura è a 41 ° C con una siringa da 5 ml e un ago da 18 G (Figura 5A). </li><li> Versare agarosio rimanente sul coprioggetto e intorno al mouse (Figura 5B, C). Attendere fino agarosio è completamente gelatinizzato. </li><li> Rimuovere agarosio in eccesso con la spatola Heidemann, la preparazione di un Viewfield abbastanza grande per eseguire la scansione del lobo epatico predisposto (Figura 5D, E). </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Trasferire il mouse nella camera microscopio clima. </li><li> Aggiungere 50-100 ml di PBS 1x (preriscaldata a 37 ° C). </li><li> Coprire piatto del campione per evitare l&#39;evaporazione (figura 5F). </li><li> * Ridurre isoflurano inalazione al 0,5 Vol% (v / v). </li><li> * Avviare il software di monitoraggio, la registrazione ECG, frequenza cardiaca e CO 2 espiratorio. </li><li> Inizio di imaging: aprire lapersiane ser, identificano i campi di vista di interesse, definiscono limite superiore e inferiore per Z-stack, e avviare la registrazione lasso di tempo. Regolare Z-stack, se necessario, correggere Z-drift (ad es. A causa di cambiamenti nella pressione sanguigna o la variazione di temperatura, Figura (5G). NOTA: Al termine del periodo di imaging o se la circolazione o anestesia degli animali diventa instabile, sacrificare i topi da dislocazione cervicale (senza risveglio dall&#39;anestesia). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non rivelano alcun conflitto di interessi.

Lo scopo del nostro studio è stato quello di sviluppare un metodo altamente standardizzato, stabile e riproducibile per l&#39;imaging intravitale TPLSM del fegato. Imaging intravitale in generale ha dato preziose informazioni sul comportamento cellulare in condizioni di vita reale seguenti homing e l&#39;interazione di diverse popolazioni di leucociti nello sviluppo, omeostasi e la malattia. Tuttavia, la posizione anatomica piuttosto impegnativa del fegato, a causa della quale respiratorio e movimento intestinale perist...

La visualizzazione delle cellule e funzioni cellulari di organi interi o persino interi organismi è stato di grande interesse per più di 50 anni, tra cui quasi tutte le parti del corpo 2. Pertanto, alcuni primi studi già impiegati l&#39;imaging intravitale del fegato 3,4. Tuttavia, alcune limitazioni esistono aggiornati riguardo a lungo termine ad alta risoluzione stabile di imaging di tessuto epatico. A causa della posizione anatomica del fegato in stretto contatto con il diaframma e il tratto gastrointestinale 5, il problema più comune per l&#39;imaging microscopico intravitale è movimento dovuto alla respirazione e, in misura minore, peristaltica del tratto intestinale 6. In confronto ad altri organi solidi, chirurgia epatica è particolarmente impegnativo. A causa della struttura microvascolare densa, manipolazione chirurgica può portare a massicce lesioni emorragiche, alterata microcircolazione 7 e anche l&#39;attivazione di residente icellule mmune come le cellule di Kupffer 8. Pertanto, fissaggio meccanico del tessuto come pubblicato altrove 6,9 rischia di interferire con imaging microscopia intravitale. In un fegato sano, 10-15% del volume totale del sangue risiede all&#39;interno del sistema vascolare del fegato, e l&#39;organo riceve circa il 25% della gittata cardiaca complessiva 10, rendendo l&#39;organo altamente sensibili alle variazioni di circolazione (ad esempio, variazioni di pressione sanguigna ). Di conseguenza, le interruzioni nel flusso epatico causa ad esempio, shear stress, spostamento, lesioni da uso eccessivo tessuto o circolazione centralizzata porterà ad alterazioni artificiali in leucociti comportamento migratorio, ridotta ossigenazione del fegato e quindi ulteriori danni al fegato, che colpisce fegato risposte immunitarie come pure come conservazione dell&#39;organo e la durata complessiva dell&#39;animale. I primi studi microscopici erano basati su mi epifluorescenza intravitalemicroscopia, ma molti vincoli tecnici, quali foto sbiancamento e la profondità di penetrazione bassa limitano l&#39;uso di questa tecnica per il lungo termine l&#39;imaging del fegato 4,11,12. Con lo sviluppo della microscopia multiphoton nel 1990, le limitazioni della foto sbianca o profondità di penetrazione erano principalmente risolti, come questo nuovo metodo era tecnicamente in grado di svolgere studi di imaging in quasi tutti gli organi sotto situazioni reali 13-15. Tuttavia, le principali sfide rimanenti rispetto all&#39;imaging fegato sono stati: i movimenti del respiro, autofluorescenza di tessuto epatico, che fissano inalterato il flusso di sangue nelle sinusoidi epatici, e di imaging particolarmente stabile per un periodo di diversi hr 16 più lunghi. Anche se diversi studi hanno affrontato la funzione e la migrazione dei vari leucociti nel fegato 17, ad esempio, NKT cellule 18-20, le cellule T 21,22, i macrofagi del fegato 23,24 o neutrofili 25, a lungo termine multiphoton mImaging icroscopy non era ancora stato stabilito con successo, un compito ancora più impegnativo in animali affetti da malattia epatica acuta o cronica a causa dei danni esistente e quindi maggiore suscettibilità a ulteriori danni 26. Tuttavia, il monitoraggio comportamento migratorio e la funzione cellulare dei leucociti nel fegato in tempo reale consente nuove intuizioni nel loro ruolo specifico nella omeostasi del fegato e malattie 27. Il CXCR6 recettore delle chemochine è espresso in diverse sottopopolazioni linfocitarie, tra cui natural killer (NK), le cellule NKT e alcune popolazioni di cellule T 18,28. Precedenti studi sui topi hanno indicato che CXCR6 e la sua CXCL16 ligando affine possono controllare il pattugliamento delle cellule NKT su sinusoidi del fegato durante l&#39;omeostasi. Di conseguenza, l&#39;uso di topi CXCR6.gfp (portando un knock-in della proteina fluorescente verde [GFP] nel locus CXCR6) è stata descritta per studiare la migrazione dei linfociti in vari organi come il cervello 29e anche il fegato 18,20, mostrando aumento infiltrazione di cellule CXCR6.gfp su infiammazione. Con il metodo fornito in questo studio è stato possibile seguire questi processi per un lungo periodo di tempo in condizioni stabilizzate. La procedura basata multiphoton intravitale permesso di imaging che era altamente riproducibile con il minimo turbamento dell&#39;animale e l&#39;organo; ottimizzata per il lungo termine animali sopravvivenza da un ampio monitoraggio seguito da vicino il controllo della respirazione e della circolazione; e altamente flessibile e facile da adottare anche ad altri organi parenchimatosi come il rene, milza.

<table><tbody><tr><td>Anestetici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Rotex Medica</td><td>carica: 30819</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia Fluovac</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio 5%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporizzatore</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Isotonico (0,9%) Soluzione di NaCl</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 10%</td><td>ceva</td><td>Carica: 36217/09</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina 2%</td><td>medistar</td><td>Carica: 04-03-9338/23</td><td></td></tr><tr><td>Forniture</td><td></td><td></td><td></td>di materiali di consumo</tr><tr><td>20 ml Siringa</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer pallone</td><td>Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Becher 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl sutura</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>disponibile</td><td></td><td></td>in commercio</tr><tr><td>Bepanthen Eye e Unguento per il naso</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe Kit per cauterizzazione ad alta temperatura</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di garza di cotone</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto 24x50 mm</td><td>ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Nastro di seta Durapore</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso Feather</td><td></td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene a foro fine 0,58 mm ID</td><td>Smiths medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>5x 0,5 ml</td></tr><tr><td>Leukoplast</td><td>BSN Medical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Alcohol Haut&hellip; farblos Antiseptticum</td><td>Antisepttica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Ago Sterican 18 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Ago Sterican 27 3/4 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Carta velina</td><td>disponibile</td><td></td><td></td>in commercio</tr><tr><td>Strumenti</td><td></td><td></td><td></td>chirurgici</tr><tr><td>Bruniscitore in amalgama 3PL</td><td>Gatz</td><td>0110?</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatori Blair (4 punte (smussato)) x2</td><td>Storz& Klein</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.7 pinze</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graefe curva x1</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graefe dritta x2</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Spatola Heidemann HD2</td><td>Stomia</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbice</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Semken</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici chirurgiche curve Fine</td><td>Science Tools Inc.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici chirurgiche dritte Fine</td><td>Science Tools Inc.</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinze modello standard</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla Vannas</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchiatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECG Trigger Unit</td><td>Rapid Biomedical</td><td>3000003686</td><td></td></tr><tr><td>MICROCAPSTAR Analizzatore di anidride carbonica di fine espirazione</td> AD <td>Strumenti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minivent Typ 845</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotone Trimscope I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 registratore a 8 canali</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo a temperatura controllata</td><td>Sygonix</td><td>26857617</td><td></td></tr><tr><td>Sensore di temperatura</td><td>disponibile</td><td></td><td></td>in commercio</tr><tr><td>Sistema a temperatura controllata per microscopi -Cube& </td><td>Servizi</td><td></td><td></td> di imaging Box Life</tr></tbody></table>

long term intravitale multiphoton microscopia imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato uso mice cxcr6.gfp reporter

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html> Fegato infiammazione come risposta al danno è un processo altamente dinamico che coinvolge l&#39;infiltrazione di distinti sottotipi di leucociti tra cui monociti, neutrofili, sottogruppi di cellule T, cellule B, natural killer (NK) e le cellule NKT. Microscopia intravitale del fegato per monitorare la migrazione delle cellule immunitarie è particolarmente difficile a causa degli elevati requisiti per quanto riguarda la preparazione del campione e la fissazione, risoluzione ottica e animale sopravvivenza a lungo termine. Tuttavia, la dinamica dei processi infiammatori così come studi di interazione cellulare potrebbe fornire informazioni fondamentali per comprendere meglio l&#39;iniziazione, la progressione e la regressione della malattia epatica infiammatoria. Pertanto, un metodo altamente sensibile ed affidabile è stato istituito per studiare migrazione e cellula-cellula-interazioni di diverse cellule immunitarie in fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) di intravitale due fotoni microscopia a scansione laser (TPLSM) in combinazione con terapia intensiva monitoraggio. ent &quot;&gt; Il metodo fornito comprende una preparazione dolce e fissazione stabile del fegato con il minimo turbamento dell&#39;organo; di imaging intravitale lungo termine utilizzando la microscopia multicolor multiphoton praticamente senza photobleaching o effetti fototossici per un periodo di tempo massimo di 6 ore, consentendo il monitoraggio di specifici sottoinsiemi di leucociti, e le condizioni di imaging stabile a causa monitoraggio estensivo di topo parametri vitali e la stabilizzazione della circolazione, la temperatura e lo scambio di gas. Per studiare la migrazione dei linfociti su infiammazione del fegato CXCR6.gfp knock-in topi sono stati sottoposti a esami del fegato intravitale in condizioni basali e dopo danno epatico acuto e cronico indotto da un&#39;iniezione intraperitoneale (s) di tetracloruro di carbonio (CCL 4). CXCR6 è un recettore per chemochine espressi sui linfociti, soprattutto su Natural Killer T (NKT) -, Natural Killer (NK) - e sottoinsiemi di linfociti T come le cellule T CD4 ma anche Associ mucoseATED invariante cellule (MAIT) T 1. Seguendo il modello migratorio e il posizionamento di CXCR6.gfp + cellule immunitarie permesso una visione dettagliata del loro comportamento alterato sul danno epatico e quindi il loro potenziale coinvolgimento nella progressione della malattia.

Per convalidare il nostro approccio TPLSM intravitale, abbiamo sottoposto CXCR6 GFP / + topi per l&#39;imaging intravitale TPLSM. I topi sono stati o non trattata come controlli di base o sottoposti a una singola iniezione intraperitoneale di tetracloruro di carbonio (CCL 4) per indurre un danno epatico acuto 20. Le sequenze video sono state scattate in un periodo di tempo di 2-5 ore, e le cellule sono state tracciate nel corso del tempo a causa della loro fl...

L'imaging intravitale stabile ad alta risoluzione delle cellule immunitarie nel fegato è impegnativo. Qui forniamo un metodo altamente sensibile e affidabile per studiare la migrazione e le interazioni cellula-cellula delle cellule immunitarie nel fegato di topo per lunghi periodi (circa 6 ore) mediante microscopia a scansione laser multifotone intravitale in combinazione con il monitoraggio della terapia intensiva.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è seguire la migrazione e l'interazione dei leucociti in una malattia infiammatoria epatica in evoluzione. Comprendere meglio la sequenza di eventi alla base del reclutamento di queste cellule nel tessuto epatico e del loro potenziale coinvolgimento nell'immunopatologia. Ciò viene ottenuto eseguendo innanzitutto una tracheotomia per ottenere il controllo della respirazione del topo, un passaggio fondamentale per garantire la sopravvivenza a lungo termine dell'animale.Come secondo passaggio, si esegue una laparotomia al topo per esporre chirurgicamente il fegato, consentendo l'accesso all'organo mediante il microscopio a fotoni multipli. Successivamente, il fegato viene fissato e posizionato immergendolo in una matrice per minimizzare gli artefatti dovuti al movimento. L'acquisizione delle immagini può proseguire per diverse ore, generando sequenze in time-lapse ad alta risoluzione che consentono di seguire i cambiamenti nel reclutamento, posizionamento e interazione dei singoli leucociti.Nel processo di sviluppo dell'infiammazione epatica, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'infiammazione epatica acuta e cronica, come il reclutamento dei leucociti, le interazioni tra cellule o i meccanismi di immunopatologia. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla microscopia convenzionale è che la microscopia multifocale consente un'acquisizione di immagini a lungo termine con perturbazione del campione praticamente nulla, riducendo al minimo lo sbiancamento del fluorocromo e la fototossicità, nonché l'ottenimento di sezioni ottiche fino a 100 micrometri di profondità nel tessuto, grazie alla fisica unica del laser a luce nel rosso estremo. Questo metodo può fornire informazioni approfondite sulle malattie epatiche.È facilmente adottabile ad altri sistemi. Poiché il metodo di stabilizzazione e fissazione del tessuto può essere applicato praticamente a tutte le domande della microscopia intravitale, è possibile ottenere facilmente immagini di organi come milza, rene o persino tumori sottocutanei utilizzando cellule fluide correlate. È inoltre possibile visualizzare tutti i sottogruppi di leucociti e osservare le loro interazioni e l'infiammazione epatica.Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà a causa dell'estrema complessità della chirurgia su piccoli animali. Tuttavia, grazie alla nostra esperienza, questo rappresenta un fattore limitante solo per alcune settimane ed è necessaria soltanto una certa pratica diretta. A causa della fragilità del tessuto epatico, le fasi di preparazione sono difficili da apprendere e la dimostrazione visiva del metodo è essenziale. Dopo aver preparato l'anestetico, riempire il palco per il topo con il 3% di aros, versandolo con un angolo di 40 gradi.Quindi assicurarsi che l'area chirurgica sia completamente disinfettata, così come tutti gli strumenti necessari e così via. Successivamente, anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di un cocktail anestetico. Cinque minuti dopo, verificare i riflessi dell'animale, quindi disinfettare la cute e applicare un unguento oftalmico agli occhi.Ora, fissare il mouse al tavolo di preparazione. Utilizzando del nastro, posizionarlo in modo da esporre delicatamente la faccia ventrale, leggermente stirando il collo. Questo può essere ottenuto con un elastico agganciato agli incisivi.Ora, eseguire un'incisione iniziale al di sotto del mento lunga circa 0,5-1 centimetro. Quindi dissezionare con attenzione il tessuto connettivo tra le ghiandole salivari e individuare il tubo muscolare che circonda la trachea. Strappare delicatamente il muscolo per esporre la trachea.Estrai un filo sotto la trachea, quindi apri la trachea con forbici microchirurgiche praticando un'incisione a forma di T. Inserisci il tubo di ventilazione per circa mezzo centimetro. Avanza il tubo utilizzando pinze anatomiche di piccole dimensioni.Quindi fissare il tubo con punti di sutura. Per una maggiore sicurezza, suturare il tubo alla cute, chiudere l'incisione cutanea con cianoacrilato e fissare il tubo alla testa dell'animale. Utilizzando del nastro adesivo, mantenere l'anestesia mediante un flusso continuo di 2%iso fluorine.Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico, effettuare una piccola incisione cutanea al di sotto dello sterno ed estendere il taglio lateralmente al di sotto delle costole su entrambi i lati. Cauterizzare tutti i vasi sanguigni esposti durante questa procedura. Per minimizzare il sanguinamento, eseguire un piccolo taglio iniziale al gomito lineare per accedere alla cavità addominale.Estendere il taglio in senso orizzontale, sigillando tutti i vasi sanguigni e permettendo l'accesso al fegato. Ora trasferire il topo sulla piattaforma chirurgica e posizionare dei vetrini ai lati dell'animale per mantenerlo fermo. Questi vetrini impilati devono avere un'altezza corrispondente a quella del topo, in modo che la piastra per il fegato, che verrà posizionata successivamente, non eserciti una pressione eccessiva sull'addome.Ora, utilizzando punti di sutura nello sterno, retrarre le costole. È sufficiente un punto di sutura 4-0. Dopo aver retratto le costole, tagliare i legamenti che collegano il fegato al diaframma, proseguendo fino all'aorta, ma operare con particolare cautela per non rompere o recidere il vaso. Tagliare anche il legamento che collega il fegato al tratto gastrointestinale.Ruotare il mouse di 45 gradi per migliorare l'accesso al lobo epatico più grande. Prendere un vetrino da copertura standard e applicare del nastro lungo i suoi bordi in modo che non sia tagliente. Posizionarlo sulla cavità addominale.Questo servirà come piattaforma per posizionare il fegato. Far scivolare con attenzione una sonda a doppia sfera o una spatola imbottita sotto il fegato e tenere la parte superiore dell'organo. L'uso di un tessuto umido eserciterà immediatamente una pressione meccanica che lesiona il tessuto epatico, quindi è essenziale manipolare l'organo con cura.Quindi sollevare il lobo sul vetrino e tirarlo delicatamente in posizione. Il lobo di solito risulterà piegato o leggermente ripiegato; provare a distendere i bordi sollevando il tessuto con una spatola sottile o un pezzetto di tessuto umido. Successivamente, aggiungere supporti laterali sotto forma di coprioggetti o vetrini.Accumulare i coprioggetti in modo che abbiano la stessa altezza del lobo epatico. La preparazione e la fissazione del fegato rappresentano il passaggio più cruciale del protocollo. Qualsiasi stress meccanico, torsione o pressione provocherà un danno tissutale immediato o almeno un flusso ematico compromesso nei vasi sinusoidali.Ora, posizionare una grande lamella con i bordi incollati sopra il lobo epatico, sostenuta dai supporti laterali. Posizionare la lamella il più possibile in piano. Non deve comprimere il fegato.Il tessuto bianco indica un flusso sanguigno compromesso, a meno che l'imaging non venga eseguito rapidamente. Ora è necessario inserire due cateteri intraperitoneali indipendenti per fornire un'anestesia a lungo termine e applicare G cinque. Questi sono assemblati utilizzando aghi da 27 gauge e tubi di silicone flessibili.Quindi avviare il flusso utilizzando pompe a siringa. Inserire i cateteri nell'addome inferiore vicino agli arti posteriori. Dopo aver collegato i monitor vitali al topo, preparare 100 millilitri di 3%aros in un XPBS.Una volta che l'agarosio si è raffreddato a 41 gradi Celsius, incorporare il fegato utilizzando una siringa da cinque millilitri con un ago da 18 gauge. Dopo che l'agarosio si è raffreddato, utilizzare una spatola di Heideman per rimuovere l'eccesso ed esporre un campo visivo sufficientemente ampio per scansionare il fegato. Procedere quindi con la scansione.Dopo aver preparato il campo visivo, spostare il mouse sotto il microscopio per selezionare le aree di scansione appropriate per l'acquisizione di immagini in lapse temporale. Il tessuto epatico viene esaminato ad occhio nudo utilizzando una sorgente luminosa bianca esterna, identificando campi rappresentativi con flusso ematico sufficiente e minima perturbazione del campione. Topi eterozigoti CXCR six GFP sono stati sottoposti a imaging T-P-L-S-M intravitale come esperimento. Ad alcuni è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di tetracloruro per indurre un danno epatico acuto.Le cellule modello che esprimevano GFP sono state seguite mediante video e i loro percorsi sono stati sovrapposti per ottenere un'istantanea della mobilità cellulare. Successivamente, i percorsi sono stati normalizzati. I fegati normali presentavano cellule con schemi di migrazione casuali.Fegati iniettati con CCI quattro hanno mostrato un'alterazione della migrazione cellulare. Misurando lo spostamento totale rispetto all'origine, era evidente un intrappolamento cellulare 36 ore dopo il trattamento con CCI quattro nel sito del danno epatocellulare. L'alterazione della migrazione indotta dal danno epatico poteva essere dimostrata anche tracciando la velocità di migrazione delle singole cellule nel tempo, mostrando un arresto parziale dopo 18 ore e un arresto completo della migrazione dopo 36 ore.È stato possibile dimostrare che la riduzione della velocità delle cellule in migrazione è statisticamente significativa anche quando le cellule vengono confrontate come popolazioni. Pertanto, questo approccio è adatto per monitorare i cambiamenti nella migrazione e nel posizionamento cellulare durante lo sviluppo di una malattia epatica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare il fegato di un topo per la microscopia multifotonica intravitale.Il metodo che forniamo qui ci permette di stabilizzare l'animale per una sopravvivenza a lungo termine e di ridurre al minimo gli artefatti di movimento grazie al metodo di fissazione delicato che proponiamo. Una volta mascherato, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se effettuata correttamente. Durante questa procedura, è importante controllare i parametri vitali degli animali, stabilizzando temperatura, frequenza cardiaca, livelli di ossigeno e di CO2. Questo può essere ottenuto adattando la profondità della necrosi e della respirazione seguendo questa tecnica.Altre procedure come l'analisi mediante citometria a flusso o la microdissezione mediante cattura laser possono essere eseguite per rispondere a ulteriori domande, come il fenotipo delle cellule immunitarie infiltranti o i mediatori secreti dalle cellule tissutali o infiltranti dopo il loro sviluppo. Queste tecniche hanno permesso ai ricercatori di ottenere informazioni sulle dinamiche del traffico dei leucociti e sulle interazioni cellulari nel fegato, consentendo di analizzare la sequenza di eventi che portano alle malattie infiammatorie epatiche. Si prega di seguire le linee guida sulla sicurezza laser durante l’acquisizione di immagini mediante un laser infrarosso a impulsi ad alta energia utilizzato per la microscopia multifotonica.Assicurarsi che nessuna riflessione della radiazione laser possa rappresentare un pericolo per gli occhi e la pelle durante l'esecuzione di questo esperimento.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Descriviamo un metodo per la visualizzazione ripetutamente microglia murina e monociti...

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Questo articolo riporta un metodo dettagliato per la misurazione dinamica e la quantificazione della velocità del flusso sanguigno all'interno dei singoli vasi sanguigni del sistema vascolare epatico di topo utilizzando l'imaging al microscopio intravitale in combinazione con una metodologia specifica per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.

In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l'imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l'invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l'efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.

Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

In questo esperimento, un topo viene iniettato nella sua vena di coda con isotiocianato-dextran rhodamina B che può macchiare i vasi sanguigni. Dopo che il fegato è stato esposto e fissato, una parte specifica del fegato può essere selezionata per osservare il tessuto profondo nel corpo vivente utilizzando la microscopia multifotona.

Osservazione microscopica multifotona dei vasi nel tessuto epatico del topo

Questo protocollo descrive una tecnica cronica di impianto della finestra cranica che può essere utilizzata per l'imaging longitudinale di strutture neuro-glio-vascolari, interazioni e funzione sia in condizioni sane che malate. Serve come alternativa complementare all'approccio di imaging transcranico che, sebbene spesso preferito, possiede alcune limitazioni critiche.

Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

Qui, descriviamo una piattaforma che consente l'imaging non invasivo in vivo di sferoidi epatici innestati nella camera anteriore dell'occhio del topo. Il flusso di lavoro spazia dalla generazione di sferoidi da cellule epatiche primarie al trapianto nell'occhio di topo e all'imaging in vivo a risoluzione cellulare mediante microscopia confocale.

Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nella camera anteriore dell'occhio del topo

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.

Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Questo protocollo presenta una pipeline di imaging completa per visualizzare e modellare la morfologia delle cellule stellate epatiche nel tessuto epatico intatto. Questo approccio combina la marcatura fluorescente dei fibroblasti tramite genetica del topo, la preparazione tissutale in situ basata su perfusione epatica e un metodo modificato di pulizia dei tessuti iDISCO per ottenere trasparenza ottica.

Mappatura della morfologia delle cellule stellate epatiche nei modelli murini di fibrosi epatica

Scopri la microscopia multiphoton intravitale per studiare le cellule immunitarie nel fegato di topi reporter CXCR6.Gfp. Questo metodo consente l'imaging a lungo termine delle dinamiche dei leucociti.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter (Video) | JoVE Journal

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

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