Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di seguire la migrazione e l'interazione dei leucociti nella progressione della malattia infiammatoria epatica. Comprendere meglio la sequenza di eventi alla base del modo in cui queste cellule vengono reclutate nel tessuto epatico e il loro potenziale coinvolgimento nell'immunopatologia. Ciò si ottiene eseguendo prima una tracheotomia per ottenere il controllo della respirazione del topo, un passaggio cruciale per garantire la sopravvivenza a lungo termine dell'animale.

Come secondo passo, il topo viene laparotomio per esporre chirurgicamente il fegato, dando accesso all'organo con il microscopio multifotone. Successivamente, il fegato viene fissato e posizionato incorporandolo in un sale per ridurre al minimo gli artefatti di movimento. L'imaging può essere eseguito nell'arco di diverse ore, portando a sequenze time-lapse ad alta risoluzione che seguono i cambiamenti nel reclutamento, nel posizionamento e nell'interazione dei singoli leucociti.

Nel processo di sviluppo dell'infiammazione epatica, questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'infiammazione epatica acuta e cronica, come il reclutamento dei leucociti, le interazioni tra cellule cellulari o i meccanismi dell'immunopatologia. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla microscopia convenzionale è che la microscopia multifocale consente l'imaging a lungo termine praticamente senza perturbazione del campione con basso sbiancamento del puledro o fototossicità, nonché fette ottiche fino a 100 micrometri di profondità nel tessuto, e questo è dovuto alla fisica unica del laser della luce laser rossa lontana. Bene, questo metodo può fornire informazioni sulla malattia del fegato.

Può essere facilmente adottato ad altri sistemi. Poiché il metodo di stabilizzazione e fissaggio, il tessuto può essere applicato praticamente a tutte le questioni di microscopia intravitale, in modo da poter facilmente visualizzare organi come milza, reni o persino tumori sottocutanei utilizzando cellule correlate fluenti. È anche possibile visualizzare tutti i sottogruppi di leucociti e inviare le loro interazioni e l'infiammazione del fegato.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa dell'estrema complessità della chirurgia dei piccoli animali. Tuttavia, a causa della nostra esperienza, questo è solo un fattore limitante per un paio di settimane e richiede solo un po' di routine pratica A causa della fragilità del tessuto epatico, le fasi di preparazione sono difficili da imparare e la dimostrazione visiva del metodo è essenziale. Dopo aver impostato gli anestetici, riempire lo stadio aro del topo con il 3% di aros, versandolo con un angolo di 40 gradi.

Quindi assicurarsi che l'area di lavoro chirurgica sia completamente disinfettata, così come tutti gli strumenti necessari e così via. Quindi anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di un cocktail anestetico. Cinque minuti dopo, controlla i riflessi dell'animale, quindi disinfetta la pelle e applica un unguento oftalmico sugli occhi.

Ora, fissa il mouse al tavolo di preparazione. Usando del nastro adesivo, posizionalo in modo da esporre delicatamente il lato ventrale allungando delicatamente il collo. Un elastico agganciato agli incisivi può raggiungere questo obiettivo.

Ora, esegui l'incisione iniziale sotto il mento lunga circa 0,5-un centimetro. Quindi seziona con cura il tessuto connettivo tra le ghiandole salivari e trova il tubo muscolare che circonda la trachea. Strappare delicatamente il muscolo per esporre la trachea.

Tirare un filo sotto la trachea, quindi aprire la trachea con micro forbici utilizzando un'incisione a forma di T nell'incisione. Inserire il tubo di ventilazione di circa mezzo centimetro. Far avanzare il tubo utilizzando una piccola pinza anatomica.

Quindi fissare il tubo con punti di sutura. Quindi, per una maggiore sicurezza, sutura il tubo sulla pelle, sigilla l'incisione nella pelle usando cianoacrilato e fissa il tubo alla testa dell'animale. Utilizzando del nastro adesivo, mantenere l'anestesia utilizzando un flusso continuo di fluoro ISO al 2%.

Dopo aver preparato il topo per l'intervento chirurgico, praticare una piccola incisione cutanea sotto lo sterno ed estendere il taglio lateralmente sotto le costole su entrambi i lati. Cauterizzare tutti i vasi sanguigni esposti in questo processo. Per ridurre al minimo il sanguinamento, eseguire un piccolo taglio iniziale sul gomito lineare per accedere alla cavità addominale.

Estendere il taglio orizzontalmente, sigillando tutti i vasi sanguigni e dando accesso al fegato. Ora, trasferisci il mouse sul palco agricolo e impila le diapositive su entrambi i lati dell'animale per mantenerlo in posizione. Queste pile dovrebbero corrispondere all'altezza del topo in modo che il tavolino per il fegato, che verrà posizionato in seguito, non eserciti una pressione eccessiva sull'addome.

Ora, usando le suture nello sterno, ritrai le costole. Quattro punti di sutura zero saranno sufficienti Dopo aver retratto le costole, tagliare i legamenti che collegano il fegato e il diaframma tagliato fino all'aorta, ma lavorare con particolare cautela per non rompere o tagliare il vaso. Tagliare anche il legamento che collega il fegato e il tratto gastrointestinale.

Ruota il mouse di 45 gradi per migliorare l'accesso al lobo del fegato più grande. Prendi un vetrino coprioggetti standard e fissalo con del nastro adesivo lungo i bordi in modo che non sia affilato. Posizionalo sopra la cavità addominale.

Questo servirà come palcoscenico per il fegato per posizionare il fegato sul palco. Infilare con cautela una sonda stilo a doppia sfera o una spatola imbottita sotto il fegato e tenere la parte superiore dell'organo. L'uso di una pressione meccanica del tessuto umido danneggerà istantaneamente il tessuto epatico, quindi è essenziale maneggiare l'organo con cura.

Quindi sollevare il lobo sul carrello e tirarlo delicatamente in posizione. Il lobo di solito finisce piegato o piegato delicatamente cerca di aprire i bordi sollevando il tessuto con una spatola sottile o un fazzoletto umido. Successivamente, aggiungi supporti laterali sotto forma di vetrini coprioggetti o scivoli.

Impilare i vetrini coprioggetto in modo che abbiano la stessa altezza del lobo del fegato. La stadiazione e la fissazione del fegato è la fase più cruciale del protocollo. Qualsiasi stress meccanico, torsione o pressione porterà a danni tissutali istantanei o almeno a una compromissione del flusso sanguigno nei vasi sinusoidali.

Ora, metti un grande vetrino coprioggetti con i bordi nastrati sopra il lobo del fegato sostenuto dai supporti laterali. Posizionare questo vetrino coprioggetto il più in piano possibile. Non dovrebbe spremere il fegato.

Il tessuto bianco indica un flusso sanguigno alterato a meno che l'imaging non venga eseguito rapidamente. Ora è necessario inserire due cateteri intraperitoneali indipendenti per fornire un'anestesia a lungo termine e per applicare G five. Questi sono assemblati con aghi calibro 27 e tubi flessibili in silicone.

Quindi avviare il loro flusso utilizzando pompe a siringa. Inserire i cateteri nell'addome inferiore vicino agli arti posteriori. Dopo aver collegato i monitor vitali al mouse, preparare 100 millilitri di aros al 3% in un XPBS.

Quando l'aros si è raffreddato a 41 gradi Celsius, incorporare il fegato in esso utilizzando una siringa da cinque millilitri con un ago calibro 18. Una volta che l'aerodinamica si è raffreddata, usa una spatola Heideman per rimuovere l'eccesso ed esporre un campo visivo abbastanza grande da scansionare il fegato. Quindi procedere con la scansione.

Dopo aver preparato il campo visivo, spostare il mouse sotto il microscopio per selezionare le aree di scansione appropriate per l'imaging time lapse. Il tessuto epatico viene scansionato a occhio nudo utilizzando una sorgente di luce bianca esterna che identifica campi rappresentativi con un flusso sanguigno sufficiente e una minima perturbazione del campione CXCR Sei topi eterozigoti GFP sono stati sottoposti a imaging intravitale T-P-L-S-M come esperimento. Ad alcuni è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di tetracloruro per indurre danno epatico acuto.

Le cellule modali che esprimono GFP sono state tracciate da un video e le loro tracce sono state sovrapposte per ottenere un'istantanea della mobilità cellulare. Le tracce sono state quindi normalizzate. I fegati normali avevano cellule con modelli di migrazione casuali.

I fegati iniettati con CCI 4 hanno mostrato una compromissione della migrazione cellulare. Misurando lo spostamento totale dalla loro origine, era chiaro che c'era intrappolamento cellulare 36 ore dopo il trattamento con CCI 4 nel sito del danno epatocellulare. La compromissione della migrazione da parte del danno epatico potrebbe anche essere dimostrata tracciando la velocità di migrazione delle singole cellule nel tempo, mostrando un arresto parziale dopo 18 ore e un arresto migratorio completo dopo 36 ore.

La riduzione della velocità di migrazione delle cellule potrebbe anche essere dimostrata statisticamente significativa quando le cellule sono state confrontate come popolazioni. Pertanto, questo approccio è adatto per tracciare i cambiamenti nella migrazione cellulare e nel posizionamento nello sviluppo della malattia epatica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il fegato di un topo per la microscopia multi-foto intravitale.

Il metodo che forniamo qui ci consente di stabilizzare l'animale per la sopravvivenza a lungo termine e di ridurre al minimo gli artefatti di movimento grazie al metodo di fissazione delicata che forniamo. Una volta mascherata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente Durante questa procedura, è importante controllare i parametri vitali degli animali stabilizzando la temperatura, la frequenza cardiaca, l'ossigeno e i livelli di CO2. Ciò può essere ottenuto adattando la profondità della necrosi e della respirazione Seguendo questa tecnica.

Altre procedure come l'analisi della citometria a flusso o la microdissezione a cattura laser possono essere eseguite per rispondere a domande aggiuntive come il fenotipo delle cellule immunitarie infiltranti o dei mediatori secreti dal tessuto o dalle cellule infiltranti dopo il suo sviluppo. Queste tecniche hanno permesso ai ricercatori di ottenere informazioni sulle dinamiche del traffico leucocitario e delle interazioni cellulari nel fegato, consentendo di sezionare la sequenza di eventi che portano a malattie infiammatorie del fegato. Si prega di seguire le linee guida sulla sicurezza del laser eseguendo l'imaging con un laser a infrarossi a impulsi ad alta energia utilizzato per la microscopia multi-foto.

Assicurarsi che nessuna riflessione della radiazione laser possa causare pericolo agli occhi e alla pelle durante l'esecuzione di questo esperimento.