Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni
4 agosto 2015
Il seguente protocollo descrive la procedura per assemblare colture simili a sandwich da utilizzare come stadio intermedio tra ambienti cellulari bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D). I sistemi ingegnerizzati possono avere applicazioni in microscopia, biomeccanica, biochimica e saggi di biologia cellulare.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di assemblare colture simili a sandwich per studiare il comportamento cellulare all'interno di un ambiente 3D fisiologicamente più rilevante. Ciò si ottiene preparando e rivestendo prima i substrati ventrali e dorsali con proteine come la fibronectina. Successivamente, le cellule vengono posizionate in modo simile a una coltura 2D standard.
Quindi il substrato dorsale viene sovrapposto in modo che le cellule siano stimolate ventralmente e dorsalmente. Infine, è possibile eseguire esperimenti come un saggio di guarigione delle ferite. In definitiva, le colture sandwich vengono analizzate con procedure già sviluppate per colture 2D standard, come l'imaging dal vivo, l'immunofluorescenza o l'estrazione cellulare.
Per ulteriori analisi. Il vantaggio principale di questa tecnica colturale rispetto ai sistemi tridimensionali esistenti è che ha permesso lo studio di diversi parametri nelle interazioni dei materiali come la topografia, la chimica, la rigidità e il contenuto proteico sia nei siti ventrali che in quelli dorsali, offrendo un alto grado di versatilità. Oltre alle procedure sperimentali che potrebbero essere ostacolate per alcuni sistemi tridimensionali come la lipina, l'immunofluorescenza e le estrazioni cellulari sono facilmente eseguibili. Per produrre un film piatto di acido polilattico o PLLA mediante colata di solvente che lavora in una cappa aspirante, aggiungere due grammi di PLLA a 100 millilitri di cloroformio e mescolare a temperatura ambiente per circa tre ore o fino a completa dissoluzione.
Posizionare le rondelle in acciaio inossidabile su una capsula di Petri di vetro. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione PLLA nelle rondelle. Utilizzare un foglio di alluminio con alcuni fori per coprire il piatto e lasciare evaporare lentamente il PLLA a temperatura ambiente per 30 minuti.
Successivamente, riscaldare i campioni a 120 gradi Celsius per cinque minuti in modo da far evaporare eventuali tracce di solvente. Quindi, dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente per circa 30 minuti, utilizzare 18,2 mega ohm di centimetri di acqua per coprire i campioni nella piastra e incubare a temperatura ambiente per otto minuti. Dopo l'incubazione, usa una lama di rasoio per staccare le rondelle dalla capsula di Petri.
Quindi utilizzare una pinzetta per rimuovere eventuali imperfezioni dal bordo delle rondelle e lasciare asciugare i campioni all'aria. Poiché il PLLA è degradabile mediante stoccaggio per idrolisi, i campioni in vuoto si essiccano fino al giorno degli esperimenti. Inoltre, le fibre ELLA possono essere prodotte secondo il protocollo di testo ed essere utilizzate come substrato dorsale sotto una cappa di coltura sterile.
Aggiungere 20 microgrammi per millilitro di FI nin in docos PBS o DPBS con calcio e magnesio ai campioni e incubare a temperatura ambiente per un'ora dopo il rivestimento proteico. Utilizzare DPBS per lavare i campioni due volte e conservarli in DPBS con P, calcio e magnesio fino al momento dell'uso, le cellule del seme successive sul coperchio di vetro scivolano e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire alle cellule di aderire al substrato ventrale. Quindi trasferire i campioni in nuovi pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.
Usando una pinzetta, sovrapponi con cura il substrato dorsale sulle cellule. Quindi aggiungere un millilitro di terreno. Il peso della rondella impedirà al substrato dorsale di galleggiare.
Riportare i campioni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, cambiando il terreno due volte alla settimana per studiare la migrazione cellulare all'interno della coltura simile a un sandwich. Dopo aver rivestito i substrati ventrali e dorsali con fibronectina come dimostrato in precedenza, le cellule seme su vetrine scivolano ad alta densità, incubano i campioni e consentono alle cellule di raggiungere la confluenza. Quindi, utilizzare la punta di una pipetta per graffiare il monostrato cellulare in modo da creare due popolazioni cellulari separate da uno spazio vuoto.
Posizionare il substrato posizionato ventrale in un nuovo pozzetto adatto per l'acquisizione time-lapse e abbastanza grande da consentire l'inserimento dei substrati dorsali all'interno. Quindi, con una pinzetta, come precedentemente dimostrato, sovrapporre il substrato dorsale sulle cellule e riempire con il terreno. Posizionare il campione sotto un microscopio time lapse e acquisire immagini della chiusura dello spazio ogni 20 minuti.
Utilizzare software come mito BO di Image J per analizzare la chiusura dello spazio nel sandwich. Come la cultura. Il solfato dipende fortemente dal tempo in cui i recettori dorsali vengono stimolati e dalle proprietà dell'interazione dorsale.
Simile ad altri sistemi 3D come gli idrogel, ad esempio, come si vede qui, le fibre PLLA elettrofilate dorsali dirigono l'allineamento cellulare quando sono rivestite con fibronectina, ma non quando sono rivestite con una proteina non adesiva come la BSA. Inoltre, le colture a sandwich con PLLA dorsale semplice hanno innescato un aumento del livello di miogenesi utilizzando cellule C 2 C 12. Questo dipende anche dagli stimoli biologici dorsali.
Poiché l'interazione con diverse proteine dorsali si traduce in tassi di differenziazione distinti, come dimostrato in questo video, i fibroblasti che migrano all'interno del sandwich come coltura in un test di guarigione delle ferite, adottano una morfologia allungata e migrano su distanze più brevi rispetto alle cellule. Coltivato su substrati 2D simili a fibronectina 3D e gel di collagene. La coltura a sandwich aumenta la riorganizzazione della ECM cellulo-mediata rispetto alle condizioni 2D.
Questo processo si basa sugli stimoli meccanici dorsali e sulla stabilità del citoscheletro. Poiché l'uso di inibitori della contrattilità come i BLE, le statine hanno ostacolato il processo S Okay, quindi dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come assemblare colture simili a sandwich. Questo metodo può progettare microambienti 3D per la medicina reattiva e il cancro, comprese le applicazioni in modelli di malattia, studi di sviluppo e test di farmaci.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'assemblaggio di colture a sandwich per collegare ambienti cellulari 2D e 3D. Questi sistemi ingegnerizzati sono applicabili in vari saggi biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Chimica biologica
- Microscopia
Sfondo
- Le colture di tipo sandwich offrono un ambiente più fisiologicamente rilevante per lo studio del comportamento cellulare.
- Queste colture permettono una stimolazione doppia delle cellule sia dal lato ventrale che da quello dorsale.
- Le tecniche standard di coltura 2D possono essere adattate per questi sistemi.
- Le applicazioni includono saggi di guarigione delle ferite e imaging in tempo reale.
Scopo dello studio
- Creare un ambiente 3D più pertinente per studi cellulari.
- Analizzare il comportamento cellulare in condizioni di stimolazione doppia.
- Facilitare l'uso di tecniche di analisi 2D consolidate in un contesto 3D.
Metodi Utilizzati
- Preparazione e rivestimento dei substrati con proteine come la fibronectina.
- Piastramento delle cellule simile alle colture standard in 2D.
- Ricopertura del substrato dorsale per stimolare le cellule.
- Esecuzione di saggi come la guarigione della ferita e l'immagine in tempo reale.
Risultati principali
- Assemblaggio riuscito di colture a sandwich.
- Dimostrati effetti di stimolazione duale sul comportamento cellulare.
- Adattamento di metodi di analisi 2D a colture 3D.
- Conoscenze approfondite sulle risposte cellulari in un ambiente più complesso.
Conclusioni
- Le colture di tipo sandwich migliorano lo studio del comportamento cellulare.
- Questi sistemi possono colmare il divario tra ambienti 2D e 3D.
- Ulteriori applicazioni in vari saggi biologici sono promettenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Le colture di tipo sandwich affrontano il divario traduttivo tra modelli 2D eccessivamente semplificati e sistemi 3D complessi, consentendo una stimolazione recettoriale bilaterale. Questo approccio aumenta la rilevanza fisiologica mantenendo al contempo la compatibilità con i flussi di lavoro analitici 2D consolidati. Supporta la riduzione precoce dei rischi meccanicistici nella validazione del target e nello screening fenotipico, fornendo microambienti regolabili che imitano le interazioni della matrice extracellulare in vivo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la stimolazione simultanea dei recettori ventrali e dorsali, chiarificando il contributo specifico delle vie di segnalazione.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio funzionale del target isolando le variabili del microambiente che influenzano il comportamento cellulare in un formato controllato e riproducibile.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nell'interazione con il target spostando il comportamento cellulare verso fenotipi simili a quelli tridimensionali, migliorando la corrispondenza con le risposte in vivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Consente lo screening sistematico delle proprietà dei materiali (topografia, rigidità, rivestimento proteico) su entrambe le superfici ventrale e dorsale per identificare le interfacce bioattive ottimali.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi sfruttando letture compatibili con la 2D (ad esempio, guarigione della ferita, immunofluorescenza) senza richiedere protocolli specializzati di imaging 3D o di estrazione.
- Scalabilità: Permette il test parallelo di variazioni del substrato dorsale in condizioni ventrali costanti, supportando campagne di screening a medio rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la fase di scoperta a quella preclinica mantenendo una coerenza analitica dallo screening in 2D alla valutazione fenotipica rilevante per i modelli in 3D.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità negli studi di modulazione del bersaglio controllando gli apporti microambientali dorsali che potrebbero alterare l'interpretazione di stimoli esclusivamente ventrali.
- Rilevanza del modello di malattia: Favorisce la modellizzazione delle interazioni stromali-epiteliali nella fibrosi o nel cancro, dove segnali bidirezionali influenzano gli esiti fenotipici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta potenziando i saggi di validazione del bersaglio e consentendo studi sulle relazioni struttura-attività nelle interazioni tra biomateriali e cellule prima dell'identificazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardanti la segnalazione degli integrini, la meccanotrasduzione e il rimodellamento della matrice, regolando in modo indipendente i segnali ventrali e dorsali.
- Screening: Fornisce output fenotipici quantitativi e riproducibili (ad esempio velocità di migrazione, allineamento, riorganizzazione della matrice extracellulare) compatibili con piattaforme di imaging ad alto contenuto.
- Analisi: Genera variabili dipendenti misurabili, come i tassi di chiusura degli interstizi e l'organizzazione del citoscheletro, che consentono confronti statistici tra diverse condizioni dei materiali.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità con studi preclinici producendo fenotipi cellulari (ad esempio morfologia allungata, migrazione diretta) osservati in matrici tridimensionali come i gel di collagene.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma modulare adattabile a diversi tipi cellulari e rivestimenti proteici, riducendo la necessità di riconvalida durante l'esplorazione di nuovi bersagli o biomateriali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo i falsi positivi derivanti da modelli semplificati di stimolazione solo ventrale.
- Valore operativo: Aumenta la riproducibilità e la standardizzazione consentendo l'uso di protocolli consolidati in 2D per il seeding, la colorazione e l'acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Informa decisioni di avanzamento o interruzione del progetto in fasi precedenti del processo, rivelando l'efficacia dell'obiettivo dipendente dal microambiente, che potrebbe essere trascurata in modelli 2D.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei target o dei biomateriali aggiustata in base al rischio, basata sulle prestazioni in condizioni di stimolazione doppia che riflettono meglio la complessità del tessuto.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nel rivestimento proteico e nell'ingegneria del microambiente per garantire una stimolazione dorso-ventrale costante.
- È subordinato all'accesso a strumentazione per la formatura da soluzione e a cappe sterili per la fabbricazione di substrati dorsali riproducibili (ad esempio, film o fibre di PLLA).
- Necessita della standardizzazione delle concentrazioni di rivestimento proteico e dei tempi di incubazione su entrambe le superfici, ventrale e dorsale, per evitare variabilità fuorviante.
- Richiede considerazioni adattative quando si estende a biomateriali non adesivi o rapidamente degradabili, che potrebbero compromettere l'integrità del substrato dorsale.
- È limitato dalla necessità di trasparenza ottica nei substrati dorsali per l'analisi successiva mediante imaging, restringendo l'uso di materiali opachi o fortemente diffusivi.
