Microambienti sandwich di sfruttare Cellulari / Materiale Interazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di assemblare colture simili a sandwich per studiare il comportamento cellulare all'interno di un ambiente 3D fisiologicamente più rilevante. Ciò si ottiene preparando e rivestendo prima i substrati ventrali e dorsali con proteine come la fibronectina. Successivamente, le cellule vengono posizionate in modo simile a una coltura 2D standard.

Quindi il substrato dorsale viene sovrapposto in modo che le cellule siano stimolate ventralmente e dorsalmente. Infine, è possibile eseguire esperimenti come un saggio di guarigione delle ferite. In definitiva, le colture sandwich vengono analizzate con procedure già sviluppate per colture 2D standard, come l'imaging dal vivo, l'immunofluorescenza o l'estrazione cellulare.

Per ulteriori analisi. Il vantaggio principale di questa tecnica colturale rispetto ai sistemi tridimensionali esistenti è che ha permesso lo studio di diversi parametri nelle interazioni dei materiali come la topografia, la chimica, la rigidità e il contenuto proteico sia nei siti ventrali che in quelli dorsali, offrendo un alto grado di versatilità. Oltre alle procedure sperimentali che potrebbero essere ostacolate per alcuni sistemi tridimensionali come la lipina, l'immunofluorescenza e le estrazioni cellulari sono facilmente eseguibili. Per produrre un film piatto di acido polilattico o PLLA mediante colata di solvente che lavora in una cappa aspirante, aggiungere due grammi di PLLA a 100 millilitri di cloroformio e mescolare a temperatura ambiente per circa tre ore o fino a completa dissoluzione.

Posizionare le rondelle in acciaio inossidabile su una capsula di Petri di vetro. Quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione PLLA nelle rondelle. Utilizzare un foglio di alluminio con alcuni fori per coprire il piatto e lasciare evaporare lentamente il PLLA a temperatura ambiente per 30 minuti.

Successivamente, riscaldare i campioni a 120 gradi Celsius per cinque minuti in modo da far evaporare eventuali tracce di solvente. Quindi, dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente per circa 30 minuti, utilizzare 18,2 mega ohm di centimetri di acqua per coprire i campioni nella piastra e incubare a temperatura ambiente per otto minuti. Dopo l'incubazione, usa una lama di rasoio per staccare le rondelle dalla capsula di Petri.

Quindi utilizzare una pinzetta per rimuovere eventuali imperfezioni dal bordo delle rondelle e lasciare asciugare i campioni all'aria. Poiché il PLLA è degradabile mediante stoccaggio per idrolisi, i campioni in vuoto si essiccano fino al giorno degli esperimenti. Inoltre, le fibre ELLA possono essere prodotte secondo il protocollo di testo ed essere utilizzate come substrato dorsale sotto una cappa di coltura sterile.

Aggiungere 20 microgrammi per millilitro di FI nin in docos PBS o DPBS con calcio e magnesio ai campioni e incubare a temperatura ambiente per un'ora dopo il rivestimento proteico. Utilizzare DPBS per lavare i campioni due volte e conservarli in DPBS con P, calcio e magnesio fino al momento dell'uso, le cellule del seme successive sul coperchio di vetro scivolano e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire alle cellule di aderire al substrato ventrale. Quindi trasferire i campioni in nuovi pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.

Usando una pinzetta, sovrapponi con cura il substrato dorsale sulle cellule. Quindi aggiungere un millilitro di terreno. Il peso della rondella impedirà al substrato dorsale di galleggiare.

Riportare i campioni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, cambiando il terreno due volte alla settimana per studiare la migrazione cellulare all'interno della coltura simile a un sandwich. Dopo aver rivestito i substrati ventrali e dorsali con fibronectina come dimostrato in precedenza, le cellule seme su vetrine scivolano ad alta densità, incubano i campioni e consentono alle cellule di raggiungere la confluenza. Quindi, utilizzare la punta di una pipetta per graffiare il monostrato cellulare in modo da creare due popolazioni cellulari separate da uno spazio vuoto.

Posizionare il substrato posizionato ventrale in un nuovo pozzetto adatto per l'acquisizione time-lapse e abbastanza grande da consentire l'inserimento dei substrati dorsali all'interno. Quindi, con una pinzetta, come precedentemente dimostrato, sovrapporre il substrato dorsale sulle cellule e riempire con il terreno. Posizionare il campione sotto un microscopio time lapse e acquisire immagini della chiusura dello spazio ogni 20 minuti.

Utilizzare software come mito BO di Image J per analizzare la chiusura dello spazio nel sandwich. Come la cultura. Il solfato dipende fortemente dal tempo in cui i recettori dorsali vengono stimolati e dalle proprietà dell'interazione dorsale.

Simile ad altri sistemi 3D come gli idrogel, ad esempio, come si vede qui, le fibre PLLA elettrofilate dorsali dirigono l'allineamento cellulare quando sono rivestite con fibronectina, ma non quando sono rivestite con una proteina non adesiva come la BSA. Inoltre, le colture a sandwich con PLLA dorsale semplice hanno innescato un aumento del livello di miogenesi utilizzando cellule C 2 C 12. Questo dipende anche dagli stimoli biologici dorsali.

Poiché l'interazione con diverse proteine dorsali si traduce in tassi di differenziazione distinti, come dimostrato in questo video, i fibroblasti che migrano all'interno del sandwich come coltura in un test di guarigione delle ferite, adottano una morfologia allungata e migrano su distanze più brevi rispetto alle cellule. Coltivato su substrati 2D simili a fibronectina 3D e gel di collagene. La coltura a sandwich aumenta la riorganizzazione della ECM cellulo-mediata rispetto alle condizioni 2D.

Questo processo si basa sugli stimoli meccanici dorsali e sulla stabilità del citoscheletro. Poiché l'uso di inibitori della contrattilità come i BLE, le statine hanno ostacolato il processo S Okay, quindi dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come assemblare colture simili a sandwich. Questo metodo può progettare microambienti 3D per la medicina reattiva e il cancro, comprese le applicazioni in modelli di malattia, studi di sviluppo e test di farmaci.