Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esprimere proteine di interesse marcate in fluorescenza all'interno di cellule di insetti disponibili in commercio per una migliore chiarificazione della funzione proteica e/o del traffico cellulare delle proteine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave basate sulla biologia cellulare e sulla biochimica riguardanti la funzionalità delle proteine, le interazioni proteiche e/o la localizzazione delle proteine subcellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i costrutti possono essere rapidamente generati e le proteine espresse possono essere valutate funzionalmente in cellule vive senza effetti deleteri associati all'espressione del baculovirus, migliorando così la produttività.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni nello studio delle proteine degli insetti, può anche essere applicato a qualsiasi sistema per il quale si desidera lo studio della funzione proteica o della localizzazione cellulare. A dimostrare la procedura per la coltura e la trasfezione di cellule di insetti sarà Danni LeRoy, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, rimuovere le fiale di scorta di cellule SF9 e Tni congelate dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e lasciarle scongelare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.

Dopo lo scongelamento, decontaminare le fiale con etanolo al 70% e metterle sul ghiaccio. Tutte le manipolazioni cellulari che richiedono l'apertura di fiale e fiasche di coltura tissutale devono essere eseguite all'interno di una cappa a flusso laminare per mantenere le condizioni di sterilità. Aggiungere quattro millilitri di terreno per insetti privo di siero a un nuovo pallone T25 e quattro millilitri di terreno TNM-FH a un altro pallone T25.

Trasferire un millilitro di cellule di Tni scongelate nel pallone con terreno di coltura per insetti privo di siero e un millilitro di cellule di SF9 scongelate nel pallone con terreno TNM-FH. Mettere i palloni in un'incubatrice non umidificata a 28 gradi Celsius e lasciare che le cellule si attacchino per 30-45 minuti. Sostituire il terreno di semina con cinque millilitri del terreno appropriato.

E rimetti le borracce nell'incubatrice non umidificata a 28 gradi Celsius. Monitora quotidianamente la confluenza cellulare. Passa le cellule quando raggiungono il 90% di confluenza, come mostrato da queste immagini rappresentative.

Inclinare il pallone contenente le cellule confluenti in modo che il terreno fluisca verso un angolo lontano dal monostrato cellulare e utilizzare una pipetta sierologica sterile da cinque millilitri per rimuovere con cura il terreno senza disturbare le cellule. Per le cellule Tni, utilizzare una nuova pipetta sierologica sterile da cinque millilitri per aggiungere delicatamente quattro millilitri di terreno per insetti privo di siero sul monostrato confluente. Spostare la punta della pipetta sul pallone e irrigare lentamente per rimuovere le cellule attaccate al fondo del pallone.

Per verificare il distacco adeguato delle cellule, rimuovere tutti i terreni, capovolgere il pallone e osservare che il fondo del pallone sia sgombro. Per le cellule SF9, che aderiscono più strettamente, aggiungere quattro millilitri di terreno TNM-FH fresco e utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule attaccate. Utilizzare una pipetta sierologica da cinque millilitri per mescolare delicatamente e ridurre l'aggregazione cellulare.

Dopo aver staccato le cellule, trasferire circa 0,1 millilitri di ciascuna cellula e miscela di terreno in una provetta micro-fuga da 1,5 millilitri. In una provetta separata da 0,5 millilitri, aggiungere 10 microlitri di ciascuna cellula e una miscela media a 10 microlitri di blu di tripano. Rimuovere il vetrino della controcamera cellulare dalla confezione e aggiungere 10 microlitri della miscela di tripano blu del terreno cellulare su ciascun lato del vetrino di conteggio.

Inserire il vetrino in un contatore di cellule automatizzato e determinare la densità e la vitalità delle cellule. Trasferire da una a 1,5 volte 10 celle alla 6a cella in palloni T25 con terreno fresco. Etichettare i flaconi con la linea cellulare, la data, il terreno utilizzato, il numero di cellule aggiunte e il numero di passaggio.

Metti i palloni in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per un massimo di 72 ore. Anche la procedura per la trasfezione di cellule di insetto deve essere eseguita all'interno di una cappa a flusso laminare. Seminare un pallone T25 con un massimo di una volta per 10 alla 6a cellula Tni o SF9 in un terreno di coltura per insetti appropriato.

Le celle Tni vengono utilizzate in questa dimostrazione. Far crescere le cellule fino alla confluenza per 72 ore a 18 gradi Celsius. 72 ore dopo, rimuovere e scartare il vecchio terreno e rimuovere le cellule Tni con quattro millilitri di terreno di coltura per insetti fresco privo di siero, come mostrato in precedenza.

L'aspetto più difficile di questa procedura è ottenere la densità appropriata di cellule attaccate alle piastre con fondo di vetro durante la trasfezione. Non più di sette volte 10 alla 5a cella devono essere aggiunte a ciascun piatto. Dopo aver utilizzato un contatore di cellule automatizzato per stimare la densità cellulare, mescolare accuratamente ma delicatamente la sospensione cellulare capovolgendo il tubo e aggiungere circa sette volte 10 alla quinta cella in singole piastre con fondo di vetro da 35 millimetri.

Lasciare che le celle si attacchino per 20-25 minuti a 28 gradi Celsius. Per ogni trasfezione, aggiungere due microgrammi di DNA plasmidico a 0,1 millilitri di terreno per insetti privo di siero senza FBS in una provetta sterile da 1,5 millilitri. In una provetta separata, mescolare otto microlitri di reagente di trasfezione con 0,1 millilitri di terreno per insetti privo di siero.

Quindi trasferire la soluzione nella provetta contenente il DNA plasmidico di interesse. Agitare leggermente e incubare a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Successivamente, diluire la miscela di trasfezione plasmidica con 0,8 millilitri di terreno per insetti privo di siero, portando il volume totale fino a un millilitro.

Rimuovere con cautela il supporto dalla capsula di vetro contenente le celle attaccate. Sovrapporre le cellule attaccate con il mezzo di trasfezione plasmidico diluito. Incubare le cellule a 28 gradi Celsius per cinque ore.

Dopo cinque ore, rimuovere e scartare il terreno di trasfezione e lavare delicatamente le cellule con un millilitro di terreno di coltura per insetti privo di siero, facendo attenzione a non rimuovere le cellule. Aggiungere due millilitri di terreno di coltura di cellule di insetto fresco privo di siero e incubare a 28 gradi Celsius per 48-72 ore. Da 48 a 72 ore dopo la trasfezione delle cellule dell'insetto, lavare le cellule una volta con un millilitro di terreno per insetti IPL-41 e poi coprire con due millilitri di IPL-41 per l'imaging.

Aggiungere quattro gocce di reagente per la colorazione di cellule vive Hoechst al terreno e incubare a 28 gradi Celsius per 20-25 minuti. Posizionare il piatto da 35 millimetri nel microscopio confocale a scansione laser autochiuso. Sebbene molte piastre di vetro siano disponibili in commercio, è importante che si adattino al tavolino del microscopio e potrebbe essere necessario determinare empiricamente quale vetreria è più compatibile con l'attacco cellulare.

Regolare il microscopio per le condizioni di osservazione di Hoechst, EGFP e mCherry. 359 nanometri e 461 nanometri per l'eccitazione e l'emissione di Hoechst. 489 nanometri e 510 nanometri per l'eccitazione e l'emissione di EGFP.

E 580 nanometri e 610 nanometri per l'eccitazione e l'emissione di mCherry. Utilizzando un obiettivo 10X, eseguire una scansione iniziale per confermare l'espressione fluorescente. Successivamente, passa alla modalità di scansione utilizzando un obiettivo a immersione in acqua a contrasto di fase 60X.

Regola la potenza del laser, la sensibilità del rivelatore, la velocità di scansione, la profondità dell'asse Z e lo zoom digitale per ottimizzare il contrasto e la risoluzione dell'immagine. Immagine delle celle con zoom digitale 1,5X per ottenere un'amplificazione totale di 90X. Salvate ed esportate i dati grezzi come file immagine TIFF per un'analisi successiva.

cellule Tni sono state trasfettate con i plasmidi indicati e l'espressione delle proteine ricombinanti è stata visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale. Il successo della trasfezione e dell'espressione di BtDrip1-EGFP ricombinante è evidente dalla presenza di fluorescenza verde sulla superficie della cellula. Le cellule trasfettate con BtDrip2 versione uno EGFP mostrano una fluorescenza verde all'interno, indicando l'espressione intracellulare di BtDrip2 versione uno.

Allo stesso modo, le cellule trasfettate con PIB DmSPR-mCherry o PIB PLA2G15-mCherry mostrano una fluorescenza rossa che indica l'espressione delle rispettive chimere. Nelle immagini unite, le aree arancioni o gialle indicano l'espressione sia di EGFP che di mCherry, il che suggerisce che le proteine sono co-localizzate all'interno delle stesse strutture subcellulari. Una sovrapposizione di cellule doppiamente trasfettate con PIB BtDrip1-EGFP e PIB DmSPR-mCherry suggerisce la co-localizzazione di BtDrip1-EGFP e DmSPR-mCherry sulla superficie della cellula.

Le cellule trasfettate due volte con BtDrip2 versione uno, EGFP e PIB DmSPR-mCherry mostrano una scarsa co-localizzazione dei segnali di fluorescenza verde e rosso, confermando l'espressione intracellulare di BtDrip2 versione uno. Al contrario, la co-espressione di PIB, BtDrip2, versione uno, EGFP e del marcatore lisosomiale PIB PLA2G15-mCherry ha determinato una significativa sovrapposizione dei segnali fluorescenti citoplasmatici verdi e rossi. Ciò suggerisce fortemente che BtDrip2 è traffico verso i lisosomi intercellulari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere le chimere proteiche fluorescenti all'interno di cellule di insetti in coltura. Questo sistema offre una rapida costruzione di vettori nella sintesi proteica, evita le sfide dei sistemi di espressione basati sui virus e fornisce un mezzo robusto per osservare le proteine del traffico cellulare.