Isolamento e caratterizzazione dei modelli organoidi dell'adenocarcinoma duttale pancreatico derivato dal paziente

Le colture organoidi derivate dal paziente dell'adenocarcinoma duttale pancreatico sono un modello tridimensionale rapidamente stabilito che rappresenta i compartimenti delle cellule tumorali epiteliali con alta fedeltà, consentendo la ricerca traslazionale in questa malignità letale. Qui, forniamo metodi dettagliati per stabilire e propagare gli organoidi, nonché per eseguire saggi biologici pertinenti utilizzando questi modelli.

Questo metodo è significativo perché i modelli organoidi derivati dal paziente sono uno strumento potente e rapido per studiare il cancro al pancreas in quanto riflettono l'eterogeneità genetica e fenotipica di questa malattia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli organoidi possono essere isolati con un alto tasso di successo da una quantità limitata di cancro e possono essere espansi rapidamente in vitro per l'analisi a valle. Studiare la risposta degli organoidi ai farmaci citotossici può aiutarci a capire perché i tumori diventano resistenti alla terapia e a definire strategie di trattamento più efficaci.

Per iniziare questa procedura, recuperare la piastra preparata da 12 pozzi dall'incubatore. Con un sollevatore a celle sterile, sollevare delicatamente la cupola di estrazione della membrana basale in modo che galleggia nel supporto completo assicurandosi di evitare di raschiare il fondo del pozzo. Utilizzando una pipetta P1000, trasferire accuratamente la cupola BME e il supporto su un tubo conico da 15 millilitri.

Ripetere questo passaggio per ogni pozzo contenente organoidi. Lavare delicatamente ogni pozzo raccolto con un millilitro di mezzi basali freddi e trasferire questo lavaggio sul tubo contenente gli organoidi. Mescolare accuratamente la soluzione e gli organoidi con una pipetta P1000 e girare verso il basso a 200 volte g per cinque minuti.

Uno strato di BME contenente organoidi in sospensione e un pellet organoide apparirà nella parte inferiore del tubo. Rimuovere con cura il supernatante assicurandosi di evitare qualsiasi perdita del BME e dello strato organoide. Metti il tubo sul ghiaccio.

Aggiungere 10 millilitri di soluzione di recupero delle celle fredde di ghiaccio al tubo e mescolare accuratamente per inversione. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti mescolando ogni tre minuti per inversione. Dopo questo, centrifuga a 200 volte g per cinque minuti.

Il pellet organoide dovrebbe essere evidente mentre lo strato di BME dovrebbe essere sparito. Se lo strato di BME è di dimensioni ridotte ma ancora visibile, incubare per altri 30 minuti a quattro gradi Celsius e ripetere la centrifugazione. Una volta che il BME è stato depolimerizzato, rimuovere la soluzione di recupero cellulare lasciandosi alle spalle il pellet organoide.

Lavare gli organoidi con 10 millilitri di mezzi basali mescolando con inversione. Centrifugare a 200 volte g per cinque minuti, rimuovere il supernatante e posizionare il tubo con il pellet organoide sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Facoltativamente, se si desidera una preparazione a singola cella, aggiungere tre millilitri di tripina integrati con 30 microlitri di soluzione DNAsi I agli organoidi.

Incubare questa reazione enzimatica a 37 gradi Celsius con una leggera miscelazione dell'inversione ogni due minuti per un massimo di 10 minuti. Utilizzare un microscopio Brightfield per monitorare e confermare che la dissociazione a singola cella ha esito positivo. Per fermare la reazione enzimatica, aggiungere 10 millilitri di mezzi basali ghiacciati freddi e girare verso il basso a 200 volte g per cinque minuti.

Quindi rimuovere il supernatante. Lavare le cellule con 10 millilitri di mezzi basali mescolando con un'inversione delicata. Centrifugare di nuovo a 200 volte g per cinque minuti.

Rimuovere il supernatante e ripetere nuovamente questo processo di lavaggio e centrifugazione. Posizionare il tubo con il pellet di cella sul ghiaccio per almeno cinque minuti. Successivamente, aggiungere bme ghiacciato al pellet cellulare e utilizzare una pipetta P200 per mescolare delicatamente la soluzione fino a quando non è omogenea.

Quindi posizionare la punta della pipetta vicino al fondo del tubo e pipettare su e giù almeno da cinque a 10 volte per rompere meccanicamente gli organoidi. Utilizzare una pipetta P200 per individuare una cupola da 100 microliter al centro di un pozzo di una piastra pre-riscaldata da 12 pozzetto. Ripetere fino a quando tutta la soluzione BME non viene erosa.

Quindi trasferire con cura la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per consentire al gel BME di solidificarsi. Dopo 10 minuti, recuperare la piastra e aggiungere un millilitro di supporto completo organoide pre-riscaldato ad ogni pozzo. Le colture organoidi sono tipicamente passo su sette-10 giorni a seconda della densità e proliferazione della coltura.

Se necessario, ricaricare le colture con 200 microlitri di supporti completi organoidi preri riscaldati ogni cinque giorni per compensare l'esaurimento e l'evaporazione del fattore di crescita. Dopo aver isolato singole cellule dagli organoidi, rimorsi le singole cellule in un millilitro di mezzi completi organoidi umani. Utilizzare quindi un contatore di celle automatico per contare le celle assicurandosi di registrare la vitalità della cella.

Calcolare il numero totale di cellule e cellule vitali presenti nella sospensione di un millilitro. Quindi rimuovere il volume equivalente a 400.000 celle e trasferirlo in un nuovo tubo. Aggiungere supporti completi organoidi a questo tubo per portare il volume a 7,2 millilitri.

Per i test terapeutici, preparare le cellule per la placcatura mescolando 800 microlitri di BME con 7,2 millilitri di mezzi completi organoidi contenenti le cellule sul ghiaccio. Trasferire la miscela in un serbatoio tenuto sul ghiaccio e utilizzare una pipetta a 12 canali per placcare 20 microlitri di questa miscela in ogni pozzo di una piastra da 384 porri con conseguente placcazione di circa 1.000 celle per pozzo. Quindi girare il piatto a 100 volte g per un minuto in un secchio oscillante e posizionare il piatto in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius.

Dopo 24 ore, utilizzare un microscopio Brightfield per verificare la presenza di organoidi. In questo studio, l'organoide PDAC derivato dal paziente è isolato, espanso e caratterizzato. Per illustrare le sfide associate all'isolamento degli organoidi dal PDAC, viene stabilita una coltura organoide rappresentativa derivata dal paziente da un piccolo campione di tumore ipocellulare.

Gli organoidi sono autorizzati a crescere più grandi nell'arco di due settimane e vengono passaggi secondo il protocollo per stabilire una cultura più robusta. Le singole cellule di un organoide PDAC rappresentativo stabilito e in rapida crescita sono quindi pronte a dimostrare l'esito del protocollo di farmacotipizzazione. 1.000 cellule vitali sono placcate in ogni pozzo e possono riprendersi per un periodo di 24 ore prima che gli agenti chemioterapici citotossici siano dosati.

Un saggio di dose 9.0 viene eseguito in triplice copia a partire da una bassa dose di 100 picomolare e terminando con una dose elevata di due micromolari. Dopo un trattamento di cinque giorni, vengono scattate foto rappresentative per i pozzi trattati con il veicolo e con l'alta dose di ogni agente chemioterapico. Immediatamente dopo aver scattato le foto, la vitalità cellulare viene valutata utilizzando il reagente di vitalità cellulare luminescente e tracciata utilizzando il software di grafica.

Gli organoidi derivati dal paziente possono avere morfologie eterogenee. Pertanto, è importante ottimizzare le dissociazioni enzimatiche per ogni singola cultura. L'analisi a valle dei modelli derivati dal paziente di solito comporta il sequenziamento di nuova generazione del DNA e dell'RNA.

Se possibile, convalidare le caratteristiche molecolari dei modelli utilizzando campioni di tessuto primario. Le colture organoidi individualizzate aprono la possibilità di approcci di medicina personalizzati per i pazienti con cancro al pancreas. Ricorda che le sostanze chimiche pericolose come il fenolo-cloroformio e gli agenti chemioterapici devono essere maneggiate con DPI e attrezzature di sicurezza adeguati.