Isolamento e caratterizzazione di cellule satelliti da muscoli Rat Capo Branchiomeric

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule satelliti dai muscoli rappresentativi originati dal primo, secondo e quarto arco brachiale per la loro coltura su una matrice extracellulare. Macchie di gel. Ciò si ottiene sezionando prima i muscoli del massacro, del digastrico e della levada vli palatina di un giovane ratto adulto.

Nella seconda fase, le cellule satelliti di ciascun campione muscolare vengono isolate per enzima, digestione e durata. Le cellule vengono quindi coltivate sui gel della matrice extracellulare. In definitiva, lo stato dinamico della miogenesi delle colture cellulari satelliti può essere monitorato attraverso la colorazione per i marcatori muscolari di interesse.

La labiopalatoschisi è una delle malformazioni craniofacciali più comuni nell'uomo. Quando è presente una schisi, è necessaria la riparazione chirurgica al fine di chiudere il difetto e consentire un normale sviluppo del linguaggio, la fibrosi e la rigenerazione muscolare difettosa, tuttavia, possono ostacolare il recupero funzionale dei muscoli del palato molle. Dopo la riparazione della palatoschisi, è possibile dimostrare un metodo innovativo per la coltura di cellule satelliti appena isolate utilizzando rivestimenti in gel a matrice esocellulare di dimensioni di pochi millimetri.

In questo modo si evita la necessità di espansione. Un giorno prima dell'isolamento, posizionare otto vetrini in una capsula di Petri da 100 millimetri e trasferire la capsula su una superficie fredda. Dopo 10 minuti, utilizzare una micropipetta preriempita per erogare una singola goccia da 10 microlitri di gel per matrice extracellulare in ciascun pozzetto.

Dopo aver raffreddato i vetrini per altri sette minuti, rimuovere completamente il gel rimanente e asciugare i pozzetti a 37 gradi Celsius durante la notte del giorno successivo. Per sezionare il muscolo del massacro, rimuovere la pelle dalla testa di un ratto di nove settimane e utilizzare aghi ipodermici per fissare la testa su un lato. Su un cuscinetto di silicone, isolare la ghiandola parotide e il nervo facciale e rimuovere la ghiandola.

Quindi, utilizzando una lama di bisturi numero 15, rimuovere con cura il nervo facciale. Identificare la testa superficiale del muscolo massetere. Successivamente, utilizzare una pinza diritta per separare il tendine dalla sua origine durante il processo zigomatico, seguito da un accurato taglio del tendine con le forbici da dissezione.

Con l'aiuto del bisturi, sezionare la testa superficiale del massacro fino al suo inserimento all'angolo e alla metà inferiore della superficie laterale del ramo della mandibola. Per sezionare il ventre posteriore del muscolo digastrico, fissare la testa in posizione supina con aghi e rimuovere il grasso sottocutaneo sovrastante sia la ghiandola sublinguale che quella sottomandibolare. Esporre il ventre muscolare anteriore e posteriore di gastrico, quindi tenere il tendine anteriore del ventre posteriore con una pinza diritta tagliata in sezionare con cura il tendine alla sua origine nel torero timpanico.

Per sezionare il muscolo levada vli palatino, localizzare il muscolo stilo halloide. Tiralo lateralmente e rimuovi con cura il tessuto muscolare. Successivamente, localizzare il tendine della levada vli palatino che inserisce il toro timpanico e sezionarlo attentamente.

Quindi sollevare l'esofago da dietro la trachea. Identificare l'area del palato molle in cui è inserito il palato levada vli e tagliare il muscolo. Quindi immergere il muscolo in etanolo al 70% e trasferirlo in PBS ghiacciato integrato con antibiotici.

Per isolare le cellule satelliti, trasferire ogni muscolo in pozzetti individuali di una piastra a sei pozzetti e tagliare i tessuti in piccoli pezzi di due millimetri. Facendo attenzione a non sminuzzare troppo i muscoli. Successivamente, incubare attentamente i frammenti di tessuto in 2,5 millilitri di soluzione di pronasi allo 0,1% per pozzetto a 37 gradi Celsius per 60 minuti agitando delicatamente ogni 20 minuti.

Quando i fasci di fibre mostrano un aspetto allentato a 2,5 millilitri di DMEM integrato con siero di cavallo e antibiotici in ciascun pozzetto e trasferiscono i tessuti digeriti in singoli tubi conici da 15 millilitri. Centrifugare i fanghi di tessuto e decantare i surnatanti. Quindi aggiungere cinque millilitri di terreno a ciascuna provetta e omogeneizzare il tessuto con una pipetta di plastica da 10 millilitri.

Centrifugare nuovamente i fazzoletti e trasferire i surnatanti in nuove provette coniche da 15 millilitri. Quindi aggiungere altri cinque millilitri di terreno alle provette e tri tessere nuovamente i pezzi di tessuto fino a quando i frammenti non passano facilmente attraverso la pipetta. Dopo un'altra centrifugazione, aspirare i surnatanti nelle provette corrispondenti appropriate e filtrare le sospensioni cellulari attraverso filtri da 40 micrometri in singole provette da 50 millilitri.

Lavare i filtri con un millilitro di DMEM per il massimo recupero cellulare. Quindi centrifugare le cellule, risospendere i pellet in terreno fresco e contare le cellule per coltivare le cellule satelliti isolate. Successivamente, diluire le sospensioni cellulari a 1,5 volte 10 su tre cellule per 10 microlitri di terreno di coltura.

Quindi aggiungere 10 microlitri di cellule su ogni punto di gel della matrice extracellulare precedentemente preparato e incubare i gel a 37 gradi Celsius dopo sei ore. Aggiungere con cautela 400 microlitri di terreno di coltura a ciascun punto di gel e rimettere i vetrini nell'incubatore. Dopo tre giorni, avviare la differenziazione delle cellule con l'aggiunta del terreno di coltura appropriato subito dopo l'isolamento.

Più del 90% delle cellule satelliti appena isolate esprimono il pacco sette Entro il quarto giorno, il pacco sette e il MyoD sono espressi dalle cellule satelliti di tutti i gruppi muscolari. Il mio OG è altamente espresso al settimo giorno in tutti i gruppi muscolari. Quattro giorni dopo la semina sulla matrice extracellulare, le macchie di gel, le cellule proliferanti iniziano a fondersi e formare piccoli miotubi multinucleati, che esprimono la catena pesante della miosina al settimo e al decimo giorno.

I myo tube lunghi e ben organizzati sono evidenti entro il giorno 10. Si possono osservare anche contrazioni del tubo mio. Questo protocollo consente lo studio di cellule satelliti originate dai muscoli della testa di brer e offre nuove possibilità per il trattamento della schisi. Pazienti.