Isolamento e caratterizzazione di cellule satelliti da muscoli Rat Capo Branchiomeric

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule satelliti da muscoli rappresentativi derivanti dal primo, secondo e quarto arco branchiale per la loro coltura su una matrice extracellulare. Punti di gel. Questo viene ottenuto mediante la dissezione iniziale dei muscoli mascellare, digastrico e levator veli palatini di un ratto adulto giovane.

Nel secondo passaggio, le cellule satelliti di ciascun campione muscolare vengono isolate mediante digestione enzimatica, con durata specifica. Le cellule vengono quindi coltivate su gel di matrice extracellulare. Infine, lo stato dinamico della miogenesi delle colture di cellule satelliti può essere monitorato mediante colorazione per i marcatori muscolari di interesse.

Il labbro leporino e il palatoschisi sono tra le malformazioni craniofacciali più comuni nell'uomo. Quando è presente una fessura, è necessario un intervento chirurgico per chiudere il difetto e consentire uno sviluppo normale del linguaggio. Tuttavia, la fibrosi e una rigenerazione muscolare difettosa possono ostacolare il recupero funzionale dei muscoli del palato molle. Dopo la correzione del palatoschisi, è possibile dimostrare un metodo innovativo per la coltura di cellule satelliti appena isolate, utilizzando rivestimenti di dimensioni millimetriche a base di gel di matrice extracellulare.

Questo evita la necessità di espansione. Seminare queste cellule un giorno prima dell'isolamento, posizionando otto camere a pozzetti in una piastra di Petri da 100 millimetri e trasferendo la piastra su una superficie fredda. Dopo 10 minuti, utilizzare una micropipetta pre-riempita per dispensare una singola goccia da 10 microlitri di gel di matrice extracellulare in ciascun pozzetto.

Dopo aver raffreddato i vetrini per altri sette minuti, rimuovere completamente il gel rimanente e asciugare i pozzetti a 37 gradi Celsius durante la notte; il giorno successivo. Per dissezionare il muscolo massetere, rimuovere la pelle dalla testa di un ratto di nove settimane e utilizzare aghi ipodermici per fissare la testa su un lato. Su un tappetino di silicone, isolare la ghiandola parotide e il nervo facciale e rimuovere la ghiandola.

Successivamente, utilizzando una lama di bisturi numero 15, rimuovere con attenzione il nervo facciale. Identificare la testa superficiale del muscolo massetere. Successivamente, utilizzare una pinza dritta per separare il tendine dalla sua origine al processo zigomatico, seguita dal taglio accurato del tendine con forbici da dissezione.

Utilizzando il bisturi, dissezionare la testa superficiale del muscolo massetere fino al suo inserimento all'angolo e alla metà inferiore della superficie laterale del ramo della mandibola. Per dissezionare il ventre posteriore del muscolo digastrico, fissare la testa in posizione supina con degli aghi ed eliminare il tessuto adiposo sottocutaneo sovrastante sia la ghiandola sottolinguale che quella sottomandibolare. Esporre i ventri anteriore e posteriore del muscolo digastrico, quindi afferrare con una pinza dritta il tendine anteriore del ventre posteriore e dissezionare con attenzione il tendine fino alla sua origine nella bulla timpanica.

Per dissezionare il muscolo levatore del velo palatino, localizzare il muscolo stilofaringeo. Tirarlo lateralmente e rimuovere con attenzione il tessuto muscolare. Successivamente, localizzare il tendine del levatore del velo palatino che si inserisce sulla bulla timpanica e procedere con attenzione alla sua dissezione.

Quindi sollevare l'esofago da dietro la trachea. Identificare la zona del palato molle in cui si inserisce il muscolo levator veli palatini e staccare il muscolo. Successivamente immergere il muscolo in etanolo al 70% e trasferirlo in PBS freddo su ghiaccio integrato con antibiotici.

Per isolare le cellule satelliti, trasferire ciascun muscolo in pozzetti separati di una piastra a sei pozzetti e tagliare i tessuti in piccoli pezzi di due millimetri, avendo cura di non triturare eccessivamente i muscoli. Successivamente, incubare con attenzione i frammenti di tessuto in 2,5 millilitri di soluzione di pronasi 0,1% per pozzetto a 37 gradi Celsius per 60 minuti, agitando delicatamente ogni 20 minuti.

Quando i fasci di fibre Exhibit A presentano un aspetto allentato, aggiungere 2,5 millilitri di DMEM integrato con siero equino e antibiotici in ciascun pozzetto e trasferire i tessuti digeriti in provette coniche individuali da 15 millilitri. Centrifugare le sospensioni di tessuto e decantare i soprannatanti. Quindi aggiungere cinque millilitri di mezzo in ciascuna provetta e omogeneizzare il tessuto con una pipetta di plastica da 10 millilitri.

Centrifugare nuovamente i tessuti e trasferire i soprannatanti in nuovi tubi conici da 15 millilitri. Aggiungere quindi altri cinque millilitri di mezzo ai tubi e risospendere nuovamente i pezzi di tessuto fino a quando i frammenti passano facilmente attraverso la pipetta. Dopo un’ulteriore centrifugazione, raccogliere i soprannatanti nei tubi corrispondenti appropriati e filtrare le sospensioni cellulari attraverso filtri da 40 micrometri in singoli tubi da 50 millilitri.

Lavare i filtri con un millilitro di DMEM per un recupero cellulare massimo. Quindi centrifugare le cellule, risospendere i pellet in mezzo fresco e contare le cellule per coltivare le cellule satelliti isolate. Successivamente, diluire le sospensioni cellulari a 1,5 volte 10 alla tre cellule per 10 microlitri di mezzo di coltura.

Quindi aggiungere 10 microlitri di cellule su ciascun punto di gel di matrice extracellulare precedentemente preparato e incubare i gel a 37 gradi Celsius dopo sei ore. Aggiungere con attenzione 400 microlitri di mezzo di coltura a ciascun punto di gel e reinserire i vetrini nell'incubatore. Dopo tre giorni, avviare la differenziazione delle cellule aggiungendo il mezzo di coltura appropriato immediatamente dopo l'isolamento.

Oltre il 90% delle cellule satelliti appena isolate esprime Pax7. Entro il quarto giorno, Pax7 e MyoD sono espressi dalle cellule satelliti di tutti i gruppi muscolari. MyoG è fortemente espressa al settimo giorno in tutti i gruppi muscolari. Quattro giorni dopo la semina sulla matrice extracellulare, le cellule proliferanti iniziano a fondersi formando piccoli miotubi multinucleati, che esprimono la catena pesante della miosina al settimo e al decimo giorno.

Ai giorno 10 sono evidenti lunghi e ben organizzati tubuli miogenici. È inoltre possibile osservare il fremito dei tubuli miogenici. Questo protocollo consente lo studio delle cellule satelliti provenienti dai muscoli della testa e offre nuove possibilità per il trattamento dei pazienti affetti da palatoschisi.