Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare quantitativamente la codistribuzione spaziale di coppie di bersagli, in questo caso analizzando il traffico dei recettori indotto da farmaci. Questo viene ottenuto trattando cellule vive in coltura con un farmaco per indurre un modificato traffico dei recettori. Come secondo passaggio, una doppia marcatura immunologica dei recettori bersaglio e dei compartimenti intracellulari coinvolti nel traffico permette la localizzazione spaziale delle coppie di bersagli mediante microscopia confocale multicanale.

L'analisi quantitativa della codistribuzione viene utilizzata per misurare la tendenza dei recettori bersaglio e dei compartimenti a trovarsi nello stesso luogo. I risultati mostrano i cambiamenti nel traffico dei recettori in seguito al trattamento farmacologico, in base alla codistribuzione tra recettori e compartimenti intracellulari coinvolti nel traffico. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la sovrapposizione per la codistribuzione, è che fornisce misure quantitative della codistribuzione, consentendo analisi statistiche più potenti e progettazioni sperimentali più complesse.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul traffico dei recettori, può essere applicato anche alle variazioni della colocalizzazione spaziale di praticamente due proteine qualsiasi in cellule in coltura. Per iniziare questa procedura, rimuovere il mezzo di crescita originale e sostituirlo con un mezzo contenente il farmaco di interesse alla concentrazione scelta. Successivamente, incubare le cellule nelle condizioni di crescita originali per la durata del trattamento scelta.

Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule con un millilitro di tampone di lavaggio ogni volta, per tre volte. Fissare le cellule con 300 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS 0,1 molare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavare nuovamente le cellule con un millilitro di tampone di lavaggio ogni volta, per tre volte.

Successivamente, incubare le cellule in 300 microlitri di buffer di blocco per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le cellule con l'anticorpo primario in 300 microlitri di diluente per anticorpi per 48 ore a quattro gradi Celsius. Quindi lavare delicatamente le cellule con un millilitro di buffer di lavaggio ogni volta, per tre volte.

Successivamente, incubare le cellule con l'anticorpo secondario coniugato a Fluor in 300 microlitri di diluente per anticorpi per un'ora a temperatura ambiente, proteggendo le cellule dalla luce. Trascorso un'ora, lavare delicatamente le cellule con un millilitro di buffer di lavaggio ogni volta, per tre volte. Per rimuovere il cover slip dalla piastra a 24 pozzetti, tenere la piastra inclinata a 45 gradi.

Posizionare la punta di un paio di pinzette fini sul bordo superiore del vetrino, nel punto in cui questo incontra il fondo della pozzetta. Quindi inclinare delicatamente il vetrino nel buffer di lavaggio allontanandolo dal fondo della pozzetta. Il vetrino si appoggerà sulla parete della pozzetta, dove potrà essere facilmente rimosso con le pinzette.

Quindi montare i vetrini con le cellule rivolte verso il basso su lamelle per microscopia utilizzando un mezzo di montaggio antiossidante con un obiettivo ad alta magnificazione da 100x. Innanzitutto, individuare una cellula rappresentativa da acquisire mediante fluorescenza in episcopio. Successivamente, configurare le impostazioni di acquisizione dell'immagine. Registrare immagini tiff non compresse a otto bit per ogni canale marcato, acquisendo ogni canale in modo sequenziale e mediando da quattro a sei scansioni per l'immagine finale.

Quindi passare al percorso di imaging confocale e mettere a fuoco un piano Z attraverso il centro della cellula. Ottimizzare la potenza del laser, la tensione e l'offset del tubo fotomoltiplicatore per ogni canale. Registrare queste impostazioni e utilizzare le stesse per l'acquisizione di tutte le cellule marcate per una specifica coppia di bersagli.

Nello stesso Replicate, posizionare le cellule localizzatrici da immaginare con un obiettivo ad alta ingrandimento. Utilizzando la fluorescenza in epifluorescenza, passare al percorso di acquisizione confocale e mettere a fuoco su un piano Z attraverso il centro della cellula, se disponibile. Utilizzare la funzione di ritaglio dello zoom software per limitare l'area di scansione alla cellula di interesse. Successivamente.

Acquisire immagini per ogni canale marcato utilizzando le impostazioni precedentemente definite e ripetere le procedure per acquisire almeno 15 cellule per condizione per ogni replicato, al fine di garantire un campionamento adeguato. In questo protocollo, aprire la coppia di immagini di una cellula in ImageJ. Utilizzare il comando di fusione dei canali colore dell'immagine per generare un'immagine RGB.

Quindi tracciare attorno alla cellula di interesse. Utilizzare il plugin ImageJ SC Colocalization per quantificare la colocalizzazione dei bersagli nella cellula selezionata. Registrare la misura di colocalizzazione desiderata e ripetere la procedura per ogni cellula nell'immagine.

Successivamente, calcolare la media dei valori di codistribuzione registrati delle condizioni di controllo comuni di ogni replica di ciascuna condizione di marcatura. Moltiplicare le medie per meno uno per ottenere l'offset per ogni replica in ciascuna condizione di marcatura. Quindi aggiungere l'offset per ogni replica in ciascuna condizione di marcatura a ciascun valore di codistribuzione in quella replica.

Questo normalizzerà i dati in modo che la misura media di codistribuzione per la condizione di controllo comune sia pari a zero in ogni replica di ciascuna condizione di marcatura. Successivamente, tutti i dati provenienti da tutte le repliche di ciascuna condizione di marcatura permetteranno l'analisi delle variazioni nella codistribuzione tra le repliche. Qui vengono mostrate colture primarie di neuroni sensoriali del ganglio della radice dorsale che sono state sottoposte a trattamenti farmacologici prolungati e acuti. Le cellule sono state quindi marcate mediante immunofluorescenza per i recettori delta oppioidi e per un marcatore degli endosomi di riciclo, utilizzando coppie distinte di anticorpi primari e secondari, e sono state analizzate mediante microscopia confocale sequenziale a due canali.

Oltre all'analisi quantitativa successiva della codistribuzione, queste immagini rappresentative sono state elaborate per generare mappe di codistribuzione a colori falsi mostrate qui. I punteggi medi di codistribuzione per i recettori delta oppioidi e i marcatori di endosomi precoci, endosomi di riciclo e lisosomi — la codistribuzione dei recettori con ciascun compartimento — vengono confrontati tra gruppi che hanno ricevuto diversi trattamenti farmacologici acuti, e si osservano i cambiamenti indotti dai farmaci nel traffico dei recettori. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di acquisire microfotografie di alta qualità e costanti, in modo da permettere un'analisi quantitativa valida.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi quantitativa della codistribuzione.