Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di valutare quantitativamente la colocalizzazione spaziale di coppie bersaglio, in questo caso, esaminando il traffico di recettori indotto da farmaci. Ciò si ottiene trattando le cellule vive in coltura con farmaci per indurre un traffico di recettori alterato. Come seconda fase, la doppia marcatura immunologica dei recettori bersaglio e dei compartimenti di traffico intracellulare consente la localizzazione spaziale delle coppie bersaglio mediante microscopia confocale multicanale.

L'analisi quantitativa di colocalizzazione viene utilizzata per misurare la tendenza dei recettori bersaglio e dei compartimenti a trovarsi nello stesso luogo. I risultati mostrano cambiamenti nel traffico dei recettori in seguito al trattamento farmacologico basato sulla colocalizzazione dei recettori e dei compartimenti del traffico intracellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la colocalizzazione in overlay, è che fornisce misure quantificate di colocalizzazione, che consentono analisi molto più potenti e disegni sperimentali complessi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul traffico dei recettori, può anche essere applicato ai cambiamenti nella colocalizzazione spaziale di quasi due proteine in cellule in coltura. Per iniziare questa procedura, rimuovere il terreno di coltura originale e sostituirlo con un terreno contenente il farmaco di interesse alla concentrazione scelta. Successivamente, incubare le cellule nelle condizioni di crescita originali per la durata del trattamento scelta.

Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule con un millilitro di tampone di lavaggio ogni volta per tre volte. Fissare le cellule con 300 microlitri di para formaldeide al 4% in PBS 0,1 molare per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavare nuovamente le celle con un millilitro di tampone di lavaggio ogni volta per tre volte.

Successivamente, incubare le cellule in 300 microlitri di tampone bloccante per due ore a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le cellule con anticorpi primari in 300 microlitri di diluente anticorpale per 48 ore a quattro gradi Celsius. Quindi lavare delicatamente le celle con un millilitro di tampone di lavaggio ogni volta per tre volte.

Successivamente, incubare le cellule con anticorpo secondario coniugato a Fluor in 300 microlitri di diluente anticorpale per un'ora a temperatura ambiente e proteggere le cellule dalla luce. Dopo un'ora, lavare delicatamente le celle con un millilitro di tampone di lavaggio ogni volta per tre volte. Per rimuovere il vetrino coprioggetto dalla piastra a 24 pozzetti, tenere la piastra a 45 gradi.

Posizionare la punta di un paio di pinze sottili sul bordo superiore del vetrino coprioggetti nel punto in cui incontra il pavimento del pozzo. Quindi inclinare delicatamente il vetrino copritore nel tampone di lavaggio lontano dal pavimento del pozzo. Il vetrino coprioggetti si appoggerà contro la parete del pozzo dove può essere facilmente rimosso con una pinza.

Quindi montare i vetrini coprioggetto con le cellule rivolte verso il basso su vetrini da microscopio con mezzo di montaggio anti-sbiadimento utilizzando un obiettivo ad alto ingrandimento 100x. Innanzitutto, individuare una cellula rappresentativa da visualizzare utilizzando l'epifluorescenza. Quindi, configurare le impostazioni di acquisizione delle immagini Registra immagini tiff non compresse a otto bit di ciascun canale etichettato per visualizzare ogni canale in sequenza e per calcolare la media di quattro o sei scansioni per l'immagine finale.

Quindi passa al percorso di imaging confocale e concentrati su un piano Z attraverso il centro della cellula. Ottimizza la potenza del laser stenopeico e la tensione e l'offset del tubo moltiplicatore fotografico per ciascun canale. Registrare queste impostazioni e utilizzare le stesse impostazioni per l'imaging di tutte le celle etichettate per una determinata coppia di target.

Nello stesso Replicare le celle del localizzatore successivo da visualizzare con un obiettivo ad alto ingrandimento. Utilizzando l'epifluorescenza, passare al percorso di imaging confocale e concentrarsi su un piano Z attraverso il centro della cellula, se disponibile. Utilizzare la funzione di ritaglio zoom software per limitare l'area di scansione alla cella di interesse. Dopo.

Acquisire immagini per ciascun canale etichettato utilizzando le impostazioni precedentemente stabilite e ripetere le procedure per acquisire immagini di 15 o più celle per condizione per replica. Per garantire una raccolta di campioni sufficiente. In questa procedura, aprire la coppia di immagini di una cella nell'immagine J.Utilizzare il comando di unione dei canali di unione dei colori dell'immagine per generare un'immagine RGB.

Quindi disegna intorno alla cella di interesse. Utilizzare l'immagine j plugin la colocalizzazione SC per quantificare la colocalizzazione dei target nella cella selezionata. Registrare la misura di colocalizzazione desiderata e ripetere la procedura per ogni cella dell'immagine.

Successivamente, calcolare la media dei valori di colocalizzazione registrati delle condizioni di controllo comuni di ciascuna replica di ciascuna condizione di marcatura. Moltiplicare le medie per meno uno per ottenere l'offset per ogni replica in ogni condizione di etichettatura. Aggiungere quindi l'offset per ogni replica in ogni condizione di etichettatura a ogni valore di colocalizzazione in tale replica.

In questo modo i dati verranno normalizzati in modo tale che la misura media di colocalizzazione per la condizione di controllo comune sia zero in ogni replica di ciascuna condizione di etichettatura. Successivamente, tutti i dati provenienti da tutte le repliche di ciascuna condizione di marcatura consentiranno l'analisi dei cambiamenti nella colocalizzazione tra le repliche Qui sono mostrate le colture primarie dei neuroni sensoriali dei gangli della radice dorsale che sono stati esposti a trattamenti farmacologici prolungati e acuti. Le cellule sono state quindi immunomarcate per i recettori delta degli oppioidi e un marcatore di endosomi di riciclo con coppie di anticorpi secondari primari distinti e sono state sottoposte a imaging mediante microscopia confocale sequenziale a due canali.

Oltre alla successiva colocalizzazione e analisi quantitativa, queste immagini rappresentative sono state elaborate per generare mappe di colocalizzazione a falsi colori mostrate qui. I punteggi medi di colocalizzazione per i recettori delta degli oppioidi e i marcatori del riciclo precoce degli endosomi e la colocalizzazione del recettore dei lisosomi con ciascun compartimento sono stati confrontati tra i gruppi che ricevono diversi trattamenti farmacologici acuti e sono stati osservati cambiamenti indotti da farmaci nel traffico recettoriale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di acquisire micrografie coerenti di alta qualità per consentire un'analisi quantitativa valida.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi quantitativa di colocalizzazione.