Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da Burnetii Coxiella Durante siRNA Silencing

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di esaminare l'impatto di specifici processi dell'ospite sulla capacità dei patogeni batterici di traslocare le proteine effettrici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia cellulare. In particolare, come l'ospite è coinvolto nel bloccare o promuovere la consegna di effettori di virulenza batterica nella cellula ospite.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina due tecniche consolidate. Vale a dire, il silenziamento genico siRNA e il saggio reporter per misurare la traslocazione delle proteine batteriche. Studiare l'interazione tra i patogeni e la cellula eucariotica.

Questo metodo fornisce informazioni sulla patogenesi della coxiella e può anche essere applicato per studiare le interazioni tra patogeni e ospiti di altri batteri che dipendono da un'efficiente traslocazione delle proteine. Ad esempio, clamidia, salmonella e l'attacco di E.coli interfacciato. Dopo aver coltivato C. burnetii che esprime CBU0077, fondere la betalattamasi secondo il protocollo di testo in un pallone di coltura quadrato di 25 centimetri con un tappo ventilato.

Inoculare 10 millilitri di ACCM2 preriscaldato contenente tre microgrammi per millilitro di cloramfenico con 20 microlitri di batteri. Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius con il cinque percento di anidride carbonica e il 2,5 percento di ossigeno per sette giorni. Per invertire il trasfetto delle cellule hela con siRNA e dopo aver preparato il siRNA secondo il protocollo di testo, posizionare DMEM più il 10% di FCS, lo 05% di tripsina EDTA e PBS in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti per riscaldare prima dell'uso.

Per ogni trasfezione sperimentale di siRNA, combinare 0,4 microlitri di reagente di trasfezione e 63,6 microlitri di terreno sierico ridotto in una provetta per microfuge individuale. Agitare tutti i tubi di microfuga e lasciare che i componenti si complessi per cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 16 microlitri di ciascun siRNA sperimentale alle corrispondenti provette per microfuge contenenti il complesso di trasfezione.

Quindi agitare e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Durante i 20 minuti di incubazione, aggiungere 20 microlitri del reagente di trasfezione, il terreno di siero ridotto e la miscela di siRNA nei pozzetti appropriati di un vassoio sterile nero, piatto, a fondo trasparente da 96 pozzetti. Sempre durante i 20 minuti di incubazione, utilizzare 10 millilitri di PBS preriscaldato per lavare un monostrato di cellule hela confluenti o subconfluenti in un pallone quadrato di 75 centimetri.

Aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina EDTA allo 05% al pallone e incubare a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per tre-cinque minuti per staccare le cellule. Raccogli le cellule in nove millilitri di DMEM preriscaldato con il 10% di FCS. Utilizzo di un emocitometro per contare le cellule.

Quindi, con DMEM 10%FCS, portare le cellule a una densità finale di 4,9 volte 10 per le quattro cellule per millilitro. Immediatamente dopo l'incubazione di 20 minuti, pipettare 80 microlitri di cellule in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti contenente la miscela di trasfezione siRNA che porterà la densità cellulare a 3,92 volte 10 per le terze cellule per pozzetto. Questo è il passaggio più critico della procedura.

È molto importante che le cellule hela vengano aggiunte alla miscela di trasfezione siRNA immediatamente dopo l'incubazione di 20 minuti. In caso contrario, l'efficienza della trasfezione può essere compromessa. Assicurarsi che i pozzetti del bianco contengano solo 80 microlitri di DMEM più il 10% di FCS.

Incubare la piastra per 24 ore. Quindi, con un adattatore multicanale collegato a una fonte di vuoto e una pipetta, sostituire il terreno con 100 microlitri di DMEM fresco più il 10% di FCS. Incubare le cellule per altre 48 ore.

Dopo sette giorni di crescita in ACCM2, centrifugare i 10 millilitri di C.burnetii P BlaM CBU0077 coltura a 15.000 volte g e temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, utilizzare 10 millilitri di DMEM FCS preriscaldato per risospendere il pellet. Quindi utilizzare l'acqua per preparare una diluizione su dieci e una su cento in un volume finale di 100 microlitri di coltura e impostare la QPCR secondo il protocollo di testo.

Dopo aver calcolato i genomi totali per millilitro nella coltura di C. burnetii P BlaM CBU0077, utilizzare DMEM FCS preriscaldato per regolare il volume della coltura a due millilitri per una concentrazione di 1,88 volte 10 per otto batteri per millilitro. Quindi, rimuovere il terreno dal grezzo e invertire le celle trasfettate. Quindi aggiungere 50 microlitri di batteri diluiti nei pozzetti appropriati e aggiungere 50 microlitri di DMEM FCS ai pozzetti vuoti e non infetti.

Dopo aver preparato le soluzioni per il substrato BlaM secondo il protocollo di testo, preparare una miscela master combinando 1,8 microlitri di soluzione A e 16,2 microlitri di soluzione B.Mescolare bene il tubo vorticando. Quindi aggiungere 237 microlitri di soluzione C e 45 microlitri di probenecid molare 0,1. Agitare nuovamente il tubo.

Aggiungere 10 microlitri della soluzione di carico Six X direttamente in tutti i pozzetti bianchi e trasfettati inversamente senza rimuovere il terreno esistente. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per due ore. Per determinare il livello di traslocazione, su un lettore di micropiastre, creare un protocollo di intensità della fluorescenza utilizzando Endpoint come modalità di lettura.

Selezionare la micropiastra a 96 pozzetti, quindi nelle impostazioni ottiche, selezionare due multicromatici e per il primo numero preimpostato, inserire l'eccitazione di 410-10 nanometri e l'emissione di 520-10. Per il secondo numero preimpostato, inserire un'eccitazione di 410-10 nanometri e un'emissione di 450-10. Quindi assicurati che l'opzione Well multichromatics sia selezionata.

Quindi, selezionare Media orbitale con un diametro di tre millimetri. In Ottica, selezionare Ottica inferiore. Quindi, in Velocità e precisione, seleziona Preciso.

Ciò corrisponde a otto regioni per pozzo. Regolare il layout della piastra selezionando i pozzetti appropriati come spazi vuoti e pozzetti campione. Quindi, seleziona Avvia misurazione.

Rimuovere il coperchio e posizionare il vassoio nel lettore di piastre. Assicurarsi che il valore di guadagno sia regolato per evitare di raggiungere i valori massimi di fluorescenza eseguendo una regolazione del guadagno su uno dei pozzetti infetti che è stato trasfettato inversamente con siRNA OTP. Selezionare Avvia misurazione per misurare tutti i pozzetti appropriati utilizzando la fluorescenza di fondo a un'eccitazione di 410 nanometri e un'emissione di 450 nanometri e 520 nanometri rispettivamente per la fluorescenza blu e verde.

Analizza i risultati secondo il protocollo di testo. Questa figura mostra un esempio del valore soglia del ciclo atteso sia dagli standard che dai campioni successivi alla QPCR per determinare il numero totale di genomi per millilitro nella coltura di C. burnetii a sette giorni. Sulla base di questi dati, c'erano da 2,31 volte 10 a otto genomi per millilitro nella coltura batterica risospesa da 10 millilitri.

Il risultato del silenziamento di Rab5A o Rab7A sulla traslocazione dell'effettore da tre esperimenti indipendenti dopo l'incubazione delle cellule trasfettate invertite con substrato BlaM è mostrato qui. Una diminuzione significativa del livello di traslocazione di BlaM CBU0077 si è verificata durante il silenziamento sia di Rab5A che di Rab7A rispetto al controllo OTP. Come dimostrato in questo grafico, sebbene il trattamento con Rab5A o Rab7A determini una riduzione della vitalità cellulare rispetto al controllo OTP, questa riduzione non è così grave come il trattamento con PLK1, un gene noto per causare la morte cellulare quando silenziato.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come silenziare specifici bersagli dell'ospite utilizzando siRNA e successivamente studiare l'impatto che questo ha sulla traslocazione della proteina effettrice batterica utilizzando il saggio reporter basato su FRET. Questo protocollo è stato ottimizzato sia per il silenziamento delle Rab GTPasi che per l'infezione coxieller delle cellule hela. Per utilizzare questo metodo per colpire altre proteine ospiti, le condizioni di trasfezione richiedono un'ottimizzazione per garantire un efficiente silenziamento genico.

Allo stesso modo per utilizzare questo metodo con altri agenti patogeni batterici, le condizioni di infezione richiedono un'ottimizzazione.