Name: Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da Burnetii Coxiella Durante siRNA Silencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Scopri come misurare l'efficienza del traslocamento degli effettori batterici in Coxiella burnetii utilizzando silenziamento genico siRNA e saggi reporter FRET. Questo metodo avanzato permette di studiare le interazioni ospite-patogeno in microbiologia cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Health and Medical Research Council (NHMRC) (Grant ID 1062383 e 1063646) assegnate a HJN. EAL è supportato da un Australian Postgraduate Award.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

sistemi di secrezione, e le proteine ​​effettrici batteriche questi sistemi di trasporto nel citoplasma delle cellule ospiti, sono una componente importante di virulenza che molti batteri patogeni utilizzano per stabilire una infezione all&#39;interno di nicchie replicative unici. L&#39;attenzione di molti gruppi di ricerca è stato quello di indagare l&#39;interazione tra effettori batterici e proteine ​​host e l&#39;influenza di questi effettori hanno sui percorsi cellulari ospitanti. la ricerca molto limitata, se del ...

Coxiella burnetii è un patogeno intracellulare unico che provoca la febbre Q infezione umana zoonotici. Questa malattia è associata con un ampio spettro di manifestazioni cliniche che si estendono dalla sieroconversione asintomatica a infezione cronica pericolosa per la vita, che spesso si manifesta come anni endocardite dopo l&#39;esposizione 1. L&#39;infezione umana avviene principalmente attraverso l&#39;inalazione di aerosol contaminati con ruminanti il ​​principale serbatoio di infezione, in particolare, vacche da latte, pecore e capre. Anche se l&#39;infezione Coxiella in questi animali è in genere subclinica, l&#39;infezione può innescare l&#39;aborto e la notevole carica batterica all&#39;interno del fluido parto e la placenta può contaminare l&#39;ambiente locale 1. Un esempio di enorme peso tale contaminazione può avere sia la salute pubblica e il settore agricolo è stato recentemente osservato nel focolaio febbre Q che si è verificato nei Paesi Bassi 2. Tra il 2007 eIl 2010, oltre 4.000 casi umani di febbre Q sono stati diagnosticati e questa epidemia era legata alla contaminazione significativa delle aziende agricole di capra 3. Inoltre, Coxiella è un potenziale arma biologica, come classificati dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie, a causa della stabilità ambientale dei batteri e bassa dose infettante necessaria per causare grave morbilità e mortalità 4. Coxiella esiste in due fasi: Fase I microrganismi, isolati da fonti naturali, sono estremamente virulenti e organismi di fase II sono molto attenuate in vivo. Ad esempio, dopo diversi passaggi in vitro degli organismi Coxiella burnetii Nine Mile Fase I, Fase II, i batteri sono stati prodotti che contengono una delezione cromosomica irreversibile conseguente lipopolisaccaride tronco (LPS) 5. Questo ceppo, C. burnetii NMII, è fenotipicamente simile alla Fase I in modelli di coltura di tessuti e fornisce una modalità più sicural per i ricercatori di studiare Coxiella patogenesi nei laboratori 5. Negli ultimi anni molti passi avanti sono rapidamente avanzato il campo della genetica Coxiella. Più in particolare, lo sviluppo dei mezzi di comunicazione axeniche (acidificato medio cisteina citrato - ACCM-2) ha permesso la crescita privo di cellule di Coxiella sia liquido e su supporti solidi 6,7. Ciò ha determinato miglioramenti diretti di strumenti genetici disponibili per Coxiella tra cui un sistema di espressione del gene inducibile, vettori navetta e sistemi di trasposoni casuali 8-11. Più di recente, sono stati sviluppati due metodi per l&#39;inattivazione genica mirata, aprendo la strada per l&#39;esame specifico di virulenza geni candidati 12. A seguito di interiorizzazione da parte dei macrofagi alveolari, Coxiella replica ai numeri elevati all&#39;interno di un vano di membrana definito il Coxiella- contenente vacuolo (CCV). Il CCV richiede traffico endocitico ospite esimogrezzi precoce e tardiva endosomi fino a quando non matura in un organello lisosoma di derivazione 13. In tutto questo processo, il CCV acquisisce fattori dell&#39;ospite che o appaiono transitoriamente o rimanere connessi con il vacuolo, compresi, ma non limitatamente a, Rab5, Rab7, CD63 e LAMP-gennaio 13-15. La replica di Coxiella all&#39;interno di cellule ospiti è interamente dipendente da un Dot / Icm Tipo IVB secrezione sistema completamente funzionante (T4SS) 8,16,17. Questo sistema di secrezione è una struttura multi-proteina ancestrally relative ai sistemi di coniugazione e si estende su entrambi membrane batteriche e vacuolari per fornire proteine ​​batteriche, definito effettori, nel citoplasma ospitante 18. Il Coxiella T4SS è funzionalmente molto simile al ben caratterizzato tipo IVB Dot / Icm secrezione Sistema di Legionella pneumophila 19,20. È interessante notare che l&#39;attivazione del T4SS e successiva effettore traslocazione avviene solo Coxiella raggiunge l&#39;acido lisosoma derivatoorganello, circa 8 ore dopo l&#39;infezione 17,21. Ad oggi, più di 130 effettori Dot / ICM sono stati identificati 9,17,22-24. Molti di questi effettori probabilmente svolgono un ruolo importante durante la replica di Coxiella all&#39;interno di cellule ospiti; tuttavia, solo pochi effettori sono stati funzionalmente caratterizzata 25-29. In questo studio utilizziamo un saggio di traslocazione di fluorescenza base che si basa sulla scissione del substrato CCF2-AM FRET (di seguito denominato il substrato blam) attraverso attività di β-lattamasi all&#39;interno del citoplasma della cellula ospite (Figura 1). Il gene di interesse è fuso TEM-1 β-lattamasi (blam) su un plasmide giornalista che fornisce espressione costitutiva. Il substrato BLAM è composto da due fluorofori (cumarina e fluoresceina) che formano una coppia FRET. Eccitazione dei risultati cumarinici in FRET della fluoresceina e l&#39;emissione di fluorescenza verde in assenza di effettore traslocazione; Tuttavia, se il BlaM-effector proteina di fusione viene traslocato nel citoplasma ospite, la risultante β-lattamasi attività fende l&#39;anello β-lattamici del substrato Blam, che separa la coppia FRET produrre blu emissione di fluorescenza a seguito di eccitazione. Questo test traslocazione è stato ben dimostrato come un approccio per identificare le proteine ​​effettrici da una gamma di diversi batteri intracellulari ed extracellulari, tra cui C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogena E. coli, Salmonella e Brucella 17,30-35. Per determinare il ruolo dei fattori di accoglienza specifici su Coxiella effettrici traslocazione utilizziamo un metodo consolidato per silenziamento gene noto come interferenza dell&#39;RNA, in particolare piccoli RNA interferenti (siRNA). Originariamente identificato nel Caenorhabditis elegans, interferenza dell&#39;RNA è un processo cellulare endogena conservato utilizzato per defe innataNSE contro i virus così come gene regolamentazione 36,37. Dopo il legame di specifiche sequenze siRNA, degradazione del mRNA avviene attraverso RISC (RNA-indotta complesso tacere) con conseguente specifico silenziamento genico o atterramento 38. In questo studio, siRNA è stato utilizzato per indirizzare due proteine ​​ospitanti, Rab5A e Rab7A, che sono importanti regolatori della via endocitico. L&#39;impatto di tacere Rab5A e Rab7A su effettori traslocazione è stata determinata mediante C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 è stato scelto in quanto è stato precedentemente dimostrato di essere traslocata dal sistema di secrezione Dot / Icm di Coxiella 17. Utilizzando sia siRNA silenziamento genico e il saggio di traslocazione fluorescencebased descritto qui, stiamo cominciando a definire un ruolo per fattori di accoglienza nella traslocazione di proteine ​​effettrici da Coxiella. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di entrambi batteri intracellulari ed extracellulari che possiedono secretio similesistemi n responsabili della traslocazione di proteine ​​effettrici.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido citrico</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Citrato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 medio componente</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Solfato di ferro</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>L-cisteina</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Bacto-neopeptone</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 medio componente</td></tr><tr><td>Casamino acidi</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Metil beta ciclodestrina</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 componente medio</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Per coltura batterica</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Controllo non mirato Pool (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>Controllo non mirato</td></tr><tr><td>siGENOME Umano PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Provoca la morte cellulare; misura dell'efficienza di trasfezione</td></tr><tr><td>siGENOME Umano RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Umano RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x tampone siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Utilizzare acqua sterile priva di RNasi per diluire 5x tampone siRNA in 1x tampone siRNA</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 Reagente di trasfezione</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>Per la trasfezione</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Terreno a siero ridotto utilizzato per la trasfezione</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Per colture cellulari e infezioni</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello inattivato termicamente (FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Può utilizzare un prodotto equivalente alternativo</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Per la conservazione del ceppo Coxiella</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>0,05% di tripsina + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Per colture cellulari</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Per la diluizione di campioni e standard per qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>Può utilizzare un prodotto equivalente alternativo per estrarre il gDNA</td></tr><tr><td>Kit SensiFAST SYBR No-ROX</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>Può utilizzare un prodotto di miscelazione master qPCR equivalente alternativo per la reazione qPCR</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Kit di caricamento con CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>Per la misurazione della traslocazione mediante fluorescenza e generazione della soluzione di carico 6X (contiene le soluzioni A, B, C e DMSO)</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>Componente della soluzione Probenicid</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Componente della soluzione Probenicid</td></tr><tr><td>di-Sodio idrogeno ortofosfato</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Soluzione Probenicid componente</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Soluzione Probenicid componente</td></tr><tr><td>DRAQ5 Soluzione fluorescente per sonda (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Colorazione dei nuclei per determinare la vitalità cellulare. Utilizzare 1:4000 diluito in PBS.</td></tr><tr><td>Soluzione di PFA (paraformaldeide) al 4% in PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Soluzione di fissaggio per cellule HeLa 229</td></tr><tr><td>Pallone per colture tissutali da 25 cm2 con tappo ventilato</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Per la crescita di ceppi batterici</td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear bottom Micropiastre in polistirene nero trattato TC, confezionate singolarmente, con coperchio, sterili</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per coltura tissutale da 75 cm2 con tappo ventilato</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Per la crescita di 229 cellule HeLa</td></tr><tr><td>175 cm2 pallone per coltura tissutale con tappo ventilato</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>Per la crescita di 229 cellule HeLa</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td></td><td></td><td>Per la quantificazione di 229 cellule HeLa</td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96 piastre PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>Per qPCR reazione</td></tr><tr><td>Catena a 8 coperchi, piatta</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>Per reazione qPCR</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Attrezzatura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco da banco microfuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortice</td><td></td><td></td><td></td>da banco</tr><tr><td>Miscelatore</td><td></td><td></td><td></td>orbitale</tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Per la pellettatura di colture batteriche</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>Per la quantificazione del gDNA</td></tr><tr><td>Macchina Mx3005P QPCR</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>Per la quantificazione dei genomi di Coxiella in coltura di 7 giorni</td></tr><tr><td>Micropiastra ClarioSTAR lettore</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>Per la misura della fluorescenza</td></tr></tbody></table>

applicando fluorescence resonance energy transfer (fret) per esaminare effector translocation efficienza da<em&gt; burnetii coxiella</em&gt; durante sirna silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, l&#39;agente eziologico della febbre Q, è un patogeno intracellulare che si basa su un tipo IV Dot / Icm secrezione di sistema per stabilire una nicchia replicativa. Una coorte di effettori sono traslocato attraverso questo sistema nella cellula ospite per manipolare i processi di accoglienza e consentire la creazione di un vacuolo lisosoma di derivazione unica per la replica. Il metodo qui presentato comporta la combinazione di due tecniche ben consolidate: specifica silenziamento genico con siRNA e misura di traslocazione effettore utilizzando un substrato FRET-based che si basa sull&#39;attività β-lattamasi. L&#39;applicazione di questi due approcci, possiamo cominciare a comprendere il ruolo dei fattori di accoglienza in batterico funzione del sistema di secrezione e traslocazione effettrici. In questo studio abbiamo esaminato il ruolo di Rab5A e Rab7A, entrambi importanti regolatori del percorso traffico endocitico. Abbiamo dimostrato che il silenziamento dell&#39;espressione di una proteina risultati in una diminuzione della effettori translocatioefficienza n. Questi metodi possono essere facilmente modificati per esaminare altri agenti patogeni intracellulari ed extracellulari che utilizzano anche sistemi di secrezione. In questo modo, un quadro globale dei fattori di accoglienza che partecipano batterica traslocazione effettrici può essere rivelata.

Per questo studio, la C. burnetii pBlaM-CBU0077 ceppo è stato selezionato come CBU0077 è stato precedentemente dimostrato di essere un effettore traslocato del sistema di secrezione coxiella Dot / Icm 17. Prima di infezione, il numero totale dei genomi / ml in i sette giorni d&#39;C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 è stato enumerato utilizzando qPCR. La figura 4 dimostra un esempio della soglia di ciclo valori (Ct) attesi da ...

Indagare le interazioni tra batteri patogeni ei loro ospiti è un&#39;area importante della ricerca biologica. Qui, descriviamo le tecniche necessarie per misurare effettrici traslocazione da Coxiella burnetii durante siRNA silenziamento genico mediante substrato Blam.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è esaminare l'impatto di specifici processi dell'ospite sulla capacità dei patogeni batterici di traslocare proteine effettrici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia cellulare, in particolare riguardo al ruolo dell'ospite nel bloccare o promuovere il rilascio di effettori di virulenza batterici all'interno della cellula ospite.Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina due metodiche consolidate: il silenziamento genico mediante siRNA e il saggio reporter per misurare il traslocazione proteica batterica. Per studiare l'interazione tra patogeni e cellula eucariotica.Questo metodo fornisce informazioni sul patogenesi di Coxiella e può essere applicato anche per studiare le interazioni tra patogeno e ospite di altri batteri che dipendono da un efficiente traslocazione proteica. Ad esempio, Chlamydia, Salmonella ed Escherichia coli aderente interfacciante. Dopo aver coltivato C. burnetii che esprime CBU0077, fusi la beta-lattamasi secondo il protocollo descritto nel testo in un’area di coltura di 25 centimetri quadrati in un flacone con tappo areato.Inoculare 10

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