Sistema regolabile Tet-Off inducibile: un metodo in vitro per modulare l'espressione genica in cellule in coltura utilizzando il sistema Tetracycline-Off

Iniziare prendendo una sospensione di cellule riceventi in coltura in una provetta. Integrare la provetta con plasmidi inducibili contenenti il gene di interesse. L'espressione di questo gene è sotto il controllo di una sequenza di promotori a monte fusa con un operatore di tetraciclina o TetO, formando un elemento responsivo alla tetraciclina o TRE.

Inoltre, aggiungere vettori regolatori tetraciclina-off, ciascuno contenente un gene che codifica per la proteina transattivatrice della tetraciclina ricombinante o tTA. Elettroporare la miscela cellula-DNA per utilizzare impulsi elettrici per facilitare l'assorbimento dei plasmidi da parte della cellula.

Dopo l'elettroporazione, piastrate le cellule e incubatele per la durata desiderata. Entrando nel nucleo, il vettore tetraciclina-off esprime la proteina tTA. Il tTA è una proteina ibrida contenente un repressore Tet o la porzione TetR e un dominio transattivatore di trascrizione virale VP16.

porzione TetR lega la sequenza TetO dell'elemento TRE, mentre il dominio VP16 consente alla RNA polimerasi di sintetizzare l'mRNA dal DNA a valle, portando infine all'espressione genica. Sostituire i terreni di coltura nella piastra di coltura con terreni contenenti doxiciclina e incubare.

La doxiciclina, un analogo sintetico della tetraciclina, si lega alla proteina TetR e ne modifica la conformazione. Questo cambiamento interrompe l'interazione della proteina TetR con la sequenza TetO, inibendo l'espressione genica bersaglio.

Seminare le cellule a 1 x 10⁶ cellule/cm² in piastre di Petri da 100 millimetri, in presenza di un mezzo minimo essenziale completo. Coltivare per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con umidità. Il giorno successivo, aggiungere 500 microlitri di terreno completo senza antibiotici a ciascun pozzetto di una nuova piastra a 12 pozzetti e preriscaldare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Durante questa incubazione, aggiungere 1 microgrammo del plasmide di risposta e 1 microgrammo di vettore regolatorio a una provetta da 1,5 millilitri per pozzetto. Lavare le cellule epiteliali alveolari con 10 millilitri per pozzetto di PBS a 37 gradi Celsius senza calcio o magnesio e trattare le cellule con 5 millilitri per pozzetto di tripsina allo 0,05% a 37 gradi Celsius per due o quattro minuti nell'incubatore per colture cellulari.

Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina con 10 millilitri per pozzetto di terreno completo senza antibiotici e raccogliere le cellule in una nuova provetta da 50 millilitri. Lavare la piastra con 4 millilitri di terreno fresco per raccogliere eventuali cellule rimanenti e sedimentare le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere il pellet in 1 millilitro di PBS per il conteggio e centrifugare nuovamente le cellule. Risospendere il pellet a una densità di 4 x 10⁷ cellule/mL di tampone di risospensione e aggiungere 4 x 10⁵ cellule a ciascuna provetta di plasmide e vettore con una miscelazione delicata. Inserire 1 provetta nel dispositivo di elettroporazione e riempire la provetta con 3,5 millilitri di tampone elettrolitico.

Premere a fondo il pistone per inserire una punta dell'elettrodo placcata in oro in una pipetta e mescolare delicatamente il contenuto della provetta. Aspirare con cautela le cellule con una pipetta e inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non si sente un clic. Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le cellule epiteliali alveolari e premere Start sul touch screen.

Subito dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti preriscaldata. Quando tutte le cellule sono state elettroporate e piastre, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari, sostituendo il surnatante in ciascun pozzetto con un terreno completo con antibiotici dopo due giorni. Il successo della trasfezione può essere confermato dall'espressione di EGFP, come osservato dalla microscopia a fluorescenza o dalla citometria a flusso utilizzando un vettore di controllo.

Per inibire la trascrizione del gene di interesse, 72 ore dopo la trasfezione, sostituire il surnatante con 1 millilitro per pozzetto di terreno completo integrato con 1 microgrammo per millilitro di doxiciclina appena preparata. Per valutare l'emivita dell'mRNA del gene di interesse, rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari da 15 minuti a 6 ore.

Lavaggio di un pozzetto con 1 millilitro di PBS ghiacciato, prima di lisare le cellule con 500 microlitri di tampone di lisi da un kit di estrazione dell'RNA fenolo-cloroformio disponibile in commercio, e agitazione delicata ad ogni punto temporale sperimentale. Quindi, isolare l'RNA secondo le istruzioni del kit e determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nanometri.