Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di Mycobacterium abscessus In Zebrafish embrioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare e confrontare la virulenza dei ceppi di Mycobacterium abscessus e di descrivere le interazioni tra questi batteri e il sistema immunitario innato dell'ospite in vivo utilizzando embrioni trasparenti di zebrafish. Ciò si ottiene preparando prima un oculare batterico omogeneo. Successivamente, gli embrioni vengono iniettati per via endovenosa con le sospensioni batteriche a 30 ore dopo la fecondazione.

Inoltre, per studiare più precisamente il ruolo dei macrofagi nel controllo delle infezioni, viene utilizzata una procedura di iniezione a base di lipo coato per generare embrioni impoveriti di macrofagi. Infine, gli embrioni infetti vengono preparati e sottoposti a imaging utilizzando la fluorescenza e la microscopia confocale per monitorare la progressione dell'infezione. In definitiva, i risultati che possono essere ottenuti mostrano le interazioni specifiche tra le cellule fagocitiche fluorescenti e l'ascesso M, sia come basi individuali che come cordoni serpentini all'interno di un embrione trasparente.

Il vantaggio principale dell'utilizzo del pesce zebra rispetto ad altri modelli animali come i topi è che consente di indagare in modo specifico il processo di infezione in tempo reale e di studiare per immagine le interazioni specifiche tra ascessi di microbatteri e microfagi o neutrofili. Questo passaggio è un problema critico per la successiva pressione di iniezione nel pesce zebra. A causa dell'elevata propensione del mycobacterium abscessus grezzo a formare aggregati di grandi dimensioni e a produrre codici, è quindi necessario un trattamento specifico per preparare inoculari omogenei e quantitativamente controllati prima della microiniezione.

Per preparare il m ascesso, raccogliere inoculare colture in crescita esponenziale da fiasche di coltura tissutale da 150 centimetri quadrati in provette di plastica sterili da 50 millilitri e centrifugare a 4.000 volte G e temperatura ambiente per 15 minuti. Utilizzare un millilitro di Middlebrook seven H nine, integrato con l'arricchimento OADC, più tween 80 di seguito denominato seven H nine medium per risospendere il pellet ed Eloqua. 200 microlitri di sospensioni batteriche in provette da 1,5 millilitri con ago da 26 gauge omogeneizzano ogni quad ALI di sospensione batterica 15 volte.

Quindi, utilizzando un bagno d'acqua, sonicare sonicare tre volte per 10 secondi ciascuna con pause di dieci secondi. Nel mezzo, aggiungere un millilitro di sette H nove, medio e brevemente vortice, quindi centrifugare a 100 volte G per tre minuti. Raccogliere con cura i micobatteri contenenti surnatanti per evitare grumi e tirare le sospensioni omogenee in un tubo di plastica sterile da 50 millilitri.

Centrifugare la sospensione a 4.000 volte G per cinque minuti e utilizzare 200 microlitri di terreno sette H nove per risospendere il pellet e valutare l'inoculo batterico finale. Secondo il protocollo di testo, La dimostrazione visiva di questo metodo, è fondamentale in quanto i passaggi sono difficili da imparare perché la manipolazione precisa e delicata dell'iniezione negli embrioni di zebrafish al microscopio e l'acquisizione della tecnica di microiniezione hanno richiesto tempo per eseguire la microiniezione di M abscessus a circa 24 ore. Dopo la fecondazione o HPF, usa una pinzetta per rivestire gli embrioni in una capsula di Petri da 100 millimetri e mantenerli a 28,5 gradi Celsius.

Trasferire 30 embrioni da 48 HPF in una camera di posizionamento a forma di V riempita con 25 millilitri di acqua di pesce contenente 270 milligrammi per litro di trica con una punta del micro caricatore tagliata. Deporre correttamente gli embrioni nei canali per facilitarne la manipolazione. Utilizzare PBST con 0,05% tra 80 per diluire l'inoculo microbatterico fino alla CFU desiderata da erogare e includere il 10% di rosso fenolo per verificare la corretta iniezione con una punta del micro caricatore.

Caricare un ago per microiniezione con da cinque a 10 microlitri di inoculo batterico. Collegare l'ago per microiniezione al supporto di un micromanipolatore collegato all'iniettore e utilizzare una pinzetta sottile per rompere la parte superiore dell'ago. Per ottenere un diametro di apertura da cinque a 10 micrometri.

Calibrare il volume di iniezione regolando la pressione e il tempo di microiniezione. Quindi, per ottenere il volume di iniezione richiesto, misurare il diametro di una gocciolina espulsa nel tuorlo di un embrione per microiniettarla nella vena del coccodrillo. Posizionare l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'ago e posizionare la punta dell'ago vicino all'apertura urogenitale.

E spingi delicatamente la punta dell'ago nell'embrione fino a quando non perfora appena la regione della vena della coccola. Quindi erogare il volume desiderato di sospensione batterica, di solito da uno a tre nanolitri contenenti circa 100 CFU per nanolitro. Incubare e monitorare gli embrioni secondo il protocollo di testo per eseguire il lipo Choate, deplezione dei macrofagi e degli embrioni a 24 HP. Destino, gli embrioni, e trasferirli in una capsula per iniezione riempita con acqua di pesce con trica.

Quindi orientarli con il lato dorsale verso il basso. Dopo aver agitato la soluzione di clodronato incapsulato in liposomi, caricare l'ago microcapillare e calibrare il volume di iniezione. Forare la regione della vena di coccola come dimostrato in precedenza e iniettare da due a tre litri di soluzione.

Ripetere l'iniezione tre volte. Incubare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius e utilizzare la microscopia a fluorescenza per controllare la corretta deplezione dei macrofagi prima dell'infezione. Come dimostrato in precedenza in questo video per enumerare le unità formanti colonie o CFU al momento desiderato.

Raccogli cinque embrioni per condizione di infezione e trasferisci ogni embrione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Crioprotesi gli embrioni mediante incubazione su ghiaccio per 10 minuti dopo l'eutanasia degli embrioni con 300-500 milligrammi per litro. Trica. Utilizzare acqua sterile per lavare gli embrioni due volte in una nuova provetta.

Successivamente, dopo aver rimosso l'acqua al 2% di Triton X 100 in un XPBS per ogni embrione, e utilizzare un ago calibro 26 per omogeneizzare il tessuto per la lisi completa. Dopo aver centrifugato la sospensione, utilizzare un X-P-B-S-T per risospendere il pellet. Quindi diluizione seriale su piastra dell'omogeneo su Middlebrook sette H 10 OADC.

Integrato con B-B-L-M-G-I-T Panta, incubare le piastre a 30 gradi Celsius per quattro giorni prima di contare le colonie per l'imaging dal vivo dell'infezione da M abscessus, montare embrioni anestetizzati trica con punto di fusione basso all'1% in una piastra di Petri con fondo di vetro da 35 millimetri per un microscopio invertito o un vetrino di depressione a cavità singola per la microscopia confocale verticale. Orientare l'embrione nella posizione desiderata e coprire l'aros solidificato con acqua di pesce contenente trica per l'imaging fisso dell'infezione da M abscessus. Dopo l'eutanasia degli embrioni, trasferirli in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri e fissare gli embrioni in aldeide paraforma al 4% in un X-P-B-S-T per due ore.

A temperatura ambiente, rimuovere l'aldeide paraforme lavando gli embrioni due volte con un X-P-B-S-T per 10 minuti per preservare l'integrità dei tessuti e la fluorescenza successivamente. Incubare gli embrioni in concentrazioni crescenti di soluzione di glicerolo per 10 minuti per condizione. Deporre l'embrione incorporato nel 50% di glicerolo in una camera di osservazione.

Infine, utilizzare un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 10x o un microscopio confocale a fluorescenza con obiettivi 40x o 63x per l'acquisizione sequenziale della fluorescenza e l'imaging a trasmissione dell'embrione. Per studiare e confrontare la virulenza delle varianti ruvide e lisce di M abscessus, i batteri fluorescenti sono stati iniettati per via endovenosa in 30 embrioni esperti di HPFC. A differenza della variante liscia, quella ruvida induce un'infezione più robusta e letale con lo sviluppo di ascessi all'interno del sistema nervoso centrale.

Le differenze di virulenza sono state quantificate enumerando i CFU o determinando il numero di pixel fluorescenti che sono correlati. Ciò indica cariche batteriche più elevate per la variante ruvida Come si vede in questa figura, la cinetica di formazione del cordone ombelicale può essere monitorata e ripresa mediante videomicroscopia in modo non invasivo, dimostrando la propensione della variante ruvida a replicarsi extracellulare come mostrato qui. L'infezione degli embrioni impoveriti di macrofagi con l'ascesso ruvido M porta ad un massiccio aumento della carica batterica e della produzione di cordoni ombelicali e ad una rapida morte larvale.

Ciò indica chiaramente che i macrofagi sono necessari per controllare l'infezione da M abscessus per osservare in tempo reale le interazioni tra macrofagi e M abscessus. Può essere utilizzata la linea transgenica EG one M cherry che produce macrofagi rossi fluorescenti. Le infezioni inducono un marcato reclutamento di macrofagi con efficiente fagocitosi dei singoli batteri, mentre le corde micobatteriche rappresentano una strategia evoluta dagli ascessi per evitare di essere fagocitati dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada all'esplorazione dell'importante ruolo della codifica come nuovo meccanismo di evasione immunitaria. Grazie alla talpa di infezione del pesce zebra, diventa ora possibile osservare e descrivere il contributo in vivo dei codici nella patogenesi degli ascessi dei mycobacterium.