Name: Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Scopri la bioprinting di costrutti cellularizzati 3D utilizzando un bioink idrogel tessuto-specifico. Questo metodo modulare consente di controllare le proprietà meccaniche per applicazioni in ingegneria tissutale e modellazione di malattie.

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Gli autori ringraziano finanziamento da parte della Defense Threat Reduction Agency (DTRA) in Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC Pacifico) contratto n N6601-13-C-2027. La pubblicazione di questo materiale non costituisce approvazione da parte del governo dei risultati o le conclusioni nel presente documento.

1. idrogel Bioink formulazioni e Preparazione <ol><li> Al fine di fornire profili biochimici tessuto-specifici, preparare tessuto-specifica ECM digerire soluzioni come descritto in precedenza per il fegato. 20 Nota: In generale, questo ECM digest comprenderà 40% del volume bioink idrogel finale che viene impiegato. Diverse centinaia di millilitri di soluzione ECM digest possono essere preparati, aliquotati e congelati a -80 ° C per un uso futuro. </li><li> Prima di idrogel formulazione, sciogliere un fotoiniziatore, 2-idrossi-4 &#39;- (2-idrossietossi) -2-methylpropiophenone, in acqua a 0,1% w / v. Nota: I volumi nel range 50-100 ml possono essere preparati in anticipo e conservati al riparo dalla luce a 4 ° C per diversi mesi. </li><li> Per formare bioinks idrogel, prima sciogliere i componenti del materiale base dalla acido ialuronico (HA) Kit idrogel nella soluzione acqua-fotoiniziatore. <ol><li> Sciogliere la gelatina tiolati HA e tiolati separatamente in acqua-psoluzione hotoinitiator (passo 1,2) per rendere il 2% w / v soluzioni. </li><li> Sciogliere polietilenglicole diacrilato (PEGDA), il reticolante nei kit idrogel, in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v. </li><li> Sciogliere polietilene glicole (PEG) 8-Braccio alchino (10 kDa MW) in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v. </li></ol></li><li> In generale, formare idrogeli utilizzando il seguente schema, anche se la personalizzazione supplementare è possibile. <ol><li> Unire 4 parti 2% tiolati HA, 4 parti 2% di gelatina tiolati, 1 parte reticolante 1, 1 parte di reticolante 2 con 8 parti soluzione tessuto ECM e 2 parti di terreni di coltura degli epatociti (HCM) (o 10 parti di acqua come un non-tessuto generici idrogel SPECIFICI). Nota: Altre modificato HA o gelatina possono essere aggiunti per rendere l&#39;estrusione bioink più agevolmente. Questo è descritto di seguito. </li></ol></li><li> Agitare la miscela risultante in alto (velocità 10 su 10) per 10 secondi per miscelare prima dell&#39;uso. &lt;/ Li&gt; <li> L&#39;uso di idrogel bioink <ol><li> Per l&#39;estrusione o il collaudo bioprinting, trasferire il composto in una cartuccia siringa o della stampante e lasciare reticolare spontaneamente per 30 minuti (fase 1 reticolazione) a 37 ° C. </li><li> Per le misure reologiche, trasferire il composto in da 35 mm piastra di Petri e lasciare reticolare per 30 min. Nota: La miscela comincia immediatamente reticolare tramite formazione di legami tiolo-acrilato e inizierà ad aumentare di viscosità. La miscela deve essere trasferito in una siringa, cartuccia di stampa, o posizione di destinazione entro 10 min per evitare l&#39;intasamento di una pipetta o una siringa durante il trasferimento. </li><li> Quando reticolazione secondario (fase 2) si desidera, irradiare la fase gel 1-reticolati con la luce ultravioletta (365 nm, 18 W / cm 2) per avviare una reazione di polimerizzazione tiolo-alkyne. Nota: durata dell&#39;irradiazione dipende dalla superficie del materiale. In generale, un centimetro quadrato di materiale richiede solo 1-2 sec di esposizione ai raggi UV a questo potere UV. </li></ol></li></ol> Compatibilità 2. Stampante Test <ol><li> Prima di test di integrazione con i dispositivi bioprinting, caratteristiche di prova di estrusione in panchina laboratorio con semplici test di estrusione usando siringhe standard e piccoli suggerimenti ago calibro (20-30 gauge). <ol><li> Spingere il bioink attraverso una siringa standard per raggiungere agevolmente filamenti estrusi di idrogel con poche o nessuna urti. Estrusione di linee o modelli semplici è sufficiente a determinare il successo. </li></ol></li><li> Per l&#39;integrazione bioprinter, caricare bioink preparati da loro pipettando in cartucce per stampanti, e consentire 30 minuti per il bioink di sottoporsi spontaneamente fase 1 di reticolazione all&#39;interno della cartuccia. Nota: Volume di bioink dipende dall&#39;applicazione specifica e deve essere determinato dall&#39;utente. Cartucce per stampanti possono assomigliare o essere siringhe che sono compatibili con il dispositivo bioprinter. </li><li> Valutare la compatibilità di estrusioneper bioprinting, stampando un motivo semplice utilizzando il bioink. Ad esempio, stampare un reticolo 7 x 7 mm composto da linee parallele. Applicare pressione (pressione pneumatica ad esempio, 20 kPa), mentre la testina di stampa si porta nel piano XY ad una velocità di circa 300 mm / min. Nota: i diametri degli ugelli delle testine di varie dimensioni possono essere usati, ma ugelli conici con aperture di diametro 400-500 mM sono ottimali per la stampa sferoidi nell&#39;intervallo 250-350 micron. <ol><li> Se i materiali estrusi sono nodosi o irregolari, vedere il punto 2.4, o ridurre la quantità di PEGDA per ammorbidire il materiale reticolato fase 1. formulazioni bioink adeguatamente preparato estrudere senza intoppi, permettendo la deposizione precisa nei modelli o architetture desiderati. Nota: Le procedure bioprinting uso descritto un dispositivo bioprinting 3-D progettato su misura in casa appositamente per il tessuto costruire la stampa 32 Come tale, i parametri di stampa specifici variano notevolmente per ogni tipo di dispositivo e richiedono testin.g dall&#39;utente. </li></ol></li><li> Per migliorare le proprietà di estrusione, non modificato integrare HA e gelatina per le bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml, rispettivamente). </li></ol> 3. La convalida da Bioprinting con primari costrutti fegato <ol><li> Preparare 3-D sferoidi fegato cellula primaria per impiccagione metodi Drop come la componente cellulare 33 Nota: Bioprinting può essere eseguita senza sferoidi, ma con singole cellule sospese nei bioinks idrogel pure. Sferoidi sono impiegati qui per accelerare le interazioni cellula-cellula e costruire funzionalità. Il numero di sferoidi o cellule impiegate dipende dalla specifica applicazione e deve essere determinato dall&#39;utente. Queste procedure devono essere eseguite in condizioni sterili, utilizzando materiali sterili. <ol><li> Preparare HCM aggiungendo il contenuto scongelati del kit di componenti supplemento HCM ai media epatociti basale (HBM) e filtraggio sterile. <ol><li> Scongelare il supplemento componenti delle Nazioni Unitetil liquido. </li><li> Aggiungere i componenti supplemento (acido ascorbico, 0,5 ml; albumina sierica bovina [acidi grassi liberi], 10 ml; gentamicina solfato / amfotericina B, 0,5 ml; idrocortisone 21-emisuccinato, 0,5 ml, insulina, 0,5 ml; fattore di crescita epidermico umano ricombinante , 0,5 ml, trasferire, 0,5 ml) a 500 ml HBM. </li><li> filtro sterile attraverso un 0,45 micron o 0,22 micron filtro utilizzando un gruppo filtro bottiglia-top o un filtro di punta della siringa. </li></ol></li><li> Determinare la densità cellulare di epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate contando su un emocitometro dopo ogni tipo di cellula è stato scongelato in base alle istruzioni del fabbricante. </li><li> Combinare epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate in un rapporto 80:10:10 in numero di cellule in mezzi HCM che è stato riscaldato a 37 ° C in una provetta conica. Nota: Il volume del supporto da utilizzare dipende dal numero complessivo cella specifica per l&#39;applicazione e deve essere determinata da the utente. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 520 xga 20 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, lasciando dietro di sé il pellet. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in mezzi HCM per ottenere una sospensione cellulare contenente 1.000 cellule per 40 mezzi microlitri. Il volume totale dipende dal numero di sferoidi prodotta. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare a 96 pozzetti formato appesi piastre goccia. Aggiungere un totale di circa 1.000 cellule in ciascun pozzetto in HCM e mantenere a 37 ° C, in 5% CO 2 per 3 giorni durante i quali formano sferoidi multicellulari. </li><li> Raccogliere sferoidi fegato dalla piastra goccia appeso con una pipetta. Trasferire in un tubo da 15 ml sterile. </li></ol></li><li> sferoidi fegato Bioprint a specifici fegato idrogel bioink <ol><li> Preparare una formulazione di fegato ECM contenenti idrogel bioink come descritto al punto 1, impiegando 8% PEGDA e l&#39;8% 8-Braccio PEG alkyne come reticolanti. Utilizzare questa combinazione per la sua capacità di resulting in un idrogel vicino a taglio modulo elastico al tessuto del fegato nativo. </li><li> Che i sferoidi depositano sul fondo della provetta conica in cui sono stati collocati nel passaggio 3.1.7. Questo varia in base alle dimensioni e alla densità sferoide, ma in genere si verifica entro 1-2 min. Rimuovere tutti i supporti con attenzione aspirando o con una pipetta. </li><li> Trasferire il volume desiderato di soluzione di idrogel bioink preparata al momento per il tubo conico contenente sferoidi. Generalmente, un volume adeguato è del 10% -25% superiore al volume del costrutto 3-D da stampare. pipetta con cautela su e giù per risospendere sferoidi nella soluzione idrogel bioink. Trasferimento in una cartuccia bioprinter utilizzando una pipetta o una pipetta sierologica. </li><li> All&#39;interno della cartuccia bioprinter, lasciare che la soluzione di sottoporsi primo stadio di reticolazione (reazione tiolo-acrilato) per 30 min. Nota: A seconda delle dimensioni sferoide, la cartuccia può essere necessario lentamente ruotato o può avere bisogno di essere miscelato con i contenutiuna spatola sterile per mantenere sferoidi distribuiti nel bioink durante la fase 1 di reticolazione. Questo è meno di una necessità per bioinks preparati con cellule sospese invece di sferoidi. Nota: Dopo la fase 1 di reticolazione, gli utenti hanno una finestra operativa di diverse ore. Tuttavia, si raccomanda di eseguire il processo bioprinting rapidamente per migliorare la vitalità cellulare. </li><li> A seguito di fase 1 di reticolazione, utilizzare un dispositivo bioprinting per creare strutture di idrogel desiderati contenenti sferoidi fegato primari (o altre cellule). Nota: Questa tecnologia fornisce un sistema per biofabricating un&#39;ampia varietà di strutture. Parametri come volume totale, il numero di cellule o sferoidi, la geometria struttura stampata, e il substrato su cui sono stampati costrutti sono altamente dipendenti dagli obiettivi dell&#39;utente. </li><li> Dopo la deposizione nella configurazione desiderata, amministrare luce UV per 2-4 secondi per avviare il meccanismo di reticolazione secondaria, stabilizzando la constructs e aumentando la rigidità al livello desiderato. Nota: La concentrazione di PEG-alchino, e quindi la densità di reticolazione finale complessiva, controlla primariamente la rigidità costrutto finale. </li><li> Ripetere la 3.2.4 e 3.2.5 passaggi per creare costrutti multistrato. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diverse componenti che sono fondamentali per prendere in considerazione quando si cerca di biofabricate 3-D costrutti di tessuto, per l&#39;uso eventuale negli esseri umani o per applicazioni di screening in vitro. Impiegando i componenti cellulari appropriati determina il potenziale funzionalità end, mentre il dispositivo biofabrication si determina la metodologia generale per raggiungere il costrutto finale. Il terzo componente, il biomateriale, è altrettanto importante, in quanto serve un doppio ruol...

Negli ultimi anni, una varietà di tecnologie sono diventate disponibili che risponde alla necessità di fonti alternative di organi funzionali e tessuti cercando di fabbricare o biofabricate, li. Bioprinting è emerso come uno dei più promettenti di queste tecnologie. Bioprinting può essere pensato come una forma di robotica additivo fabbricazione di parti biologiche, che può essere utilizzato per costruire o modello praticabile strutture organo-simili o tessuto-come in 3 dimensioni. 1 Nella maggior parte dei casi, bioprinting impiega un 3-dimensionale (3 -D) dispositivo di stampa che è diretta da un computer per depositare cellule e biomateriali in posizioni precise, riassumendo così anatomicamente imitano architetture fisiologici. 2 Questi dispositivi stampare una &quot;bioink&quot;, che può assumere la forma di aggregati di cellule, cellule incapsulate in idrogel o fluidi viscosi, o microcarriers cellulari testa di serie, così come i polimeri privi di cellule che forniscono struttura meccanica o agire come PLA cell-freeceholders. 3,4 A seguito del processo bioprinting, la struttura risultante può essere maturata in strutture tessuto o organo funzionale, e utilizzati per la sua applicazione finale previsto. 5,6 Fino ad oggi, un organo completo a misura d&#39;uomo completamente funzionale non è stato stampato, ma rimane l&#39;obiettivo principale a lungo termine della bioprinting ricerca e sviluppo. 2 Tuttavia, su piccola scala &quot;organoide&quot; costrutti di tessuto sono attualmente in corso di attuazione in una serie di applicazioni, tra cui la modellazione patologia, lo sviluppo di farmaci, e lo screening tossicologico. Uno dei principali ostacoli che i ricercatori hanno incontrato nell&#39;applicazione della tecnologia bioprinting è che ben pochi materiali sono stati sviluppati per l&#39;esplicito scopo di bioprinting. Per avere successo in modo efficace in bioprinting, un biomateriale deve soddisfare 4 requisiti fondamentali. Il biomateriale deve avere 1) le proprietà meccaniche appropriate per consentire la deposizione (sia estrusione attraverso un ugello come un gel o un inkjet come una gocciolina), 2) la capacità di mantenere la sua forma come componente di una struttura 3-D dopo la deposizione, 3) la capacità di controllo utente delle 2 caratteristiche precedenti, e 4) ambiente amichevole e solidale una cella a tutti fasi della procedura bioprinting. 7 Storicamente, bioprinting lavoro è spesso cercato di impiegare biomateriali tradizionali esistenti in dispositivi bioprinting senza considerazione per la loro compatibilità, invece di progettare un biomateriale per avere le proprietà necessarie per bioprinting e successive applicazioni di post-stampa. Una varietà di bioinks sono stati sviluppati di recente per migliore interfaccia con l&#39;hardware deposizione e di fabbricazione. sistemi di idrogel standard pongono notevoli problemi perché esistono in generale sia come precursore di soluzioni fluide con insufficienti caratteristiche meccaniche, o idrogel polimerizzati che se stampati possono ostruire gli ugelli o diventano rotto sul processo di estrusione. La nostra squadra, così come OtheRS, hanno esplorato varie formulazioni idrogel per affrontare questi problemi, tra cui la stampa bioprinting sferoide cella in substrati idrogel, 5,8 cellulare e idrogel filamento di estrusione da tubi microcapillari, 9-11 estrudibili acido ialuronico (HA) idrogel nanoparticelle -Gold con proprietà di reticolazione dinamiche , 12 controllo temporale della rigidità idrogel usando fotopolimerizzabile metacrilato HA e la gelatina, 13 reticolazione a base di fibrinogeno-trombina, 14,15 a scambio ionico gel alginato-collagene, 16 e recentemente rapida polimerizzazione luce ultravioletta (UV) reticolazione iniziati con, 17 Questi esempi dimostrano la fattibilità di materiali che generano che può venire bioprinted efficace. Tuttavia, in aggiunta all&#39;integrazione con hardware, per generare successo costrutti tissutali vitali e funzionali 3-D, biomateriali devono contenere segnali biochimici e meccanici che aiuti nel mantenimento cellularevitalità e funzionalità. Questi fattori aggiuntivi, profili biochimici e meccanici, possono avere un&#39;influenza significativa sulla funzione di successo di costrutti di tessuto bioprinted. Sia le cellule e la matrice extracellulare nativa (ECM) sono responsabili di presentare una vasta gamma di molecole di segnalazione come fattori di crescita e altre citochine ad altre celle. La combinazione di questi segnali varia da tessuto a tessuto, ma può essere estremamente potente e influente nella regolazione del comportamento delle cellule e dei tessuti. 18 Impiegando componenti ECM tessuto-specifici da organi diversi e attuazione come idrogel o come parte di un idrogel è stata esplorata con successo. 19-21 Questo approccio, che comprende decellularizing un determinato tessuto, polverizzazione, e dissolverla, può essere utilizzato per produrre segnali biochimici tessuto-specifici da qualsiasi tessuto e possono essere incorporati in 3-D costrutti idrogel. 22 Inoltre,è ampiamente documentato che i tessuti del corpo occupano una vasta gamma di impedenze. 23 Pertanto, la possibilità di regolare le proprietà meccaniche dei biomateriali, quali il modulo elastico E &#39;o tranciare modulo elastico G&#39;, è uno strumento utile in ingegneria tissutale . Come descritto sopra, il controllo bioink proprietà meccaniche consente biofabrication estrusione-basato usando gel morbido, che può poi ulteriormente manipolato da reticolazione secondaria in un momento successivo, in cui i livelli di modulo elastico possono essere raggiunti che corrisponde a quella del tipo organo bersaglio. Ad esempio, biomateriali possono essere personalizzati per abbinare una rigidità di 5-10 kPa come un fegato nativo, 23 o abbinare una rigidità di 10-15 kPa come tessuto cardiaco nativo, 24,25 in teoria aumentare la capacità di questi organoidi di funzionare in un modo simile alle loro controparti tessuto nativo. L&#39;influenza della rigidità dell&#39;ambiente sul fenotipo cellulare è stato explored negli ultimi anni, in particolare rispetto alle cellule staminali. Engler et al. Hanno dimostrato che l&#39;elasticità del substrato aiutato a guidare le cellule staminali mesenchimali (MSC) verso linee con elasticità dei tessuti corrispondente a quello del substrato. 25 Questo concetto è stato ulteriormente esplorato per la differenziazione in muscolo, la funzione cardiaca, fenotipo fegato, staminali ematopoietiche proliferazione cellulare e manutenzione di potenziale terapeutico delle cellule staminali. 24,26-29 Essendo in grado di sintonizzare un idrogel di diversi moduli di elasticità è una caratteristica importante di un biomateriale che verrà utilizzato per biofabricate costrutti tissutali. 30 Qui si descrive un protocollo che rappresenta un approccio versatile utilizzato nel nostro laboratorio per formulare un sistema idrogel che può essere estruso bioprinted e personalizzata per 1) contenere il profilo biochimico di un particolare tipo di tessuto e 2) mimare il modulo elastico di tale tipo di tessuto . Affrontando questi requisiti, ci proponiamo di provide un materiale che può riassumere le caratteristiche fisico-chimiche e biologiche di in vivo tessuto. 31 Il sistema composito idrogel modulare descritta sfrutta un approccio multi-reticolazione per produrre bioinks estrudibili, e permette una reticolazione secondaria per stabilizzare e aumenta la rigidità della prodotti finali per abbinare una vasta gamma di tipi di tessuto. personalizzazione biochimica viene soddisfatta utilizzando componenti ECM tessuto-specifici. A dimostrazione, ci avvaliamo di una varietà specifica di fegato di questo sistema idrogel per Bioprint fegato funzionale costrutti organoide. Il protocollo descritto utilizza un dispositivo bioprinting 3-D personalizzato. In generale, questo protocollo può essere adattato alla maggior parte delle stampanti estrusione-based, parametri di stampa specifici variano notevolmente per ciascun tipo di dispositivo e richiedono test dall&#39;utente.

<table><tbody><tr><td>Acido ialuronico</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Idrossi-4&prime;-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone</td><td>Sigma</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Kit acido ialuronico e gelatina idrogel (HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>Il kit contiene i componenti Heprasil (acido ialuronico tiolato ed eparinizzato), Gelin-S (tiolato gelatina) ed Extralink (PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&nbsp; kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>Epatociti umani primari</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>Cellule stellate epatiche umane primarie</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Cellule Kupffer umane primarie</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>Terreno basale per epatociti (HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>Terreno per epatociti Kit di integratori</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot Kits (contiene acido ascorbico, 0,5&nbsp; Ml; albumina sierica bovina [senza acidi grassi], 10&nbsp; Ml; gentamicina solfato/amfotericina B, 0,5&nbsp; Ml; idrocortisone 21-emiuccinato, 0,5&nbsp; Ml; insulina, 0,5&nbsp; Ml; fattore di crescita epidermico ricombinante umano, 0,5&nbsp; Ml; trasferimento, 0,5&nbsp; ml)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Altri produttori sono ok.</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>Altri produttori sono ok.</td></tr><tr><td>Tessuto fresco di cadavere suino</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore</td><td>qualsiasi</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bioprinter</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Il bioprinter qui descritto è stato costruito su misura internamente. In generale, altri dispositivi sono adeguati a condizione che supportino la stampa basata sull'estrusione controllata da computer di materiali idrogel.</td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a goccia sospesa</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001</td><td>Piattaforma di coltura 3D InSphero GravityPlus</td></tr></tbody></table>

bioprinting cellularized costruisce utilizzando un tessuto-specifici idrogel bioink

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Il bioprinting è emerso come un approccio di biofabbricazione versatile per la creazione di costrutti di organi di ingegneria tissutale. Questi costrutti hanno un potenziale utilizzo come sostituti di organi per l'impianto nei pazienti e, se creati su scala più piccola, come "organoidi" modello che possono essere utilizzati in sistemi in vitro per lo screening farmacologico e tossicologico.
Nonostante lo sviluppo di un'ampia varietà di dispositivi di bioprinting, l'applicazione della tecnologia di bioprinting può essere limitata dalla disponibilità di materiali che accelerano le procedure di bioprinting e supportano la vitalità e la funzione cellulare fornendo segnali specifici per i tessuti. Qui descriviamo un versatile sistema di idrogel a base di acido ialuronico (HA) e gelatina composto da un protocollo di reticolazione multi-crosslinker a 2 stadi, in grado di fornire segnali biochimici specifici per il tessuto e imitare le proprietà meccaniche dei tessuti in vivo. 
I fattori biochimici sono forniti incorporando materiali di matrice extracellulare derivati dai tessuti, che includono potenti fattori di crescita. Le proprietà meccaniche dei tessuti sono combinazioni controllate di reticolanti basati su PEG con pesi molecolari, geometrie (lineari o multi-braccio) e gruppi funzionali variabili per produrre bioink estrudibili e valori finali di rigidità al taglio del costrutto in un ampio intervallo (da 100 Pa a 20 kPa). Utilizzando questi parametri, i bioink idrogel sono stati utilizzati per biostampare gli sferoidi epatici primari in un bioink specifico per il fegato per creare costrutti epatici in vitro con un'elevata vitalità cellulare e una produzione funzionale misurabile di albumina e urea. Questa metodologia fornisce un quadro generale che può essere adattato per la futura personalizzazione di idrogel per la biofabbricazione di un'ampia gamma di tipi di costrutti tissutali.

Quando le procedure sopra descritte vengono seguite correttamente, idrogel dovrebbero contenere un profilo biochimico specifico per il tipo di tessuto bersaglio, 20 permettono un elevato grado di controllo su bioprinting e modulo elastico finale, 34 e supportano cellule vitali funzionali nei costrutti tissutali. idrogel Personalizzazione Per meglio fegato nativo mimica, la bioink i...

Descriviamo un insieme di protocolli che, insieme, forniscono un bioink idrogel tessuto-mimando con le quali costrutti di tessuto 3-D funzionali e vitali possono essere bioprinted per l&#39;utilizzo in applicazioni di screening in vitro.

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare un approccio versatile per progettare bioinchiostri a base di idrogel che possono essere estrusi attraverso dispositivi di biostampa. I bioinchiostri possono quindi essere utilizzati per fabbricare costrutti tridimensionali di tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biostampa, ad esempio come controllare le proprietà meccaniche necessarie per ottenere un materiale estrudibile mediante un bioprinter.Il principale vantaggio di questa tecnica è l'utilizzo di componenti disponibili in commercio combinati in modo modulare per creare un bioinchiostro idrogel semplice ed efficace, utilizzabile nella biostampa. Le applicazioni di queste tecnologie comprendono la creazione di organoidi tridimensionali che possono essere impiegati per modellare con precisione gli effetti di farmaci, tossine e malattie. Sebbene questo metodo possa fornire un'impalcatura per la biostampa di costrutti epatici tridimensionali, può essere applicato anche ad altri tipi di tessuti, come muscolo, polmone e colon.Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché vengono utilizzati diversi reagenti per creare il bioinchiostro idrogel, ma in realtà il procedimento è piuttosto semplice. A dimostrare la procedura sarà Young-Joon Seol, un ricercatore post-dottorato del nostro team. Per iniziare, preparare un digest di matrice extracellulare specifico per il tessuto da utilizzare nella formulazione dell'idrogel, come descritto altrove.Quindi, sciogliere un fotoiniziatore in acqua in un rapporto peso/volume dello 0,1%. Per formare i bioinchiostri idrogel, sciogliere prima i componenti base dei kit per idrogel di acido ialuronico in aliquote individuali della soluzione acquosa di fotoiniziatore. Successivamente, combinare la soluzione di matrice extracellulare (ECM), l'acido ialuronico tiolato al 2%, la gelatina tiolata al 2%, i crosslinker e il mezzo di coltura per epatociti nei rapporti indicati qui. Per migliorare le proprietà di estrusione del bioinchiostro, aggiungere 1,5 milligrammi per millilitro di acido ialuronico non modificato e 30 milligrammi per millilitro di gelatina alla miscela.Successivamente, vortexare la miscela ottenuta ad alta velocità per dieci secondi prima dell'uso. Prima di testare il bioink in un dispositivo di bioprinting, valutarne inizialmente le caratteristiche di estrusione sul banco del laboratorio. Utilizzando una siringa standard, prelevare un campione di bioink e quindi applicare all'estremità della siringa un ago di calibro compreso tra 20 e 30.Lasciare che il bioinchiostro si reticoli, quindi spingerlo attraverso l'ago per ottenere filamenti di idrogel estrusi uniformemente. Se la formulazione è in grado di creare un filamento con poche o nessuna irregolarità, è pronta per la biostampa. Per caricare le preparazioni di bioinchiostro in un bioprinter, pipettare i bioinchiostri in cartucce per stampante sterili.Lasciarli a riposo per 30 minuti prima dell'estrusione, poiché il bioink subirà spontaneamente la prima fase di reticolazione all'interno della cartuccia. Successivamente, inserire la cartuccia nell'apparato di stampa e collegare una sorgente di pressione pneumatica alla cartuccia. Preparare un modello semplice, come questa griglia di sette per sette millimetri composta da linee parallele, da stampare al fine di valutare la compatibilità del materiale con l'estrusione.Mentre la testina di stampa si muove nel piano XY a una velocità di circa 300 millimetri al minuto, applicare una pressione di 20 chilopascal al cartuccia per estrudere il bioink. Se i materiali estrusi sono irregolari o presentano grumi, ridurre la quantità di crosslinker aggiunta al fine di ammorbidire il materiale incrociato nella fase uno. Una formulazione di bioink correttamente preparata dovrebbe estrudersi in modo uniforme, consentendo un deposito preciso e la formazione di architetture definite.Preparare sferoidi epatici tridimensionali di cellule primarie in una piastra a 96 pozzetti utilizzando il metodo della goccia sospesa, come descritto nel protocollo testuale allegato. Dopo tre giorni di coltura, raccogliere i sferoidi epatici dalla piastra della goccia sospesa mediante pipetta e trasferirli in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Lasciare sedimentare i sferoidi sul fondo del tubo conico per uno o due minuti.Quindi, aspirare con attenzione il mezzo utilizzando una pipetta. Trasferire dal 110 al 125 percento del volume desiderato del costrutto 3D da stampare della soluzione di bioinchiostro idrogel appena preparata nel tubo conico contenente gli sferoidi. Successivamente, pipettare delicatamente gli sferoidi su e giù per ri-sospendere loro nella soluzione di bioinchiostro idrogel.Una volta sospesi uniformemente, trasferire la soluzione di sferoidi in una cartuccia per biostampante utilizzando una pipetta e lasciare che la soluzione subisca la prima fase di reticolazione per 30 minuti. Al termine di questa fase di reticolazione, utilizzare un dispositivo di biostampaggio per creare le strutture desiderate di idrogel contenenti gli sferoidi epatici primari. Dopo ogni strato depositato, esporre l'inchiostro biologico stampato alla luce UV per due o quattro secondi per avviare il meccanismo di reticolazione secondaria.Questo stabilizzerà le strutture e aumenterà la rigidità al livello desiderato. La concentrazione di PEG alchino nella soluzione controlla la densità complessiva di reticolazione e, di conseguenza, determina principalmente la rigidità della struttura finale. Dopo la biostampa, è stata osservata un'elevata vitalità cellulare nelle strutture epatiche mediante microscopia confocale.In condizioni ambientali ottimali, la vitalità dovrebbe essere superiore all'85%. Inoltre, quando i costrutti sono stati colorati per marcatori indicativi del tessuto epatico, è stata osservata un'espressione positiva di CYP3A4, un'isoforma del citocromo P450, albumina intracellulare, E-cadherina, una proteina di adesione cellula-cellula epiteliale, e DPP4, una proteina espressa in elevata misura nel fegato. Quando il mezzo di coltura è stato analizzato per i livelli di urea e albumina, si è riscontrato che il costrutto secreta sia urea che albumina a livelli costanti durante il periodo di 14 giorni. Questo suggerisce ulteriormente che i bioinchiostri a base di idrogel specifici per il tessuto contribuiscano a mantenere la funzionalità delle cellule epatiche.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore dalla preparazione al completamento, se svolta correttamente. Tuttavia, ciò dipende spesso dal particolare dispositivo di biostampa utilizzato. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i passaggi dimostrati devono frequentemente essere adattati per risultare compatibili con altri tipi di tessuto o dispositivi di biostampa.Seguendo questo procedimento, è possibile creare altre formulazioni di bioinchiostri a base di idrogel per supportare la biostampa di altri tipi di tessuti. Lo sviluppo di queste tecnologie ha contribuito a gettare le basi per la creazione di piattaforme multi-organoide, "organi-su-un-chip", per lo screening di farmaci e la modellizzazione delle malattie. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come iniziare a progettare materiali utilizzabili per la biostampa di costrutti tessutali tridimensionali mediante l'uso di reticolazione in più passaggi.Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere estremamente pericoloso per la vista, e precauzioni come l'uso di occhiali protettivi anti-UV devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

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Bioengineering

Bioingegneria

Un bioprinter stato usato per creare idrogel patterned basato su uno stampo sacrificale. Lo stampo poloxamer stata riempita con un secondo idrogel e quindi eluita, lasciare vuoti che sono stati riempiti con una terza idrogel. Questo metodo utilizza eluizione veloce e buona stampabilità di polossalene di generare architetture complesse di biopolimeri.

La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D

Un bioprinter cartesiano è stato progettato e fabbricato per consentire la deposizione di più materiali in geometrie precise e riproducibili, consentendo anche il controllo dei fattori ambientali. Utilizzando il bioprinter tridimensionale, è possibile stampare e riprodurre facilmente costrutti complessi e fattibili.

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Questo protocollo descrive una metodologia di bioprinting che utilizza un sistema di deposito robotico automatizzato che incorpora segnali di guida topografici incisi con la deposizione di precisione di una cella contenente idrogel bioink. Le celle stampate vengono consegnate direttamente alle caratteristiche incise e sono in grado di percepirle e orientarsi con esse.

Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle

Forniamo un protocollo generalizzato basato su una strategia di multimateriali microfluidici per un letto vascolare di microfibrous, dove un tipo di cellula secondaria potrebbe essere ulteriormente seminato nello spazio interstiziale di questa struttura di microfibrous per generare organoids e tessuti vascolarizzati di ingegneria.

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Cartilagine e pelle analoghi erano bioprinted utilizzando un bioink nanocellulose-alginato basato. Il bioinks erano cellularizzati prima della stampa tramite un'unità di miscelazione passiva di passaggio singolo. I costrutti sono stati dimostrati per essere uniformemente cellularizzati, hanno alta attuabilità e mostre favorevoli marcatori di differenziazione.

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Abbiamo sviluppato un modello di cancro al seno eterogeneo costituito da cellule del tumore e del fibroblasto immortalate incorporate in un bioink di alginato/gelatina bioprintable. Il modello ricapitola il microambiente tumorale in vivo e facilita la formazione di sferoidi multicellulari tumore, producendo la comprensione dei meccanismi di tumorigenesi di guida.

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Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule

Questo protocollo evidenzia un metodo per valutare rapidamente la biocompatibilità di un inchiostro biomateriale idrogel composito di nanocellulosa cristallina (CNC)/agarosio con mastociti derivati dal midollo osseo di topo in termini di vitalità cellulare ed espressione fenotipica dei recettori della superficie cellulare, Kit (CD117) e recettore IgE ad alta affinità (FcεRI).

Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo

Questo protocollo descrive una tecnica di stampa 3D per fabbricare strutture simili all'osso depositando un inchiostro di fosfato di calcio in un supporto granulare a base di gelatina. Gli analoghi ossei stampati sono depositati in forma libera, con flessibilità per la raccolta diretta della stampa o la reticolazione all'interno di una matrice cellulare vivente per costrutti multifasici.

Bioprinting omnidirezionale ceramico in sospensioni caricate di cellule per la generazione di analoghi ossei

Scopri la bioprinting di costrutti cellularizzati 3D utilizzando un bioink idrogel tessuto-specifico. Questo metodo modulare consente di controllare le proprietà meccaniche per applicazioni in ingegneria tissutale e modellazione di malattie.

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

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