Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare un approccio versatile per progettare bioinchiostri a base di idrogel che possono essere estrusi attraverso dispositivi di biostampa. I bioinchiostri possono quindi essere utilizzati per fabbricare costrutti tridimensionali di tessuto. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biostampa, ad esempio come controllare le proprietà meccaniche necessarie per ottenere un materiale estrudibile mediante un bioprinter.

Il principale vantaggio di questa tecnica è l'utilizzo di componenti disponibili in commercio combinati in modo modulare per creare un bioinchiostro idrogel semplice ed efficace, utilizzabile nella biostampa. Le applicazioni di queste tecnologie comprendono la creazione di organoidi tridimensionali che possono essere impiegati per modellare con precisione gli effetti di farmaci, tossine e malattie. Sebbene questo metodo possa fornire un'impalcatura per la biostampa di costrutti epatici tridimensionali, può essere applicato anche ad altri tipi di tessuti, come muscolo, polmone e colon.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché vengono utilizzati diversi reagenti per creare il bioinchiostro idrogel, ma in realtà il procedimento è piuttosto semplice. A dimostrare la procedura sarà Young-Joon Seol, un ricercatore post-dottorato del nostro team. Per iniziare, preparare un digest di matrice extracellulare specifico per il tessuto da utilizzare nella formulazione dell'idrogel, come descritto altrove.

Quindi, sciogliere un fotoiniziatore in acqua in un rapporto peso/volume dello 0,1%. Per formare i bioinchiostri idrogel, sciogliere prima i componenti base dei kit per idrogel di acido ialuronico in aliquote individuali della soluzione acquosa di fotoiniziatore. Successivamente, combinare la soluzione di matrice extracellulare (ECM), l'acido ialuronico tiolato al 2%, la gelatina tiolata al 2%, i crosslinker e il mezzo di coltura per epatociti nei rapporti indicati qui. Per migliorare le proprietà di estrusione del bioinchiostro, aggiungere 1,5 milligrammi per millilitro di acido ialuronico non modificato e 30 milligrammi per millilitro di gelatina alla miscela.

Successivamente, vortexare la miscela ottenuta ad alta velocità per dieci secondi prima dell'uso. Prima di testare il bioink in un dispositivo di bioprinting, valutarne inizialmente le caratteristiche di estrusione sul banco del laboratorio. Utilizzando una siringa standard, prelevare un campione di bioink e quindi applicare all'estremità della siringa un ago di calibro compreso tra 20 e 30.

Lasciare che il bioinchiostro si reticoli, quindi spingerlo attraverso l'ago per ottenere filamenti di idrogel estrusi uniformemente. Se la formulazione è in grado di creare un filamento con poche o nessuna irregolarità, è pronta per la biostampa. Per caricare le preparazioni di bioinchiostro in un bioprinter, pipettare i bioinchiostri in cartucce per stampante sterili.

Lasciarli a riposo per 30 minuti prima dell'estrusione, poiché il bioink subirà spontaneamente la prima fase di reticolazione all'interno della cartuccia. Successivamente, inserire la cartuccia nell'apparato di stampa e collegare una sorgente di pressione pneumatica alla cartuccia. Preparare un modello semplice, come questa griglia di sette per sette millimetri composta da linee parallele, da stampare al fine di valutare la compatibilità del materiale con l'estrusione.

Mentre la testina di stampa si muove nel piano XY a una velocità di circa 300 millimetri al minuto, applicare una pressione di 20 chilopascal al cartuccia per estrudere il bioink. Se i materiali estrusi sono irregolari o presentano grumi, ridurre la quantità di crosslinker aggiunta al fine di ammorbidire il materiale incrociato nella fase uno. Una formulazione di bioink correttamente preparata dovrebbe estrudersi in modo uniforme, consentendo un deposito preciso e la formazione di architetture definite.

Preparare sferoidi epatici tridimensionali di cellule primarie in una piastra a 96 pozzetti utilizzando il metodo della goccia sospesa, come descritto nel protocollo testuale allegato. Dopo tre giorni di coltura, raccogliere i sferoidi epatici dalla piastra della goccia sospesa mediante pipetta e trasferirli in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Lasciare sedimentare i sferoidi sul fondo del tubo conico per uno o due minuti.

Quindi, aspirare con attenzione il mezzo utilizzando una pipetta. Trasferire dal 110 al 125 percento del volume desiderato del costrutto 3D da stampare della soluzione di bioinchiostro idrogel appena preparata nel tubo conico contenente gli sferoidi. Successivamente, pipettare delicatamente gli sferoidi su e giù per ri-sospendere loro nella soluzione di bioinchiostro idrogel.

Una volta sospesi uniformemente, trasferire la soluzione di sferoidi in una cartuccia per biostampante utilizzando una pipetta e lasciare che la soluzione subisca la prima fase di reticolazione per 30 minuti. Al termine di questa fase di reticolazione, utilizzare un dispositivo di biostampaggio per creare le strutture desiderate di idrogel contenenti gli sferoidi epatici primari. Dopo ogni strato depositato, esporre l'inchiostro biologico stampato alla luce UV per due o quattro secondi per avviare il meccanismo di reticolazione secondaria.

Questo stabilizzerà le strutture e aumenterà la rigidità al livello desiderato. La concentrazione di PEG alchino nella soluzione controlla la densità complessiva di reticolazione e, di conseguenza, determina principalmente la rigidità della struttura finale. Dopo la biostampa, è stata osservata un'elevata vitalità cellulare nelle strutture epatiche mediante microscopia confocale.

In condizioni ambientali ottimali, la vitalità dovrebbe essere superiore all'85%. Inoltre, quando i costrutti sono stati colorati per marcatori indicativi del tessuto epatico, è stata osservata un'espressione positiva di CYP3A4, un'isoforma del citocromo P450, albumina intracellulare, E-cadherina, una proteina di adesione cellula-cellula epiteliale, e DPP4, una proteina espressa in elevata misura nel fegato. Quando il mezzo di coltura è stato analizzato per i livelli di urea e albumina, si è riscontrato che il costrutto secreta sia urea che albumina a livelli costanti durante il periodo di 14 giorni. Questo suggerisce ulteriormente che i bioinchiostri a base di idrogel specifici per il tessuto contribuiscano a mantenere la funzionalità delle cellule epatiche.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore dalla preparazione al completamento, se svolta correttamente. Tuttavia, ciò dipende spesso dal particolare dispositivo di biostampa utilizzato. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i passaggi dimostrati devono frequentemente essere adattati per risultare compatibili con altri tipi di tessuto o dispositivi di biostampa.

Seguendo questo procedimento, è possibile creare altre formulazioni di bioinchiostri a base di idrogel per supportare la biostampa di altri tipi di tessuti. Lo sviluppo di queste tecnologie ha contribuito a gettare le basi per la creazione di piattaforme multi-organoide, "organi-su-un-chip", per lo screening di farmaci e la modellizzazione delle malattie. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come iniziare a progettare materiali utilizzabili per la biostampa di costrutti tessutali tridimensionali mediante l'uso di reticolazione in più passaggi.

Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere estremamente pericoloso per la vista, e precauzioni come l'uso di occhiali protettivi anti-UV devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.