Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare un approccio versatile per la progettazione di bioink idrogel che possono essere estrusi attraverso dispositivi di bioprinting. I bioink possono quindi essere utilizzati per fabbricare costrutti di tessuti tridimensionali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del bioprinting, ad esempio come controllare le proprietà meccaniche necessarie per fornire un materiale che può essere estruso utilizzando un bioprinter.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizziamo componenti disponibili in commercio combinati in modo modulare per creare un bioink idrogel biostampabile semplice ed efficace. Le applicazioni di queste tecnologie includono la creazione di organoidi tissutali 3D che possono essere utilizzati per modellare con precisione gli effetti di farmaci, tossine e malattie. Sebbene questo metodo possa fornire un quadro per la biostampa di costrutti epatici 3D, può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto come muscoli, polmoni e colon.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci sono una serie di reagenti diversi utilizzati per creare il bioink idrogel, ma in realtà è abbastanza semplice. A dimostrare la procedura sarà Young-Joon Seol, un post-doc del nostro team. Per iniziare, preparare un digestato della matrice extracellulare tessuto-specifico da utilizzare nella formulazione dell'idrogel come descritto altrove.

Quindi, sciogliere un fotoiniziatore in acqua con un rapporto peso/volume dello 0,1% Per formare i bioink idrogel, sciogliere prima i componenti del materiale di base dai kit di idrogel di acido ialuronico in singole aliquote della soluzione del fotoiniziatore d'acqua. Quindi, combinare la soluzione ECM, l'acido ialuronico tiolato al 2%, la gelatina tiolata al 2%, i reticolanti e i terreni di coltura degli epatociti nei rapporti mostrati qui. Per migliorare le proprietà di estrusione del bioink, aggiungere alla miscela 1,5 milligrammi per millilitro di acido ialuronico non modificato e 30 milligrammi per millilitro di gelatina.

Quindi, agitare la miscela risultante alla massima potenza per dieci secondi prima dell'uso. Prima di testare il bioink in un dispositivo di bioprinting, testare le caratteristiche di estrusione sul banco di laboratorio. Utilizzando una siringa standard, far cadere un campione del bioink e quindi collegare un ago da 20 a 30 gauge alla siringa.

Lasciare che il bioink reticolare e quindi spingere il bioink attraverso l'ago per ottenere filamenti di idrogel estrusi in modo uniforme. Se la formulazione è in grado di creare un filamento con poche o nessuna protuberanza, allora è pronto per il bioprinting. Per caricare i preparati bioink in una bioprinter, pipettare i bioink in cartucce per stampanti sterilizzate.

Lasciarli riposare per 30 minuti prima dell'estrusione poiché il bioink subirà una reticolazione spontanea di prima fase all'interno della cartuccia. Quindi, caricare la cartuccia nella configurazione di stampa e collegare una fonte di pressione pneumatica alla cartuccia. Prepara un modello semplice, come questa griglia di sette per sette millimetri di linee parallele, da stampare per valutarne la compatibilità con l'estrusione.

Mentre la testina di stampa si muove nel piano XY a una velocità di circa 300 millimetri al minuto, applicare una pressione di 20 kilopascal alla cartuccia per estrudere il bioink. Se i materiali estrusi sono grumosi o irregolari, ridurre la quantità di reticolante aggiunto per ammorbidire il materiale reticolato di stadio. Una formulazione di bioink adeguatamente preparata dovrebbe estrudere uniformemente, consentendo una deposizione e architetture precise.

Preparare sferoidi epatici a cellule primarie 3D in una piastra a 96 pozzetti utilizzando il metodo della goccia sospesa come descritto nel protocollo di testo allegato. Dopo tre giorni di coltura, raccogliere gli sferoidi epatici dalla piastra di goccia appesa utilizzando una pipetta e trasferirli in una provetta conica sterile da 15 millilitri. Lascia che gli sferoidi si depositino sul fondo del tubo conico per uno o due minuti.

Quindi, aspirare accuratamente il terreno con una pipetta. Trasferire dal 110 al 125 percento del volume di costruzione 3D stampato desiderato della soluzione di idrogel bioink appena preparata nel tubo conico contenente gli sferoidi. Quindi, pipettare con cura gli sferoidi su e giù per ri-sospenderli nella soluzione di idrogel bioink.

Una volta sospesa uniformemente, trasferire la soluzione di sferoide in una cartuccia per bioprinter utilizzando una pipetta e lasciare che la soluzione subisca la prima fase di reticolazione per 30 minuti. Dopo la fase di reticolazione, utilizzare un dispositivo di bioprinting per creare le strutture di idrogel desiderate contenenti gli sferoidi epatici primari. Dopo ogni strato di deposizione, esporre il bioink stampato alla luce UV per due o quattro secondi per avviare il meccanismo di reticolazione secondario.

Questo stabilizzerà i costrutti e aumenterà la rigidità al livello desiderato. La concentrazione di alchino PEG nella soluzione è ciò che controlla la densità di reticolazione complessiva, e quindi controlla principalmente la rigidità del costrutto finale. Dopo il bioprinting, è stata osservata un'elevata vitalità cellulare nei costrutti epatici utilizzando la microscopia confocale.

In condizioni ambientali ottimali, la vitalità dovrebbe essere superiore all'85%Inoltre, quando i costrutti sono stati colorati per i marcatori indicativi del tessuto epatico, sono stati osservati l'espressione positiva del CYP3A4, un'isoforma del citocromo P450, l'albumina intracellulare, l'E-caderina, una proteina di adesione cellula-cellula epiteliale, e la DPP4, una proteina altamente espressa nel fegato. Quando il terreno di coltura è stato testato per i livelli di urea e albumina, si è scoperto che il costrutto secerneva sia urea che albumina a livelli costanti nel corso dei 14 giorni. Ciò suggerisce inoltre che i bioink idrogel tessuto-specifici aiutano a mantenere la funzione delle cellule epatiche.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore dall'inizio alla fine se viene eseguita correttamente. Tuttavia, questo dipende spesso dal particolare dispositivo di bioprinting utilizzato. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i passaggi dimostrati devono spesso essere adattati per essere compatibili con altri tipi di tessuto o dispositivi di bioprinting.

Seguendo questa procedura, è possibile creare altre formulazioni di bioink in idrogel per supportare la biostampa di altri tipi di tessuto. Lo sviluppo di queste tecnologie ha contribuito a spianare la strada alla creazione di piattaforme multi-organoidi, body-on-a-chip, per lo screening di farmaci e la modellazione delle malattie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come iniziare a progettare materiali che possono essere utilizzati per la biostampa di costrutti di tessuti 3D utilizzando la reticolazione in più fasi.

Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere estremamente pericoloso per la vista e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di occhiali protettivi dai raggi UV.