Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare singole molecole e nanoparticelle estremamente piccole senza l'uso di marcatori, mediante una tecnica basata sulla tecnologia dei risonatori ottici e sul bloccaggio di frequenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi biochimici, come la piegatura delle proteine e la cinetica di legame. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la molecola bersaglio non necessita di essere marcata per poter essere rilevata.

La configurazione per questa tecnica prevede l'accoppiamento di un chip microscopico OID a una fibra ottica. Per prima cosa, procurarsi un chip microscopico OID. Si tratta di un chip di silicio di circa 6,5 millimetri per 5,5 millimetri con un micro OID realizzato al suo interno.

Come mostrato in questa immagine, il micro OID presenta un diametro maggiore compreso tra 80 e 100 micrometri e un diametro minore di due micrometri. Per il momento, mettere da parte il chip e preparare la fibra per accoppiare il chip. Utilizzare una fibra monomodale su una bobina e svolgere circa un metro di fibra.

Prendere un paio di spelafili e posizionarlo approssimativamente al centro della fibra srotolata. Utilizzarli per rimuovere un segmento lungo 2,5 centimetri del rivestimento polimerico dalla fibra. Questa regione spelata è la zona di accoppiamento della fibra.

Dopo aver sguainato la fibra, utilizzare un panno senza lanugine e alcol isopropilico per pulire la regione sguainata. Successivamente, utilizzare un supporto per fibra con morsetti magnetici per mantenere fissata la parte pulita. Per il passaggio successivo, predisporre dei motori passo-passo in modo da tirare la fibra in direzioni opposte.

Posizionare il supporto della fibra in modo da permettere l'attacco dei motori passo-passo alla fibra su entrambi i lati della regione sguainata. Inoltre, collegare un laser a un'estremità della fibra per fungere da sorgente luminosa. Avviare i motori passo-passo in direzioni opposte per allungare la fibra e utilizzare una fiamma di idrogeno per fondere la porzione sguainata della fibra.

Monitorare costantemente la luce dispersa lateralmente dalla fibra. L'effetto di lampeggiamento indica che la trasmissione della luce attraverso la fibra è instabile e che è necessario un ulteriore assottigliamento. Quando il lampeggiamento cessa, interrompere il riscaldamento e lo stiramento della fibra, che sarà stata ridotta a circa 500 nanometri.

Dopo aver ridotto lo spessore della fibra, scollegare la sorgente luminosa e rimuovere la fibra con il suo supporto a morsetto magnetico dai motori ostinati. Successivamente, spostare la fibra su un banco isolato pneumaticamente dotato di una piattaforma di posizionamento. Posizionare la fibra nel suo supporto a morsetto magnetico su un blocco di supporto davanti al chip del campione.

La piattaforma di posizionamento è una piattaforma di posizionamento nano a tre assi posta su una micrometrica a tre assi. Oltre alla piattaforma di posizionamento nano, sono presenti colonne di imaging per la vista dall'alto e laterale per facilitare l'allineamento. Continuare a lavorare con la fibra assicurandosi che la parte sguainata sia vicina alla piattaforma di posizionamento.

Prepararsi a inserire l'estremità libera della fibra nel sistema di misurazione. Dopo aver tagliato l'estremità libera, inserirla in un adattatore per fibra nuda. Utilizzare l'adattatore per collegare la fibra all'ingresso di un rivelatore fotoelettrico bilanciato automaticamente, connesso a un oscilloscopio.

Ora concentrarsi sull'altra estremità della fibra. Innanzitutto, collegare questa estremità a un accoppiatore ottico. Successivamente, accoppiare la fibra all'uscita di un polarizzatore in linea, il cui ingresso proviene da un divisore di fascio 50 50 e da un laser a diodo accordabile.

Di seguito è riportato uno schema delle connessioni effettuate fino a questo punto. Si noti che il secondo output del divisore di fascio passa attraverso un polarizzatore in linea ed è utilizzato come riferimento per il ricevitore fotoelettrico bilanciato automaticamente. Il passo successivo consiste nel prepararsi a montare il chip micro OID utilizzando un portacampioni in acciaio inossidabile.

Utilizzare nastro adesivo bifacciale per fissare il chip al supporto del campione. Quindi posizionare il microchip sulla parte superiore del supporto del campione. A questo punto montare il supporto del campione con il chip sulla piattaforma di posizionamento nano.

Qui il supporto e il chip sono posizionati sullo stadio di allineamento con il micrometro a tre assi. Posizionare grossolanamente il chip del campione rispetto alla fibra. Ecco il chip e la fibra dopo il completamento del posizionamento preliminare.

Successivamente, regolare ulteriormente il posizionatore e utilizzare le colonne di imaging per allineare il chip parallelamente alla fibra ottica. Con un micro OID avente la lunghezza d'onda del laser della fibra, questa immagine mostra una fibra e un micro. Dopo il passaggio di posizionamento fine, l'adesivo circolare vicino al centro del campo visivo è un ausilio per il posizionamento. Procedere ora alla ricerca della lunghezza d'onda di risonanza del micro.

Generare un segnale di tensione con forma d'onda triangolare per regolare la lunghezza d'onda del laser a circa 635 nanometri più o meno 2,5 nanometri. Scansionare ora le lunghezze d'onda per cercare la risonanza. Osservare la trasmissione attraverso la fibra nell'oscilloscopio.

Si noti che alla lunghezza d'onda di risonanza, la trasmissione diminuisce. A questo punto, regolare la polarizzazione della luce laser. Regolare i controllori di polarizzazione in linea per ottimizzare la polarizzazione della luce laser nella fibra ottica.

Visualizzare l'output del ricevitore fotoelettrico con l'oscilloscopio e regolare la polarizzazione finché il minimo di trasmissione misurato appare più stretto possibile. Dopo aver ottimizzato la polarizzazione, costruire una camera per il campione. Sulla piattaforma del campione.

La camera consiste in un'ampolla di vetro fissata con resina epossidica a un vetrino da microscopio. Il vetrino funge da spaziatore, consentendo all'ampolla di sporgere sopra il chip e la fibra. Disporre una siringa da un millilitro e un sistema di tubicini collegati a una pompa per introdurre i campioni sperimentali nella camera a una velocità di un millilitro al minuto.

Successivamente, ottenere un campione di un millilitro equilibrato a temperatura ambiente da caricare nella pompa. In questo caso, si tratta di una soluzione contenente microsfere di silice di cinque nanometri. Una volta caricato, osservare la camera del campione ed iniettare il campione, fermandosi quando la camera è piena. L'iniezione del campione si è arrestata in questa camera, che è riempita con una soluzione contenente microsfere di silice di cinque nanometri.

Dopo aver atteso 30 secondi per ridurre al minimo l'effetto delle vibrazioni, cercare la lunghezza d'onda di risonanza del micro. Osservare nuovamente il minimo e la trasmissione attraverso la fibra alla risonanza utilizzando l'oscilloscopio. Questo è uno schema del setup sperimentale a questo punto, inclusivo del controllore proporzionale integrale derivativo o PID.

L'integratore e il dither. Eseguire il controllore in modalità di blocco automatico con blocco al picco massimo. Impostare la frequenza del dither a due chilohertz e l'ampiezza dell'oscillazione di lunghezza d'onda a 19 femtometri.

Dopo aver determinato empiricamente le impostazioni del PID, il sistema blocca automaticamente la lunghezza d'onda del laser alla lunghezza d'onda di risonanza del micro-oid. Acquisire i dati registrando l'uscita del controllore a retroazione. Di seguito sono riportati tracciati rappresentativi dello spostamento della risonanza in femtometri rispetto al tempo in secondi, ottenuti con un protocollo che utilizza tre diverse particelle di legame in ordine di dimensione.

Le particelle sono esosomi o nano vescicole. Perline di silice da cinque nanometri e molecole di interleuchina umana due. Si notino le diverse scale sia degli assi verticali che orizzontali in ciascun set di dati.

L'osservazione di scale diverse nei dati per dimensioni diverse delle particelle è un'indicazione che la tecnica è stata eseguita correttamente. Quando una particella si lega all'oid, la lunghezza d'onda di risonanza dell'OID aumenta, causando un salto verso l'alto nel tracciato. Quando una particella si stacca, la lunghezza d'onda di risonanza diminuisce, portando a un salto verso il basso.

L'altezza di ogni passo di lunghezza d'onda è determinata dalle dimensioni della particella e dalla sua posizione sull'oid microscopico. Le scale temporali sono determinate dalla dinamica dell'OID della particella. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutto il più pulito e privo di polvere possibile.