Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Abbiamo sviluppato un sistema di biorilevamento label-free basato sulla tecnologia del risonatore ottico noto come Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) che è in grado di rilevare singole molecole in soluzione. Qui vengono descritte e presentate le procedure alla base di questo lavoro.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare singole molecole e nanoparticelle ultra piccole senza l'uso di marcature, utilizzando una tecnica basata sulla tecnologia dei risonatori ottici e sul blocco di frequenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campi biochimici come il ripiegamento delle proteine e la cinetica di legame. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la molecola bersaglio non ha bisogno di essere marcata per rilevarla.

La configurazione per questa tecnica prevede l'accoppiamento di un chip micro OID a una fibra ottica. Innanzitutto, procurati un chip micro OID. Si tratta di un chip di silicio di circa 6,5 millimetri per 5,5 millimetri con un micro OID fabbricato su di esso.

Come in questa immagine, il micro OID ha un diametro maggiore da 80 a 100 micrometri e un diametro minore di due micrometri. Per ora, metti da parte il chip e prepara la fibra in modo da accoppiare il chip. Lavora con la fibra monomodale su una bobina e srotola circa un metro di fibra.

Prendi degli spelafili e all'incirca al centro della fibra di srotolamento. Usali per rimuovere un segmento di 2,5 centimetri del rivestimento polimerico dalla fibra. Questa regione spogliata è la regione di accoppiamento della fibra.

Dopo aver rimosso la fibra, utilizzare una salvietta priva di lanugine e alcol isopropanolo per pulire la regione spogliata. Quindi, utilizzare un supporto per fibre con morsetti magnetici per tenere in posizione la parte pulita. Per il passaggio successivo, disporre di motori passo-passo disposti per tirare la fibra in direzioni opposte.

Posizionare il supporto della fibra in modo da consentire il fissaggio dei motori passo-passo alla fibra su entrambi i lati della regione spellata. Inoltre, collegare un laser a un'estremità della fibra per fungere da fonte di luce. Avviare i motori passo-passo muovendosi in direzioni opposte per allungare la fibra e utilizzare una torcia a idrogeno per fondere la parte spelata della fibra.

Monitorare costantemente la luce diffusa lateralmente dalla fibra. Il lampeggio indica che la trasmissione della luce attraverso la fibra fluttua ed è necessario un maggiore assottigliamento. Quando il lampeggio cessa, smetti di riscaldare e tirare la fibra, che sarà stata sottile a circa 500 nanometri.

Dopo che la fibra è stata assottigliata, staccare la sorgente luminosa e rimuovere la fibra e il suo supporto a morsetto magnetico dai motori ostinati. Successivamente, spostare la fibra in un banco isolato pneumaticamente dotato del tavolino di posizionamento. Posizionare la fibra nel suo supporto a morsetto magnetico su un blocco di supporto davanti al chip campione.

Lo stadio di posizionamento è uno stadio di posizionamento nano a tre assi sopra un micrometro a tre assi. Oltre al tavolino di posizionamento nano, sono presenti colonne di imaging con vista dall'alto e laterale per facilitare l'allineamento. Continuare a lavorare con la fibra assicurandosi che la sua parte spelata sia vicina alla fase di posizionamento.

Prepararsi a introdurre l'estremità libera delle fibre nel sistema di misurazione. Dopo aver tagliato l'estremità libera, inserirla in un adattatore a fibra nuda. Utilizzare l'adattatore per collegare la fibra all'ingresso di un ricevitore fotografico con bilanciamento automatico collegato a un oscilloscopio.

Ora concentrati sull'altra estremità della fibra. Innanzitutto, collegare questa estremità a un accoppiatore ottico. Quindi accoppiare la fibra all'uscita di un polarizzatore in linea, che ha l'ingresso da un divisore di fascio 50 50 e un laser a diodi sintonizzabile ATT.

Ecco uno schema dei collegamenti fatti fino a questo punto. Si noti che la seconda uscita del divisore di fascio passa attraverso un polarizzatore in linea e viene utilizzata come riferimento per il ricevitore fotografico con bilanciamento automatico. Il passo successivo consiste nel prepararsi a montare il chip micro OID utilizzando un supporto per campioni in acciaio inossidabile.

Utilizzare del nastro biadesivo per fissare il chip al supporto del campione. Quindi posizionare il microchip sopra il supporto del campione. Ora monta il supporto del campione con il chip sopra lo stadio di posizionamento nano.

Qui il supporto e il chip sono in posizione sul tavolino di posizionamento con il micrometro a tre Xs. Posizionare grossolanamente, il chip del campione rispetto alla fibra. Ecco il chip e la fibra dopo che il posizionamento del corso è stato completato.

Quindi, regolare ulteriormente il posizionatore e utilizzare le colonne di imaging per allineare il chip parallelamente alla fibra ottica Con un micro OID con una lunghezza d'onda laser della fibra, questa immagine è di una fibra e microt. Dopo la fase di posizionamento fine, l'adesivo circolare vicino al centro del campo visivo è un aiuto per il posizionamento. Ora passa alla ricerca della lunghezza d'onda di risonanza del micro.

Genera un segnale di tensione della forma d'onda triangolare per regolare la lunghezza d'onda del laser a circa 635 nanometri più o meno 2,5 nanometri. Ora scansiona le lunghezze d'onda per cercare la risonanza. Osservare la trasmissione attraverso la fibra sull'oscilloscopio.

Si noti che alla lunghezza d'onda di risonanza, la trasmissione diminuisce. A questo punto lavorare per regolare la polarizzazione della luce laser. Regolare i controller di polarizzazione in linea per ottimizzare la polarizzazione della luce laser nella fibra ottica.

Visualizzare l'uscita del ricevitore fotografico con l'oscilloscopio e regolare la polarizzazione fino a quando il calo di trasmissione misurato non appare più stretto. Dopo aver ottimizzato la polarizzazione, costruire una camera del campione. Nella fase di campionamento.

La camera è costituita da un vetrino vetrino epossidico a un pezzo di microscopio. Diapositiva. La slitta funge da distanziatore consentendo al vetrino coprioggetto di sporgere dal truciolo e dalla fibra. Disporre una pompa a siringa da un millilitro e un tubo per introdurre i campioni dell'esperimento nella camera a un millilitro al minuto.

Quindi, ottenere un campione bilanciato a temperatura ambiente da un millilitro da caricare nella pompa. In questo caso, si tratta di una soluzione con perle di silice a cinque nanometri. Una volta caricato, osservare la camera del campione e iniettare il campione Fermandosi quando la camera è piena, l'iniezione del campione si è fermata in questa camera, che è riempita con una soluzione contenente perle di silice a cinque nanometri.

Dopo aver atteso 30 secondi per ridurre al minimo l'effetto della vibrazione, cercare la lunghezza d'onda di risonanza del micro. Anche in questo caso, osservare l'immersione e la trasmissione attraverso la fibra a risonanza utilizzando l'oscilloscopio. Questo è uno schema della configurazione sperimentale a questo punto, incluso il derivato integrale proporzionale o controller PID.

L'integratore e il dithering. Eseguire il controller in modalità di blocco automatico con il blocco della parte superiore del picco. Impostare la frequenza di dithering su due kilohertz e impostare l'ampiezza dell'oscillazione della lunghezza d'onda su 19 femtometri.

Dopo aver trovato empiricamente le impostazioni PID, blocca automaticamente la lunghezza d'onda del laser sulla lunghezza d'onda di risonanza del micro oide. Raccogli i dati registrando l'output del controller di feedback. Ecco tracce rappresentative dello spostamento della risonanza nei femtometri rispetto al tempo in secondi prodotto con un protocollo che utilizza tre diverse particelle leganti in ordine di dimensione.

Le particelle sono esosomi o nano vescicole. Perle di silice a cinque nanometri e interleuchina umana due molecole. Si notino le diverse scale degli eventi avversi verticali e orizzontali in ciascun set di dati.

L'osservazione di scale diverse nei dati per diverse dimensioni delle particelle è un'indicazione che la tecnica è stata eseguita correttamente. Quando una particella si lega all'oide, la lunghezza d'onda di risonanza dell'oide aumenta causando un aumento della traccia. Quando una particella si slega, la lunghezza d'onda di risonanza diminuisce portando a un passo indietro.

L'altezza di ogni passo di lunghezza d'onda è determinata dalla dimensione della particella e dalla sua posizione sul micro oide. Le scale temporali sono determinate dalla dinamica OID delle particelle Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutto il più pulito e privo di polvere possibile.