Name: Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri il rilevamento di singole molecole senza etichette utilizzando la tecnologia FLOWER con risonatori ottici a microtoroide. Questo metodo avanzato consente di studiare il ripiegamento proteico e la cinetica di legame in biochimica.

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Questa ricerca è stata supportata in parte da un National Research Service Award (T32GM07616) del National Institute of General Medical Sciences.

1. Setup sperimentale e preparazione del campione <ol><li> Realizzare microtoroids utilizzando la litografia, incisione, e di fusione procedura descritta in precedenza 6. Realizzare microtoroids sulla cima di un wafer di silicio (chip) che tipicamente hanno un diametro maggiore di 80-100 micron, e un diametro minore di 2 micron. </li><li> Rilassatevi circa un metro di fibra ottica monomodale (125 rivestimento micron, 4,3 micron modo diametri campo) dalla bobina di fibra. </li><li> Al centro della parte srotolato della fibra ottica, spogliare un piccolo segmento (2,5 cm) del rivestimento polimerico attorno alla fibra ottica utilizzando spellafili. Nota: Questa è la porzione della fibra ottica che verrà utilizzato per evanescently luce coppia nel microtoroid. </li><li> Pulire la fibra spogliato con alcool isopropanolo e un panno senza strofinare. </li><li> Mantenere questa parte della fibra in posizione utilizzando un supporto di fibra in ganci magnetici. </li><li> Sottile la fibra spogliato a ~ 500 nm da Melting e tirando con una torcia idrogeno e due motori passo-passo che si muovono in direzioni opposte a 60 micron / min. Posizionare la fibra ottica all&#39;interno della porzione superiore della fiamma, che dovrebbe essere ~ altezza 10 mm. Arrestare tirando la fibra quando la trasmissione attraverso la fibra ferma fluttuante, che può essere controllato visivamente (guardando la luce che è dispersa lateralmente dal lampeggio fibra on e off) o collegando la fibra ad un fotodiodo che è attaccato ad un oscilloscopio . </li><li> Cleave una estremità della fibra ottica e inserirla in un adattatore fibra nuda. Inserire questa estremità della fibra all&#39;ingresso del fotoricevitore. </li><li> Fibra coppia l&#39;altra estremità della bobina fibra laser utilizzando un accoppiatore a fibre ottiche. </li><li> La fiche microtoroid sopra un portacampioni (acciaio inox, 37,8 mm x 6.4 mm x 3.2 mm) utilizzando resina epossidica o nastro biadesivo. </li><li> Montare il porta-campione in cima ad una fase di posizionamento che si compone di un 3 assi nano-posizionamento (nanocube) fase (vedere inventario) sulla cima di un micrometro a 3 assi. Eseguire tutti gli esperimenti su un tavolo ottico pneumaticamente isolata per ridurre al minimo le vibrazioni. </li><li> Posizione grossolana il chip campione utilizzando un micrometro a 3 assi. </li><li> Allineare il-microtoroid contenente chip di parallelamente alla fibra ottica utilizzando nano-posizionatore. Nota: allineare il microtoroid entro una distanza di una lunghezza d&#39;onda della luce di ingresso (~ 633 nm). Per la visualizzazione di questo processo utilizzare due colonne di imaging (tubo con lente obiettivo e telecamera, vedere inventario) posizionato sulla parte superiore e sul lato del chip. </li><li> Ottimizzazione della polarizzazione della luce laser diretta attraverso la fibra ottica utilizzando un controllore di polarizzazione in linea (vedere inventario) con una manopola per regolare la polarizzazione. Nota: polarizzazione ottimale si ottiene quando il dip misurata nella trasmissione della fibra ottica appare più stretto. Osserva questo tuffo su un oscilloscopio (vedere il punto 2.2 per maggiori dettagli). </li><li> Costruireuna camera del campione da epoxying vetrino coprioggetti sulla fase del campione con un vetrino per microscopio come distanziatore. Nota: Una recinzione in plexiglass che copre l&#39;intera installazione può essere utile per ridurre al minimo le correnti d&#39;aria. Una piccola apertura dovrebbe essere lasciato per consentire la soluzione da pompare in utilizzando tubi. </li><li> Equilibrare termicamente particelle sospensioni o soluzioni acquose singola molecola per ≥ 1 ora in un bagno d&#39;acqua RT (~ 500 ml). Nota: I campioni vengono diluiti alla concentrazione desiderata in provette da microcentrifuga utilizzando i buffer associati specificati dal costruttore, ad esempio, PBS o HEPES. Se non vengono rilevati eventi di legame, aumentare la concentrazione di sale del buffer. </li><li> Particella Vortex contenenti soluzioni (1 ml) per breve tempo per ~ 2 sec. </li><li> Iniettare soluzioni contenenti particelle nella camera campione a 1 ml / min usando una pompa a siringa da 1 ml. </li><li> Dopo la camera del campione ha riempito, spegnere la pompa a siringa. </li><li> Attendere 30 secondi prima di registrare i dati per ridurre al minimogli effetti delle vibrazioni meccaniche derivanti dal flusso di fluido che può influenzare la misura. </li></ol> Blocco 2. Frequenza <ol><li> Re-coppia toroide alla fibra ottica spostando il supporto del campione con il nanopositioner, perché l&#39;accoppiamento sarà disturbata a causa di iniezione di liquido. </li><li> Individuare la lunghezza d&#39;onda di risonanza del microtoroid attraverso la scansione laser ingresso computer controllato attraverso una varietà di lunghezze d&#39;onda. Eseguire questo passaggio inviando un segnale di forma d&#39;onda di tensione triangolare un elemento piezoelettrico all&#39;interno del controller laser che regola la lunghezza d&#39;onda del laser. Effettuare esperimenti usando la luce visibile (635 nm ± 2,5 nm) in quanto vi è un basso assorbimento di luce in acqua a questa lunghezza d&#39;onda. </li><li> Misurare la trasmissione della luce attraverso la fibra ottica collegando l&#39;uscita della fibra ottica in un fotoricevitore auto-equilibrata. Inserire l&#39;uscita del fotoricevitore in un oscilloscopio utilizzando un cavo BNC. Osservare on l&#39;oscilloscopio che alla lunghezza d&#39;onda di risonanza del microtoroid, trasmissione attraverso la fibra ottica gocce. </li><li> Attaccare l&#39;uscita del fotoricevitore all&#39;ingresso principale della frequenza bloccaggio regolatore a reazione (vedere inventario) tramite un cavo. </li><li> Eseguire il controller di feed back di blocco in modalità di blocco automatico con picco top di chiusura con una frequenza di dithering di 2 kHz e un&#39;ampiezza di lunghezza d&#39;onda di oscillazione del 19 fm. Empiricamente configurare le impostazioni proporzionale integrale derivati ​​nella finestra del software utilizzando Ziegler-Nichols regole di tuning 14. Nota: questi valori devono solo essere impostata una volta all&#39;inizio di tutti gli esperimenti. </li><li> Auto-bloccare la lunghezza d&#39;onda del laser alla lunghezza d&#39;onda di risonanza del microtoroid. Eseguire questo passaggio dopo aver riempito la camera del campione. Nota: Se lo spostamento della lunghezza d&#39;onda è troppo grande, quindi il regolatore di feedback perderà di blocco e passare automaticamente alla modalità di scansione al fine di individuare la posizione di risonanza lunghezza d&#39;onda. Questo occurs per lunghezza d&#39;onda si sposta più grande di circa un linewidth (almeno 600 fm per tutti i sistemi esaminati qui). </li><li> Registrare l&#39;uscita del regolatore a reazione a 20 kHz utilizzando una scheda di acquisizione dati a 24 bit. Esportare i dati come file di testo tramite software di acquisizione dati. </li></ol> 3. Elaborazione Dati e analisi <ol><li> Fourier trasformare i dati in MATLAB. </li><li> Passa-basso i dati utilizzando un filtro &quot;muro di mattoni&quot; con un cutoff a 1 kHz per rimuovere la frequenza di dithering imposto di 2 kHz (vedi codice supplementare sul file Schermata 1). </li><li> Notch computazionalmente filtrare i dati utilizzando una dimensione della finestra di 16 Hz. Nota: Questo viene fatto per rimuovere fonti note di rumore, in questo caso, 60 Hz rumore elettronico linea e le sue armoniche, nonché 100 Hz (proveniente dal driver laser) e sue armoniche (vedi codice supplementare file Schermata 1). </li><li> Fourier inversa trasformare i dati di nuovo nel dominio del tempo. </li><li> Filtro mediano i dati utilizzando una finestradimensioni di 1.001 campioni (vedi Codice supplementare sul file Schermata 2). </li><li> Individuare cambio di passo nella lunghezza d&#39;onda di risonanza utilizzando l&#39;algoritmo passo ricerca di Kerssemakers et al. 15. </li><li> Genera istogrammi di ampiezza di ciascuna fase di legame. </li><li> Calcola dimensione delle particelle con Eq. (1) (vedi Discussione). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
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<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Come si lega una particella, la lunghezza d&#39;onda di risonanza (λ) del toroide aumenta. Se una particella non associa, la lunghezza d&#39;onda di risonanza diminuisce corrispondentemente (un evento step-down). Il diametro delle particelle (d) può essere determinata attraverso istogrammi di ampiezza di ogni passo di lunghezza d&#39;onda. L&#39;altezza di ogni gradino d&#39;onda varia a causa di variazioni dimensionali della particella legato e causa la posizione sulla microtoroid cui si lega la parti...

Esperimenti rilevamento molecole singole sono utili per ridurre la quantità di analita usato in biosensori, per la diagnosi precoce della malattia, e per esaminare le proprietà fondamentali delle molecole 3. Tali esperimenti sono tipicamente eseguite utilizzando etichette, tuttavia, le etichette non sono sempre possibile ottenere per una particolare proteina, aumenta il costo, può perturbare gli eventi oggetto di studio, e può essere scomodo, particolarmente per tempo reale in loco esperimenti o point-of- Diagnostica di cura. Il gold standard attuale per biosensing label-free è risonanza plasmonica di superficie 4, ma i sistemi commerciali di risonanza plasmonica di superficie in genere hanno un tipico limite inferiore di rilevamento dell&#39;ordine di nM. Recentemente, risonatori ottici sono emersi come una tecnologia promettente per libero etichetta singola molecola biorilevazione 5. Risonatori ottica lavoro basato sul lungo termine (ns) confinamento della luce 6,7. La luce è evanescentlyaccoppiato in questi dispositivi tipicamente attraverso una fibra ottica. Quando la lunghezza d&#39;onda della luce che attraversa la fibra corrisponde alla lunghezza d&#39;onda di risonanza del risonatore, illuminare efficientemente accoppia il risonatore. Questa luce accoppiata riflette totalmente internamente la cavità del risonatore a generare un campo evanescente in prossimità della circonferenza del risonatore. Come particelle entrano campo evanescente e si legano al risuonatore, la lunghezza d&#39;onda di risonanza dei cambiamenti risonatore in proporzione al volume della particella 8. In termini di capacità di rilevamento, risonatori di microsfere sono stati in precedenza utilizzata per rilevare l&#39;influenza A solo particelle virali (100 nm) 9,10. Recentemente, plasmonically avanzata microsfere risonatori ottici sono stati utilizzati per rilevare siero albumina bovina singola molecole 11 e oligonucleotidi 8-mer 12, tuttavia questo approccio limita l&#39;area di cattura delle particelle di 0,3 micron 2 per device. Più grandi biosensori zona di cattura sono ideali per massimizzare la probabilità di rilevamento delle particelle. Le attuali tecnologie basate su soluzioni label-free biosensori con grandi (&gt; 100 micron 2) aree di acquisizione si sono limitati a rilevare particelle di polistirene ≥ 25 nm. Abbiamo sviluppato un sistema di biosensori label-free basato sulla tecnologia risonatore ottico noto come frequenza di blocco ottico Whispering Evanescent risonatore (FIORE) 13 (Figura 1), che è in grado di rilevare in tempo risolto di singole molecole in soluzione. FIORE utilizza la lunga durata fotone di risonatori ottici microtoroid combinati con frequenza di blocco di controllo di retroazione, il rilevamento equilibrato, e il filtraggio di calcolo per rilevare piccole particelle fino a singole molecole proteiche. L&#39;uso di aggancio in frequenza consente al sistema di monitorare sempre la risonanza spostamento del microtoroid come particelle si legano, senza la necessità di spazzare o la scansione della lunghezza d&#39;onda del laser sopragrandi intervalli. I principi di FLOWER possono essere utilizzati per migliorare le capacità di rilevazione delle altre tecniche, tra cui la valorizzazione plasmonica. In ciò che segue, vengono descritte le procedure per l&#39;esecuzione FIORE.

<table><tbody><tr><td>Laser a diodi modulabili</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Controller laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Controller di feedback con blocco di frequenza</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Fotoricevitore autobilanciato</td><td>Newport</td><td>Modello 2007</td><td></td></tr><tr><td>Controller di polarizzazione in linea</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>Scheda di acquisizione dati a 24 bit</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina umana ricombinante-2</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>Perle di polistirene da 20 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo ottico</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo per colonna di imaging</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di imaging (tubo adattatore)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD ad alta risoluzione per colonna di imaging</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando microtoroid ottici risonatori

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Rilevamento piccole concentrazioni di molecole fino al limite singola molecola ha un impatto su settori quali la diagnosi precoce della malattia, e studi fondamentali sul comportamento delle molecole. Tecniche di rilevazione di singola molecola comunemente utilizzano etichette come etichette fluorescenti o punti quantici, tuttavia, le etichette non sono sempre disponibili, aumentare i costi e la complessità, e possono perturbare gli eventi in fase di studio. Risonatori ottici sono emersi come un mezzo promettente per rilevare singole molecole senza l&#39;uso di etichette. Attualmente la più piccola particella rilevata da un sistema di risuonatore non plasmonically potenziato nudo ottica in soluzione è a 25 nm di polistirolo sfera 1. Abbiamo sviluppato una tecnica nota come frequenza di blocco ottico Whispering Evanescent risonatore (fiore) in grado di superare questo limite e ottenere la diagnosi singola molecola label-free in soluzione acquosa 2. La potenza del segnale scale con il volume delle particelle, il nostro lavoro rappresenta un&gt; 100x improvement nel rapporto segnale-rumore (SNR) rispetto allo stato attuale della tecnica. Qui le procedure dietro fiore sono presentati in uno sforzo per aumentare il suo utilizzo nel settore.

Eventi di legame delle particelle sono chiaramente visto come variazioni a gradino in lunghezza d&#39;onda di risonanza del microtoroid nel tempo (Figura 2A). Le altezze di questi passaggi sono indicati come un istogramma della figura 2B. Figure 2-4 mostrano tracce rappresentative del legame di esosomi (nanovesicles), 5 nm perline di silice, e single umane interleuchina-2 molecole, rispettivamente. Il fatto che gli eventi a gradino scala con granulometr...

Abbiamo sviluppato un sistema di biorilevamento label-free basato sulla tecnologia del risonatore ottico noto come Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) che è in grado di rilevare singole molecole in soluzione. Qui vengono descritte e presentate le procedure alla base di questo lavoro.

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare singole molecole e nanoparticelle estremamente piccole senza l'uso di marcatori, mediante una tecnica basata sulla tecnologia dei risonatori ottici e sul bloccaggio di frequenza. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi biochimici, come la piegatura delle proteine e la cinetica di legame. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la molecola bersaglio non necessita di essere marcata per poter essere rilevata.La configurazione per questa tecnica prevede l'accoppiamento di un chip microscopico OID a una fibra ottica. Per prima cosa, procurarsi un chip microscopico OID. Si tratta di un chip di silicio di circa 6,5 millimetri per 5,5 millimetri con un micro OID realizzato al suo interno.Come mostrato in questa immagine, il micro OID presenta un diametro maggiore compreso tra 80 e 100 micrometri e un diametro minore di due micrometri. Per il momento, mettere da parte il chip e preparare la fibra per accoppiare il chip. Utilizzare una fibra monomodale su una bobina e svolgere circa un metro di fibra.Prendere un paio di spelafili e posizionarlo approssimativamente al centro della fibra srotolata.

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Bioingegneria

Biosensori interfacciarsi con ambienti complessi e biologici ed eseguire il rilevamento mirato alla combinazione di sensori altamente sensibili con sonde altamente specifici collegati al sensore tramite modifica della superficie. Qui, dimostriamo il funzionalizzazione superficiale di silice sensori ottici con biotina mediante agenti di accoppiamento silanici per colmare il sensore e l'ambiente biologico.

Collegamento sonde biologiche ai biosensori ottici che utilizza silice agenti di accoppiamento silanici

Si descrivono l'uso di una tecnica di anidride carbonica reflow laser per fabbricare cavità risonanti silice, incluse autoportante microsfere e on-chip microtoroids. Il metodo di reflow rimuove le imperfezioni della superficie, che consente lunghi tempi di vita dei fotoni all'interno di entrambi i dispositivi. I dispositivi ultra risultanti hanno fattori di alta qualità, consentendo applicazioni che vanno dalle telecomunicazioni alla rilevazione di agenti biologici.

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