High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit
20 settembre 2016
Viene descritto un test ad alto rendimento per lo screening enzimatico. Questo kit di saggi multiplexato e pronto all'uso comprende substrati prescelti diC hromogenic Polymer Hydrogel (CPH) e substrati di C insolubileC iomogenico Biomass (ICB). Gli enzimi bersaglio sono gli endoenzimi che degradano i polisaccaridi e le proteasi.
L'obiettivo generale di questo test cromogenico è quello di eseguire lo screening di vari enzimi in un formato ad alto rendimento rispetto a una selezione di diversi substrati cromogenici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di enzimi, come la ricerca di nuove attività enzimatiche per la degradazione della biomassa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i substrati cromogenici sono disponibili in quattro diversi colori, rendendo questa tecnica ad alta produttività, estremamente affidabile ed economica.
Per iniziare, attivare la piastra del kit del saggio con filtro a 96 pozzetti aggiungendo 200 microlitri di soluzione di attivazione a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti. Utilizzare una centrifuga e qualsiasi piastra standard a 96 pozzetti per la raccolta.
Per centrifugare la soluzione di attivazione esistente, aggiungere 100 microlitri di acqua sterile al polimero cromogenico idrogel o ai substrati CPH e applicare un vuoto o una centrifuga per rimuovere lo stabilizzante. Ripetere il lavaggio altre due volte. Per preparare la reazione enzimatica, aggiungere 150 microlitri di tampone acetato di sodio 100 mM, pH 4,5 e 5 microlitri di soluzione endocellulasica con tre diverse concentrazioni a ciascun pozzetto della piastra del kit di analisi.
Posizionare la piastra del prodotto sotto la piastra del kit di analisi per raccogliere eventuali perdite dalla piastra di reazione durante l'agitazione. Quindi incubare la piastra del kit di analisi a temperatura ambiente in un agitatore orizzontale a 100 giri/min per 30 minuti. Per ricevere dati affidabili è necessario agitare la miscela di reazione durante l'incubazione.
Posizionare la piastra del kit di analisi con la piastra del prodotto sottostante nella centrifuga e centrifugare a 2, 700 x g per 10 minuti. Trasferire il prodotto di reazione nei pozzetti della piastra del prodotto. Dopo la centrifuga, ispezionare visivamente la piastra del prodotto per verificare se il volume di liquido in ciascun pozzetto è approssimativamente lo stesso.
Utilizzando un lettore di piastre, leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 630 nm per i diversi substrati CPH verdi. Analizza e traccia i dati secondo il protocollo di testo. Per eseguire il test cromogenico con biomassa cromogenica rossa insolubile o paglia di grano ICB, iniziare aggiungendo 200 microlitri di soluzione di attivazione in ciascun pozzetto della piastra di analisi.
Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti. Rimuovere lo stabilizzatore utilizzando 100 microlitri di acqua sterile per lavare i pozzetti tre volte. Quindi, aggiungere 150 microlitri di tampone acetato di sodio 100 mM pH 4,5 e 5 microlitri da 10 unità per millilitro di diversa soluzione di endo-xilanasi.
Posizionare la piastra del prodotto sotto la piastra del substrato per raccogliere eventuali perdite dalla piastra del substrato durante l'agitazione. Incubare la reazione a temperatura ambiente a 100 giri/min per due ore. Dopo l'incubazione, posizionare la piastra del kit di saggio con la piastra del prodotto sottostante nella centrifuga e ruotare a 2, 700 x g per 10 minuti per trasferire il prodotto di reazione nei pozzetti della piastra del prodotto.
Verificare che il volume di liquido in ogni pozzetto sia approssimativamente lo stesso. Quindi, utilizzando un lettore di piastre, leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 517 nm per la paglia di grano rosso ICB. Eseguire l'analisi dei dati secondo il protocollo di testo.
Di seguito è mostrato un esempio di una risposta alla dose di CPH-arabinoxilano alla xilanasi a diverse concentrazioni dell'enzima in cui la diminuzione della concentrazione dell'enzima può essere osservata visivamente. Una quantificazione spettrofotometrica più dettagliata viene utilizzata per tracciare l'assorbanza rispetto alla concentrazione dell'enzima. Con il segnale l'intensità corrisponde all'attività enzimatica.
In questo esempio del test utilizzato per lo screening enzimatico, un'endocellulasi è stata testata a tre concentrazioni contro diversi substrati di CPH. Come si vede qui, l'attività aggiuntiva alla cellulasi è stata mostrata per CPH-glucano, CPH-xilano, CPH-xiloglucano e una bassa attività è stata osservata contro CPH-galattomannano. Gli stessi substrati di CPH sono stati digeriti con enzimi disponibili in commercio utilizzati come controlli positivi nelle stesse condizioni.
I risultati qui mostrano che tutti i substrati sono stati degradati a livelli che aumentavano con l'aumentare delle concentrazioni enzimatiche. In questo esperimento, cinque substrati ICB sono stati inclusi con 19 substrati CPH per analizzare gli enzimi secreti di Phanerochaete chrysosporium in tre diverse condizioni di pH. Gli enzimi P.chrysosporium hanno degradato vari glucani, amidi e xilani.
Segnali più bassi potrebbero essere rilevati per le emicellulose arabinan e galattano pectico, così come per l'RGI. Gli enzimi prodotti erano più attivi in condizioni acide che in condizioni neutre o leggermente basiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora, se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di mescolare la reazione durante l'incubazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dello screening ad alto rendimento per esplorare nuove attività enzimatiche per la biotecnologia. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il kit di screening.
Panoramica
Questo articolo descrive un saggio cromogeno ad alto rendimento per il screening enzimatico mediante l'uso di substrati multiplex. Il kit del saggio comprende substrati di Idrogel Polimerico Cromogenico (CPH) e Biomassa Cromogenica Insolubile (ICB) per la valutazione di endoenzimi degradanti polisaccaridi e proteasi.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Screening enzimatico
- Biotecnologia
- Saggi ad alto rendimento
Sfondo
- La scoperta di enzimi è fondamentale per diverse applicazioni, inclusa la degradazione della biomassa.
- I substrati cromogeni permettono il monitoraggio visivo dell'attività enzimatica.
- Il saggio è progettato per essere affidabile ed economico.
- Diversi substrati forniscono una gamma di colori per un'analisi migliorata.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per lo screening di enzimi su diversi substrati.
- Identificare nuove attività enzimatiche per la degradazione della biomassa.
- Facilitare lo screening ad alto rendimento nella ricerca enzimatica.
Metodi Utilizzati
- Attivazione di una piastra per kit saggio con soluzione di attivazione a 96 pozzetti.
- Incubazione delle reazioni enzimatiche in condizioni controllate.
- Utilizzo di una centrifuga per la raccolta del prodotto.
- Misurazione dell'assorbanza a lunghezze d'onda specifiche per l'analisi dei dati.
Risultati principali
- Sono state osservate attività enzimatiche per vari substrati CPH e ICB.
- Concentrazioni più elevate di enzima hanno portato a un aumento della degradazione del substrato.
- Diversi substrati hanno mostrato livelli diversi di attività enzimatica.
- Condizioni acide hanno potenziato l'attività enzimatica rispetto a condizioni neutre o basiche.
Conclusioni
- Questo saggio fornisce una piattaforma solida per il screening enzimatico.
- Permette ai ricercatori di esplorare in modo efficiente nuove attività enzimatiche.
- La padronanza della tecnica consente un'esecuzione rapida in meno di un'ora.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il sequenziamento ad alta capacità degli enzimi incontra collo di bottiglia legati alla disponibilità dei substrati e alla scalabilità dei saggi, limitando la caratterizzazione funzionale rapida di enzimi attivi sui carboidrati (CAZimi), fondamentali per applicazioni industriali nei settori dei biocarburanti, tessile e alimentare. Questo saggio cromogenico colma il divario tecnologico consentendo test multiplex di substrati codificati per colore in un formato a 96 pozzetti, migliorando l'affidabilità predittiva nella fase iniziale della scoperta enzimatica e supportando decisioni di avanzamento o interruzione nei processi di ingegnerizzazione enzimatica. Il metodo potenzia la continuità traslazionale dall'identificazione del bersaglio alla validazione di tipo preclinico fornendo letture quantitative e riproducibili dell'attività su diversi substrati polisaccaridici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'interrogazione funzionale di CAZyme putative collegando candidati genetici all'attività biochimica su substrati polisaccaridici definiti.
- Valore operativo: Supporta un rapido test delle ipotesi mediante substrati CPH color-multiplexati, aumentando la produttività del screening senza compromettere l'affidabilità dei dati.
- Valore predittivo: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico quantificando l'attività enzimatica dipendente dalla dose, aiutando nella priorizzazione degli obiettivi per lo sviluppo di enzimi industriali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce substrati cromogenici insolubili standardizzati (CPH e ICB) che imitano la biomassa complessa, consentendo valutazioni dell'attività fisiologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio attraverso passaggi standardizzati di attivazione, lavaggio e centrifugazione, riducendo la variabilità nei flussi di lavoro ad alto rendimento.
- Valore di scalabilità: Compatibile con lettori di piastre standard da 96 pozzetti e sistemi di gestione dei liquidi, permettendo l'integrazione in piattaforme di screening esistenti per la valutazione di cocktail enzimatici o di colture.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi pertinenti alle malattie mediante la valutazione dell'attività enzimatica in condizioni di pH variabile, riflettendo gli ambienti dei processi industriali.
- Valore operativo: Permette decisioni di avanzamento con valutazione del rischio correlando la concentrazione enzimatica al degrado del substrato attraverso diversi tipi di biomassa (ad esempio, paglia di grano, glucani, xilani).
- Valore predittivo: Migliora l'allineamento traslazionale dei biomarcatori identificando i profili di attività dipendenti dal pH, fondamentali per la stabilità formulativa nelle applicazioni detergenti o nei biocarburanti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel continuum dalla scoperta iniziale all'identificazione del capostazione, supportando la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi metabolici e la riduzione dei rischi biologici per gli enzimi degradanti i carboidrati prima di investire nell'ingegnerizzazione proteica o nel scale-up della fermentazione.
- Biologia della scoperta: Permette la chiarificazione dei percorsi metabolici mediante lo screening dell'attività enzimatica su specifici substrati polisaccaridici (ad esempio, CPH-glucano, CPH-xilano) per dedurre la specificità del substrato e il ruolo funzionale.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e risultati quantitativi tramite misurazioni di assorbanza a 630 nm (CPH) e 517 nm (ICB), consentendo confronti affidabili tra varianti enzimatiche o condizioni diverse.
- Analisi: Fornisce dati di risposta dose-dipendente che supportano l'analisi statistica e la selezione dei risultati positivi, aiutando i gruppi a classificare i candidati enzimatici in base all'attività e alla specificità.
- Ricerca traslazionale: Collega la scoperta alla continuità preclinica valutando le prestazioni enzimatiche in condizioni industrialmente rilevanti (ad esempio, pH acido, substrati complessi di biomassa).
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per lo screening di librerie enzimatiche, colture o miscele in diversi progetti nell'ambito delle industrie basate sulla bioeconomia.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo i falsi positivi mediante la misurazione diretta dell'attività su substrati insolubili e simili allo stato nativo.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie a volumi definiti di reagenti, tempi di incubazione e parametri di centrifugazione, minimizzando la variabilità dipendente dall'operatore.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo lo screening rapido di centinaia di candidati enzimatici, riducendo il tempo e i costi associati a saggi biochimici a bassa produttività.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio generando dati quantitativi sull'attività enzimatica che informano le decisioni di avanzamento o interruzione nelle campagne di ingegneria enzimatica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella cinetica enzimatica e nell'ottimizzazione di saggi cromogenici per garantire una preparazione accurata del substrato e un monitoraggio preciso della reazione.
- Presuppone l'accesso a un lettore di piastre in grado di effettuare misure di assorbanza a 630 nm e 517 nm, e a una centrifuga compatibile con piastre a 96 pozzetti per il trasferimento del prodotto.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle condizioni di tampone (ad esempio, acetato di sodio pH 4,5) e ai parametri di incubazione (ad esempio, agitazione a 100 rpm) per assicurare la riproducibilità tra diversi siti.
- Comporta considerazioni di adattamento nel testare substrati non polisaccaridici, poiché il saggio è ottimizzato per enzimi attivi sui carboidrati e potrebbe richiedere modifiche al tampone o al substrato per altre classi di enzimi.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'esigenza di evitare agitazione durante i passaggi di attivazione e stabilizzazione, e la necessità di verificare visivamente un volume uniforme del prodotto dopo la centrifugazione per un'interpretazione affidabile dei dati.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
