High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

L'obiettivo generale di questo test cromogenico è quello di eseguire lo screening di vari enzimi in un formato ad alto rendimento rispetto a una selezione di diversi substrati cromogenici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di enzimi, come la ricerca di nuove attività enzimatiche per la degradazione della biomassa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i substrati cromogenici sono disponibili in quattro diversi colori, rendendo questa tecnica ad alta produttività, estremamente affidabile ed economica.

Per iniziare, attivare la piastra del kit del saggio con filtro a 96 pozzetti aggiungendo 200 microlitri di soluzione di attivazione a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti. Utilizzare una centrifuga e qualsiasi piastra standard a 96 pozzetti per la raccolta.

Per centrifugare la soluzione di attivazione esistente, aggiungere 100 microlitri di acqua sterile al polimero cromogenico idrogel o ai substrati CPH e applicare un vuoto o una centrifuga per rimuovere lo stabilizzante. Ripetere il lavaggio altre due volte. Per preparare la reazione enzimatica, aggiungere 150 microlitri di tampone acetato di sodio 100 mM, pH 4,5 e 5 microlitri di soluzione endocellulasica con tre diverse concentrazioni a ciascun pozzetto della piastra del kit di analisi.

Posizionare la piastra del prodotto sotto la piastra del kit di analisi per raccogliere eventuali perdite dalla piastra di reazione durante l'agitazione. Quindi incubare la piastra del kit di analisi a temperatura ambiente in un agitatore orizzontale a 100 giri/min per 30 minuti. Per ricevere dati affidabili è necessario agitare la miscela di reazione durante l'incubazione.

Posizionare la piastra del kit di analisi con la piastra del prodotto sottostante nella centrifuga e centrifugare a 2, 700 x g per 10 minuti. Trasferire il prodotto di reazione nei pozzetti della piastra del prodotto. Dopo la centrifuga, ispezionare visivamente la piastra del prodotto per verificare se il volume di liquido in ciascun pozzetto è approssimativamente lo stesso.

Utilizzando un lettore di piastre, leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 630 nm per i diversi substrati CPH verdi. Analizza e traccia i dati secondo il protocollo di testo. Per eseguire il test cromogenico con biomassa cromogenica rossa insolubile o paglia di grano ICB, iniziare aggiungendo 200 microlitri di soluzione di attivazione in ciascun pozzetto della piastra di analisi.

Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente senza agitare per 10 minuti. Rimuovere lo stabilizzatore utilizzando 100 microlitri di acqua sterile per lavare i pozzetti tre volte. Quindi, aggiungere 150 microlitri di tampone acetato di sodio 100 mM pH 4,5 e 5 microlitri da 10 unità per millilitro di diversa soluzione di endo-xilanasi.

Posizionare la piastra del prodotto sotto la piastra del substrato per raccogliere eventuali perdite dalla piastra del substrato durante l'agitazione. Incubare la reazione a temperatura ambiente a 100 giri/min per due ore. Dopo l'incubazione, posizionare la piastra del kit di saggio con la piastra del prodotto sottostante nella centrifuga e ruotare a 2, 700 x g per 10 minuti per trasferire il prodotto di reazione nei pozzetti della piastra del prodotto.

Verificare che il volume di liquido in ogni pozzetto sia approssimativamente lo stesso. Quindi, utilizzando un lettore di piastre, leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 517 nm per la paglia di grano rosso ICB. Eseguire l'analisi dei dati secondo il protocollo di testo.

Di seguito è mostrato un esempio di una risposta alla dose di CPH-arabinoxilano alla xilanasi a diverse concentrazioni dell'enzima in cui la diminuzione della concentrazione dell'enzima può essere osservata visivamente. Una quantificazione spettrofotometrica più dettagliata viene utilizzata per tracciare l'assorbanza rispetto alla concentrazione dell'enzima. Con il segnale l'intensità corrisponde all'attività enzimatica.

In questo esempio del test utilizzato per lo screening enzimatico, un'endocellulasi è stata testata a tre concentrazioni contro diversi substrati di CPH. Come si vede qui, l'attività aggiuntiva alla cellulasi è stata mostrata per CPH-glucano, CPH-xilano, CPH-xiloglucano e una bassa attività è stata osservata contro CPH-galattomannano. Gli stessi substrati di CPH sono stati digeriti con enzimi disponibili in commercio utilizzati come controlli positivi nelle stesse condizioni.

I risultati qui mostrano che tutti i substrati sono stati degradati a livelli che aumentavano con l'aumentare delle concentrazioni enzimatiche. In questo esperimento, cinque substrati ICB sono stati inclusi con 19 substrati CPH per analizzare gli enzimi secreti di Phanerochaete chrysosporium in tre diverse condizioni di pH. Gli enzimi P.chrysosporium hanno degradato vari glucani, amidi e xilani.

Segnali più bassi potrebbero essere rilevati per le emicellulose arabinan e galattano pectico, così come per l'RGI. Gli enzimi prodotti erano più attivi in condizioni acide che in condizioni neutre o leggermente basiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordarsi di mescolare la reazione durante l'incubazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dello screening ad alto rendimento per esplorare nuove attività enzimatiche per la biotecnologia. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il kit di screening.