Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una frazione non nucleare arricchita con compartimenti di replicazione formati in cellule infettate da adenovirus per lo studio dettagliato della loro composizione, ultrastruttura e attività associate. Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo della virologia del DNA, come uno studio dei meccanismi molecolari che controllano la replicazione e l'espressione del genoma virale che a loro volta dipendono dai compartimenti di replicazione per la regolazione delle interazioni tra cellule ospiti del virus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di una procedura semplice basata sul gradiente di velocità per stabilire un sistema privo di cellule che è suscettibile di studiare i meccanismi che consentono ai virus a DNA replicanti nucleare di prendere il controllo della cellula infetta.

Per eseguire questo test, in primo luogo, preparare l'adenovirus di tipo cinque o D cinque e i fibroblasti del prepuzio umano o HFF come descritto nel protocollo di testo allegato per iniziare a infettare da 10 al settimo HFF in piastre di coltura tissutale da 100 millimetri utilizzando un millilitro di 85 e DMM per piastra a un MOI di 30 unità formanti fuoco o FFU per cellula incubare le cellule per due ore in un incubatore di coltura cellulare umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Agitare con cura le stoviglie ogni 15 minuti per garantire una distribuzione omogenea dell'inoculo virale sulle cellule. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno e aggiungere il dmem fresco.

Integrato con il 10% di FBS, incubare le cellule per 16, 24 o 36 ore utilizzando un raschietto cellulare. Raccogliere delicatamente le cellule infette e di controllo dopo l'infezione e raccogliere la sospensione cellulare in provette da centrifuga sterili su ghiaccio. Contare le cellule utilizzando una camera neubauer e quindi centrifugare le cellule a 220 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di centrifuga PBS ghiacciata e lavare le cellule tre volte in cinque millilitri di PBS ghiacciato scartando i surnatanti di lavaggio per pidocchiare le cellule. Sospendere il pellet cellulare in 700 microlitri di tampone ipotonico ghiacciato con inibitori della proteasi e lasciare che le cellule si gonfino sul ghiaccio per tre ore. Usando un pestello in teflon di tipo A, omogeneizzare le cellule con 10-20 colpi verso il basso.

Controllare periodicamente il lisato al microscopio ogni 20 colpi per monitorare la lisi cellulare. Ripetere il processo per circa 80 colpi fino a quando tutte le cellule non si sono rotte con successo. Quindi centrifugare l'omogeneizzato a 300 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Conservare il surnatante a meno 20 gradi Celsius in una provetta come frazione citoplasmatica per rimuovere i detriti cellulari dai nuclei reus. Sospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione di saccarosio 0,25 molare, una pipetta, 750 microlitri di soluzione di saccarosio 0,35 molare, due in una provetta da centrifuga e sovrapporre accuratamente l'omogenato risospeso sulla soluzione due. Centrifugare il cuscino di saccarosio a 1400 volte G a quattro gradi Celsius per cinque minuti, quindi scartare il surnatante.

Risospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione due ai pidocchi. I nuclei sonicano la sospensione nucleare in un bagno ultrasonico, mantenuto a una temperatura pari o inferiore a quattro gradi Celsius in due impulsi di cinque minuti. Controllare la lisi nucleare al microscopio a campo chiaro tra gli impulsi e sonicare ulteriormente fino a quando i nuclei non sono completamente sdraiati.

Successivamente, pipettare: 750 microlitri di saccarosio molare 0,88 Soluzione tre in una provetta da centrifuga, sovrapporre la soluzione di lisato nucleare sulla soluzione tre. Centrifugare il lisato a 3000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. La S di 1,5 millilitri è la frazione nucleoplasmatica, che viene immagazzinata a meno 70 gradi Celsius.

Quindi risospendere il pellet in 700 microlitri di soluzione due. Questa è la frazione del compartimento di replicazione 85 o RCF del nucleo ospite, che viene anch'essa immagazzinata a meno 70 gradi Celsius. Per iniziare l'analisi in immunofluorescenza, aggiungere una goccia da cinque microlitri di RCF a un vetrino rivestito di soluzione salina.

Lasciare asciugare la goccia all'aria a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 500 microlitri di PBS in una goccia accanto allo spot e inclinare il vetrino per far scorrere il PBS sullo spot. Svuotare il PBS dal vetrino.

Successivamente, bloccare il punto del campione con 500 microlitri di PBS contenente il 5% di albumina sierica bovina per due ore a temperatura ambiente. Per rimuovere la soluzione bloccante in eccesso, aggiungere delicatamente 500 microlitri di PBS al campione individuato sul vetrino senza pipettare direttamente sul campione. Eseguire il lavaggio tre volte.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di anticorpo primario diluito contro la proteina legante il DNA virale E due A sul punto del campione. Coprire il vetrino per evitare l'evaporazione e incubare in una camera umidificata a temperatura ambiente per due ore. Ora, lavare delicatamente il campione tre volte con PBS contenente lo 0,02% di interpolazione 20.

Evitare di pipettare direttamente sul campione dopo questi lavaggi. Aggiungere 20 microlitri di anticorpo secondario di topo accoppiato a fluoro quattro direttamente sul campione, incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. In una camera umidificata, aggiungere 500 microlitri di PBS con lo 0,02% di Tween 20 ai vetrini, anche in questo caso, evitando di pipettare direttamente sul campione.

Quindi aggiungere due microlitri di soluzione di montaggio e capovolgere un vetrino coprioggetti sul campione. Sigillare i lati dei vetrini coprioggetto con lo smalto. Visualizza il vetrino al microscopio a fluorescenza con un obiettivo 63 x alla lunghezza d'onda desiderata specifica per il fluoro quattro utilizzato, qui è mostrato un risultato dell'immunofluorescenza della proteina legante il DNA adenovirale E due A o DBP.

Le strutture che contengono il DBP sono rc virali subnucleari, si noti che il DBP E due A è localizzato all'interno del RC e appare in verde. Inoltre, l'arricchimento del DNA virale nell'RCF è stato confermato dalla PCR confrontando l'RCF e la frazione nucleoplasmatica o NPL a 24 e 36 ore dopo l'infezione. Il GNA virale è stato trovato selettivamente nell'RCF e non nel consulto NPL.

Il testo di accompagnamento per ulteriori prove di MNA adenovirale nell'RCF Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei dal momento in cui le cellule infette vengono raccolte all'isolamento di RCF se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere sempre i campioni sul ghiaccio e di monitorare le fasi di omogeneizzazione del nucleo, isolamento, sonicazione e isolamento della frazione subnucleare mediante microscopia a campo chiaro. Seguendo questa procedura.

Altri metodi come la R-T-P-C-R e la microscopia elettronica a trasmissione possono essere eseguiti per studiare la regolazione dell'espressione genica virale associata ai compartimenti di replicazione virale e l'ultra struttura di queste particelle. Questa tecnica ha il potenziale per aprire la strada ai ricercatori nel campo della virologia tumorale del DNA per esplorare i meccanismi molecolari che alterano la regolazione del ciclo cellulare e promuovono la replicazione virale nelle cellule umane. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i compartimenti di replicazione virale dai nuclei cellulari infetti per eseguire studi morfologici, funzionali e composizionali di queste strutture indotte dal virus.

Non dimenticare che lavorare con un indicatore SAN può essere pericoloso e che le percussioni, come indossare la bocca dell'orecchio, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.