Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una frazione non nucleare arricchita di compartimenti di replicazione formati in cellule infettate da adenovirus, per lo studio dettagliato della loro composizione, struttura ultrastrutturale e attività associate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia del DNA, come lo studio dei meccanismi molecolari che controllano la replicazione e l'espressione del genoma virale, i quali a loro volta dipendono dai compartimenti di replicazione per la regolazione delle interazioni tra virus e cellula ospite. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di una procedura semplice, basata su un gradiente di velocità, per ottenere un sistema acellulare adatto allo studio dei meccanismi che consentono ai virus a DNA replicanti nel nucleo di prendere il controllo della cellula infettata.

Per eseguire questo saggio, preparare innanzitutto l'adenovirus di tipo cinque o D cinque e i fibroblasti di prepuzio umano o HFF come descritto nel protocollo testuale allegato, quindi iniziare a infettare 10 alla settima potenza di HFF in piastre da coltura tessutale da 100 millimetri utilizzando un millilitro di 85 e DMM per piastra a un MOI di 30 unità formanti placche o FFU per cellula. Incubare le cellule per due ore in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, agitando delicatamente le piastre ogni 15 minuti per garantire una distribuzione omogenea dell'inoculo virale sulle cellule. Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo e aggiungere dmem fresco.

Integrato con FBS al 10%, quindi incubare le cellule per 16, 24 o 36 ore utilizzando un raschietto per cellule. Raccogliere delicatamente le cellule infette e quelle di controllo dopo l'infezione e raccogliere la sospensione cellulare in provette sterili per centrifuga su ghiaccio. Contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer e quindi centrifugare le cellule a 220 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio, centrifugare e lavare le cellule tre volte in cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio, scartando i soprannatanti di lavaggio per lisare le cellule. Risospendere il pellet cellulare in 700 microlitri di tampone ipotonico freddo di ghiaccio contenente inibitori della proteasi e lasciare gonfiare le cellule sul ghiaccio per tre ore. Omogeneizzare le cellule utilizzando un pestello in teflon di tipo A con 10-20 movimenti verso il basso.

Controllare periodicamente il lisato al microscopio ogni 20 passaggi per monitorare la lisi cellulare. Ripetere il processo per circa 80 passaggi fino a quando tutte le cellule non sono state completamente rotte. Successivamente, centrifugare l'omogenato a 300 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Conservare il soprannatante a meno 20 gradi Celsius in un tubo come frazione citoplasmatica per rimuovere i detriti cellulari dai nuclei. Sospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione di saccarosio 0,25 molare uno, pipettare 750 microlitri di soluzione di saccarosio 0,35 molare due in un tubo da centrifuga e stratificare con attenzione l'omogenato risospeso sopra la soluzione due. Centrifugare il cuscino di saccarosio a 1400 ×g a 4 gradi Celsius per cinque minuti, quindi scartare il soprannatante.

Risospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione due per lisare. Sonicare la sospensione nucleare in un bagno ad ultrasuoni, mantenuto a o al di sotto di quattro gradi Celsius, con due impulsi di cinque minuti ciascuno. Verificare la lisi nucleare al microscopio in campo chiaro tra un impulso e l'altro e continuare la sonica finché i nuclei non sono completamente lisiati.

Successivamente, pipettare 750 microlitri di soluzione tre di saccarosio 0,88 molare in un tubo da centrifuga; stratificare la soluzione del lisato nucleare sopra la soluzione tre. Centrifugare il lisato a 3000 × g a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Il soprannatante di 1,5 millilitri ottenuto è la frazione nucleoplasmatica, che viene conservata a meno 70 gradi Celsius.

Quindi risospendere il pellet in 700 microlitri della soluzione due. Questa è la frazione del compartimento di replicazione 85 o RCF del nucleo dell'ospite, che viene anche conservata a meno 70 gradi Celsius. Per iniziare l'analisi di immunofluorescenza, aggiungere una goccia di cinque microlitri della RCF su un vetrino rivestito con soluzione salina.

Lasciare asciugare la goccia all'aria a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 500 microlitri di PBS sotto forma di goccia accanto al punto e inclinare il vetrino in modo da far scorrere il PBS sul punto. Rimuovere il PBS dal vetrino.

Successivamente, bloccare il punto campione con 500 microlitri di PBS contenente l'albumina sierica bovina al 5% per due ore a temperatura ambiente. Per rimuovere l'eccesso di soluzione di blocco, aggiungere delicatamente 500 microlitri di PBS al campione depositato sul vetrino senza pipettare direttamente sul campione. Eseguire il lavaggio tre volte.

Successivamente, aggiungere 20 microlitri di anticorpo primario diluito contro la proteina virale E2A legante il DNA sul campione. Coprire il vetrino per evitare l'evaporazione e incubare in una camera umidificata a temperatura ambiente per due ore. A questo punto, lavare delicatamente il campione tre volte con PBS contenente 0,02% di Tween 20.

Evitare di pipettare direttamente sul campione dopo questi lavaggi. Aggiungere 20 microlitri di anticorpo secondario murino coniugato con fluoro quattro direttamente sul campione, incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. In una camera umidificata, aggiungere 500 microlitri di PBS con 0,02% di Tween 20 ai vetrini, evitando nuovamente di pipettare direttamente sul campione.

Quindi aggiungere due microlitri di soluzione di montaggio e capovolgere un coprioggetto sul campione. Sigillare i bordi dei coprioggetti con smalto per unghie. Osservare il vetrino al microscopio a fluorescenza con un obiettivo 63x alla lunghezza d'onda desiderata specifica per il fluorocromo utilizzato. Un risultato dell'immunofluorescenza della proteina legante il DNA E2A del adenovirus o DBP è mostrato qui.

Le strutture contenenti DBP sono repliche virali subnucleari; si noti che la DBP E due A è localizzata all'interno della RC e appare in verde. Inoltre, l'arricchimento del DNA virale nella frazione RC è stato confermato mediante PCR, confrontando la frazione RC con la frazione nucleoplasmatica (NPL) a 24 e 36 ore dall'infezione. Il DNA virale è stato trovato selettivamente nella frazione RC e non nella frazione NPL.

Il testo allegato fornisce ulteriori prove della presenza di MNA adenovirale nel RCF. Una volta padroneggiata questa tecnica, è possibile completarla in sei ore, a partire dal momento del raccolto delle cellule infette fino all'isolamento del RCF, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di mantenere sempre i campioni sul ghiaccio e di monitorare al microscopio in campo chiaro i passaggi di omogeneizzazione, isolamento, sonificazione e isolamento delle frazioni subnucleari. Seguire questa procedura.

Altri metodi come la R-T-P-C-R e la microscopia elettronica a trasmissione possono essere eseguiti per studiare la regolazione dell'espressione genica virale associata ai compartimenti di replicazione virale e l'ultrastruttura di queste particelle. Questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo della virologia dei tumori a DNA per esplorare i meccanismi molecolari che alterano la regolazione del ciclo cellulare e promuovono la replicazione virale nelle cellule umane. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i compartimenti di replicazione virale dai nuclei delle cellule infette per effettuare studi morfologici, funzionali e composizionali di queste strutture indotte dal virus.

Non dimenticare che lavorare con un indicatore SAN può essere pericoloso e precauzioni, come indossare protezioni per le orecchie, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.