Name: Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Impara a isolare compartimenti di replicazione virale da cellule umane infettate da adenovirus. Questo metodo basato su gradiente di velocità permette di studiare i meccanismi molecolari della replicazione del genoma virale e le interazioni ospite-patogeno.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni da CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) e Promep-SEP per R.A.G.; P.H. ha ricevuto una borsa di studio da CONACyT (447442).

1. HFF coltura cellulare e Ad-infezione <ol><li> Propagare virus Ad5 WT in monostrati di cellule HEK-293 e titolo come fluorescenti unità formanti (FFU) sulle cellule HFF come descritto in precedenza 8. </li><li> Crescere fibroblasti Foreskin umana (HFF) in 10 ml di DMEM / 10% siero fetale bovino (FBS) in sterile cultura 100 mm piatti a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Determinare il numero di cellulare utilizzando una camera Neubauer contando cellule nei quattro set di 16 quadrati. Il numero di cellule per ml si ottiene calcolando il numero medio di cellule nei quattro set di 16 quadri e moltiplicando questo numero per 10 4. Per ogni volta dopo l&#39;infezione inclusa nella fase 1.3, utilizzare 1 x 10 7 cellule HFF. </li><li> Mock-infettare o infettare le cellule HFF con il tipo di adenovirus 5 (AD5) wild-type (WT) (H5pg4100 8) a 100 mm piastre di coltura dei tessuti utilizzando 1 ml di Ad5 in DMEM al piatto con un MOI di 30 focus Forming Unit, o FFU , per cella. Incubare per 2 ore a ahumidified coltura cellulare incubatore a 37 ° C e 5% CO 2, dondolo accuratamente i piatti ogni 15 minuti per assicurare una distribuzione omogenea del virus inoculo sulle celle. Trascorso questo tempo, rimuovere il supporto e aggiungere DMEM fresco supplementato con 10% FBS e incubare per 16, 24 o 36 ore in un incubatore umidificato coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2. Passare al punto 2.1. </li></ol> 2. Preparazione di frazioni sub-nucleare arricchito con Adenovirus RC <ol><li> Raccolto Ad5-infetti o cellule HFF mock-infettati con scrapper cellule e raccogliere le cellule in provette sterili. Determinare il numero di cellulare come al punto 1.2. Utilizzare 1 x 10 7 cellule per ogni tempo di post-infezione specificato al punto 1.3. </li><li> Centrifugare le cellule a 220 xg, 4 ° C per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in PBS freddo (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 e 1,8 mm KH 2 PO 4). Pellet Washs 3 volte utilizzando 5 ml di PBS ghiacciato a lavaggio. A tal fine, centrifugare le cellule a 220 xg, 4 ° C per 5 minuti, decantare e scartare il surnatante (SN), e risospendere il pellet cellulare delicatamente pipettando. </li><li> Per interrompere la membrana plasmatica, risospendere il pellet cellulare in 700 μ l di tampone ipotonico ghiacciata (10 mM HEPES pH 7.9, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mm 2, DTT 0,5 mM, 20 μ g / ml phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) , una miscela di cisteina, serina, treonina e inibitori della proteasi aspartil compresi 10 μ g / ml inibitore della tripsina pancreatica bovina, 10 μ g / ml pepstatina A e 10 μ g / ml N-acetil-L-leucil-L-leucil-L -argininal) e lasciare che le cellule si gonfiano in ghiaccio per 3 ore. </li><li> Lyse le cellule utilizzando un omogeneizzatore con larghi Un pestello tipo teflon. Eseguire 80 Dounce ictus e campioni di monitoraggio ogni 20 colpi, mediante microscopia a campo chiaro per garantire che tutte le cellule sono state lisato, ma che i nuclei hanno not stato danneggiato o rotto. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato cellulare a 300 xg, 4 ° C per 5 minuti. Conservare il SN come frazione citoplasmatica a -20 ° C in una provetta da centrifuga. </li><li> Per rimuovere i detriti cellulari dai nuclei, risospendere il pellet in 750 μ l di soluzione 1 (S1) (0,25 M di saccarosio, 10 mM MgCl 2 20 mcg / ml PMSF, una miscela di cisteina, serina, inibitori treonina e aspartil proteasi di cui 10 μ g / ml inibitore della tripsina pancreatica bovina, 10 μ g / ml pepstatina A e 10 μ g / ml N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal) e strato sopra un volume uguale di soluzione 2 (S2) (0,35 M di saccarosio, 0,5 mM MgCl 2, 20 μ g / ml PMSF, una miscela di cisteina, serina, inibitori treonina e aspartil proteasi di cui 10 μ g / ml inibitore della tripsina pancreatica bovina, 10 μ g / ml pepstatina A e 10 μ g / ml N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-argininal). Centrifuge a 1.400 xg, 4 ° C per 5 minuti. </li><li> Eliminare il SN con una micropipetta. Evitare di disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet contenente nuclei isolati in 750 μ l di S2. </li><li> Per isolare le frazioni subnucleari arricchiti con adenovirus RC (RCF), ultrasuoni risospeso nuclei con un bagno ad ultrasuoni, per mezzo di due 5 min impulsi, o fino a quando tutti i nuclei vengono lisati come osservato in microscopia in campo chiaro. Utilizzare ghiaccio in bagno a ultrasuoni come necessario per mantenere i campioni pari o inferiore a 4 ° C. </li><li> Strato nuclei sonicati su un volume uguale di soluzione di 3 (S3) (0,88 M di saccarosio, 0,5 mM MgCl 2) e centrifugare a 3000 xg, a 4 ° C per 10 min. Conservare il surnatante 1,5 ml come frazione nucleoplasmic (NPL) a -70 ° C. Risospendere il pellet in 700 μ l di S2 e negozio come RCF a -70 ° C. </li></ol> 3. Western Blot analisi di RCF NOTA: Per l&#39;analisi Western Blot NPL e RCF frazioni set oltre 640 μ l per Npl e 300 μ l per RCF dal volume totale ottenuto al punto 2.11. <ol><li> Mescolare 15 μ l di ogni frazione subnucleare in 2x tampone Laemmli (4% SDS, 20% glicerolo, 10% 2-mercaptoetanolo, 0,004% blu di bromofenolo, 0,125 M Tris HCl pH 6.8) e far bollire a 95 ° C per 5 min. Caricare i campioni in un elettroforesi 10% di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel (SDS-PAGE) e gel proteine ​​separati denaturazione per 1,5 ore, a 20 milliampere (mA). </li><li> Trasferimento proteine ​​da elettroblotting per 1,5 ore a 400 mA su di polivinile (PVDF) membrane. </li><li> Bloccare membrana per 2 ore a temperatura ambiente usando latte in polvere 3% senza grassi in PBS. </li><li> Incubare O / N a 4 ° C con anticorpo primario contro E2A DNA-binding proteina virale (B6-8 9) ad una diluizione 1: 500 in latte in polvere PBS / 0,3% senza grassi. </li><li> Membrana Lavare 3 volte con PBS / Tween 20 0,1% per 10 min. </li><li> Incubare la membrana con topo anti IgG un secondariotibody accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP) ad una diluizione 1: 10.000 in PBS per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la membrana 3 volte con PBS / Tween 20 0,1% per 10 min. </li><li> Sviluppare la membrana utilizzando chemiluminescenza e pellicole radiografiche. </li></ol> 4. virale rilevamento del DNA a RCF NOTA: per l&#39;isolamento del DNA da entrambe le frazioni Npl e RCF, utilizzare 210 μ l per Npl e 100 μ l per RCF del volume totale ottenuto nel passaggio 2.11. <ol><li> Incubare frazioni sub-nucleari per 1 ora a 55 ° C con 1 mg / ml di proteinasi K e 0,5% Tween 20. </li><li> Inattivare proteinasi K incubando i campioni per 10 min a 95 ° C. </li><li> Centrifugare i campioni a 20.000 xg, a temperatura ambiente per 2 min. </li><li> Raccogliere la SN. Precipitare il DNA con 1/10 volume di 3M acetato di sodio e un volume di isopropanolo, O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugare i campioni a 20.000 xg, a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Gettare la u SNcantare una micropipetta. Lavare il pellet con 70% etanolo e centrifugare a 20.000 xg, a 4 ° C per 5 min. </li><li> Risospendere il DNA in 10 μ l di 10 mM Tris-HCl pH 7.4 </li><li> Quantificare DNA utilizzando uno spettrofotometro misurando la densità ottica (OD) a 260 nm. </li><li> Per amplificare DNA virale, utilizzare 100 ng di DNA da ogni frazione subnucleare in una reazione standard di PCR utilizzando DNA polimerasi Taq in 25 μ l di volume di reazione con primers che permettono l&#39;amplificazione di una regione all&#39;interno del maggiore unità Dopo la trascrizione, dal nucleotide 7273 al nucleotide 7353 (81 pb) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Ap: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Utilizzare le seguenti condizioni ciclo: denaturazione iniziale per 3 min a 95 ° C, seguiti da 20 cicli di amplificazione (1 min a 95 ° C, ricottura per 1 min a 62 ° C ed estensione per 30 sec a 72 ° C) e una fase di estensione finale per 3 min a 72 ° C. </li><li> Eseguire il prodotto di PCR in 2% gel di agarosio, a 90 V. Macchia con etidiobromuro a 0,5 μ g / ml concentrazione finale e visualizzare il DNA per corroborare l&#39;arricchimento del DNA virale nel RCF. Maneggiare il bromuro di etidio con estrema cautela e assicurarsi sempre di indossare i guanti, come questo composto è un potente mutageno. Smaltire bromuro di etidio secondo le linee guida istituzionali. </li></ol> 5. Fine virale mRNA rilevamento in RCF NOTA: Per l&#39;RNA isolamento da entrambe le frazioni Npl e RCF, utilizzare 640 μ l per Npl e 300 μ l per RCF dal volume totale ottenuto al punto 2.11. <ol><li> Isolare RNA da frazioni subnucleari utilizzando Trizol accordo con le istruzioni del produttore. Risospendere l&#39;RNA a 50 μ l di DEPC (diethilpyrocarbonate) acqua -treated. </li><li> Quantificare l&#39;RNA utilizzando uno spettrofotometro per misurare la densità ottica a 260 nm (circa 3 μ g si ottengono). Conservare l&#39;RNA a 50 ng / μ l aliquote a -70 ° C. </li><li> Controllare RNA purificatoper l&#39;assenza di contaminazione DNA eseguendo un controllo di reazione PCR in assenza di trascrittasi inversa (RT), utilizzando 5 ng di RNA totale e le condizioni del ciclo descritto al punto 4.9. <ol><li> Se la contaminazione del DNA è assente non amplicone dovrebbe essere prodotto. Se la contaminazione del DNA è presente, incubare i campioni con 10 U DNasi I, 10 U di RNasi inibitore, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl e 15 mM MgCl 2 per 30 minuti a 37 ° C. Procedere alla ri-isolare l&#39;RNA come al punto 5.1. </li></ol></li><li> Per analizzare mRNA virale associato alla RCF, amplificare i 100 ng di RNA da ogni frazione subnucleare mediante RT-PCR utilizzando primer disegnati per rilevare adenovirale mRNA tardi da diverse famiglie di geni (Tabella 1). <ol><li> Per la trascrizione inversa (RT), utilizzare 100 ng di RNA, da ogni frazione subnucleare in una reazione standard di RT utilizzando M-MuLV RT enzima in 20 μ l di volume di reazione per 1 ora a 42 ° C e 10 min a 70 ° C. </li><li> Per l&#39;amplificazione, usare 1μ l di cDNA in reazioni di PCR, come al punto 4.9. Utilizzare le seguenti condizioni del ciclo: denaturazione iniziale per 3 minuti a 95 ° C, seguita da 25 cicli di amplificazione (1 min a 95 ° C, ricottura per 1 min alla temperatura indicata nella tabella 1 e l&#39;estensione per 30 sec a 72 ° C) e una passo estensione finale per 3 minuti a 72 ° C. </li></ol></li><li> Eseguire i prodotti di RT-PCR in 2% gel di agarosio, a 90 V. gel macchia con etidio bromuro a 0,5 μ g / ml concentrazione finale e visualizzare per corroborare virale tardi mRNA associazione al RCF. Maneggiare il bromuro di etidio come indicato al punto 4.10. </li></ol> 6. immunofluorescenza Visualizzazione di RCF NOTA: Carry-questa procedura sotto una cappa a flusso laminare per evitare la contaminazione dei campioni con le particelle di polvere, e filtrare tutte le soluzioni prima dell&#39;uso. <ol><li> Spot 5 μ l della frazione RCF ottenuto nel passaggio 2.10 terribilectly su un vetrino rivestito silano. </li><li> Lasciate che la macchia asciugare per circa 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Reidratare lentamente e indirettamente pipettaggio 500 μ l di PBS in una goccia accanto al posto RCF e lasciando fluire inclinando il vetrino. Scaricare l&#39;eccesso di PBS dal lato. </li><li> Block coprendo il campione con 500 μ l di PBS / 5% di albumina sierica bovina (BSA) per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il vetrino 3 volte da delicatamente e indirettamente pipettando 500 l μ di PBS sul campione. Inclinare il vetrino per drenare l&#39;eccesso di PBS. </li><li> Incubare il campione con l&#39;anticorpo primario contro E2A virale DNA-binding protein (B6-8 9) ad una diluizione 1: 500 in PBS per 2 ore a temperatura ambiente. Coprire il campione macchiato con 20 μ l di soluzione di anticorpo e incubare in una camera umida per evitare l&#39;essiccamento. </li><li> Lavare il campione 3 volte con PBS / 0,02% di Tween 20 da delicatamente e indirettamente pipettando 500 μ l di PBS sul campione. Inclinare il vetrino per scaricare l&#39;exsoluzione di lavaggio processo. </li><li> Incubare i campioni con topo anti IgG anticorpo secondario accoppiato ad un fluoroforo che viene eccitato a 488 nm in una diluizione 1: 2000 in PBS, per 1 ora a 4 ° C. Coprire il campione macchiato con 20 μ l di soluzione di anticorpo e incubare in una camera umida per evitare l&#39;essiccamento. </li><li> Lavare il campione 3 volte con PBS / 0,02% di Tween 20 da delicatamente e indirettamente pipettando 500 μ l di PBS sul campione. Inclinare il vetrino per lo scarico della soluzione di lavaggio in eccesso. </li><li> Coprire il campione individuato sul vetrino con un coprioggetto utilizzando 2 μ l PBS / 10% di glicerolo come mezzo di montaggio. Sigillare con smalto trasparente e conservare al -20 ºC. </li><li> Analizzare i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza, con un obiettivo 63x e 1.4 Aperture numerico (NA) alla lunghezza d&#39;onda di 488 nm. </li></ol>

<ol><li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).</li>
<li>Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+viral+replication+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic viral replication complexes.</a> Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).</li>
<li>Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+characterization+of+the+membranous+hepatitis+C+virus+replication+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment.</a> J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).</li>
<li>Busch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nucleoli.</a> Exp Cell Res. 24, Suppl 9. 150-163 (1963).</li>
<li>Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+Cajal+bodies+from+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).</li>
<li>Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The nucleolus.</a> J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).</li>
<li>Groitl, P., Dobner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+adenovirus+type+5+early+region+1+and+4+virus+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants.</a> Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+which+recognize+native+and+denatured+forms+of+the+adenovirus+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein.</a> Virology. 128, 480-484 (1983).</li>
<li>Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+on+adenovirus+late+gene+expression+of+deleting+the+E1b+55K+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).</li>
<li>Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1B+55-kilodalton+protein+is+required+for+both+regulation+of+mRNA+export+and+efficient+entry+into+the+late+phase+of+infection+in+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts.</a> J. Virol. 80, 964-974 (2006).</li>
<li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2%2F3+during+Adenovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Virology%22%5BJournal%5D)">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14(2014).</li>
<li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li>
<li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Al fine di chiarire i meccanismi molecolari che governano la regolazione delle attività cellulari da parte dell'infezione virale, sarebbe fondamentale comprendere la composizione e le attività associate alla RC. Pertanto, per effettuare un'analisi dettagliata del RC, abbiamo stabilito un sistema cell-free che sfrutta le dimensioni e la composizione biochimica di queste strutture indotte da virus, per isolare frazioni subnucleari arricchite con RC utilizzando una semplice procedura che si basa su gradienti di velocità con...

Adenovirus contengono un genoma a doppio filamento di DNA che si replica nel nucleo della cellula infetta. Quando il DNA virale entra nel nucleo, localizza adiacente PML corpi nucleari 1. A seguito di espressione genica virale precoce, l&#39;architettura nucleare è drammaticamente riorganizzato, inducendo la formazione di microambienti virali, chiamato Compartimenti replicazione virale (RC) 2. Dal adenovirus (Ad) RC sono i siti dove la replicazione virale e l&#39;espressione del genoma di geni virali in ritardo si svolgono, forniscono un ambiente per l&#39;assunzione di tutti i fattori virali e cellulari necessari che partecipano a questi processi. È interessante notare che una varietà di proteine ​​cellulari responsabili per la risposta antivirale cellulare, come risposta al danno del DNA, la risposta immunitaria innata e soppressione del tumore sono co-scelto di questi siti virali 2. Mozzi normativi Quindi, Annuncio RC può essere considerato che promuovono la replicazione virale efficiente, in concomitanza regolazione delrisposta antivirale cellulare, indicando che queste strutture sono la chiave per la comprensione delle interazioni delle cellule virus-ospite. Tuttavia, i meccanismi molecolari della formazione di RC, la loro composizione e le attività connesse sono poco conosciute. Adenovirale RC, nonché RC da altri virus DNA che si replicano nel nucleo non sono associati alle membrane, in contrasto con RC citoplasmatica 3. Inoltre, queste strutture virus indotta sono suscettibili di essere composto interamente di proteine ​​e acidi nucleici. RC formata in cellule infettate con virus a RNA (di solito chiamato fabbriche virali) sono stati isolati, approfittando della loro localizzazione citoplasmatica e lo status di membrana, che ha facilitato il loro morfologica dettagliata, caratterizzazione funzionale e biochimico 4. A nostra conoscenza, RC virale nucleare non sono stati isolati, forse a causa della complessità dell&#39;architettura nucleare e assenza di m intranucleariembranes che potrebbero agevolare il loro isolamento. Il loro studio si è basata invece su immunofluorescenza, FISH e microscopia elettronica a trasmissione. Tuttavia, nonostante le complicazioni inerenti a isolare strutture subnucleari, altri domini nucleari come nucleoli ed Enti Cajal sono stati isolati prima di 5,6. Poiché nucleoli e RC sono entrambi composti di proteine ​​e acidi nucleici, e hanno un diametro compreso tra 0,5 - 5 micron, abbiamo ipotizzato che RC dovrebbe anche essere suscettibili di isolamento. Pertanto, al fine di caratterizzare più precisamente la composizione molecolare e funzioni associate RC, abbiamo stabilito un nuovo metodo per isolare frazioni subnucleari arricchite con telecomando. A tal fine, abbiamo preparato sub-nucleare frazioni utilizzando gradienti di velocità e cuscini saccarosio simili a procedure utilizzate per isolare nucleoli 7 o altri domini nucleari 6 e stabilito un sistema non cellulare che permette lo studio della composizione molecolare e le attività connesse diRC. Questa tecnica dovrebbe quindi avanzare la comprensione delle interazioni delle cellule virus e ospite e rappresenta un potente strumento che dovrebbe anche facilitare l&#39;analisi dettagliata di RC da altri virus che si replicano nel nucleo e indurre la formazione di compartimenti replica di dimensioni simili a quelle costituite in adenovirus- cellule infettate, come, herpesvirus, papillomavirus o poliomavirus.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Caldo in 37 &ordm; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio, Ultra Pure</td><td>Research Organics</td><td>0928S</td><td>Preparare una soluzione madre da 2,55 M e conservare a 4 &ordm; C</td></tr><tr><td>Schiacciante Omogeneizzatore</td><td>Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 Bagno ad ultrasuoni</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp; SIGMA</td><td>Accendere 15 minuti prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG1 anti-topo di capra, coniugato Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21121</td><td>Utilizzo con diluizione 1:2.000 in vetrini PBS</td></tr><tr><td>Silane-Prep Sigma</td><td></td><td>S4651-72EA</td><td>Aperto in una cappa a flusso laminare</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato chemiluminescente</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica vano-arricchite da adenovirus-infetti cellule normali umane

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Durante l'infezione di cellule umane da adenovirus (Ad), il nucleo della cellula ospite viene drasticamente riorganizzato, portando alla formazione di microambienti nucleari attraverso il reclutamento di proteine virali e cellulari nei siti occupati dal genoma virale. Questi siti, chiamati compartimenti di replicazione (RC), possono essere considerati domini nucleari indotti da virus in cui il genoma virale è localizzato e vengono reclutate proteine virali e cellulari che partecipano alla replicazione, alla trascrizione e all'elaborazione post-trascrizionale. Inoltre, anche le proteine cellulari coinvolte nella risposta antivirale, come le proteine oncosoppressori, i componenti della risposta al danno al DNA (DDR) e i fattori di risposta immunitaria innata sono cooptati nella RC. Sebbene le RC sembrino svolgere un ruolo cruciale nel promuovere un ciclo di replicazione efficiente e produttivo, non è stata effettuata un'analisi dettagliata della loro composizione e delle attività associate. Per facilitare lo studio delle RC adenovirali e potenzialmente di quelle di altri virus a DNA che si replicano nel nucleo cellulare, abbiamo adattato una semplice procedura basata sui gradienti di velocità per isolare Ad RC e abbiamo stabilito un sistema cell-free in grado di condurre studi morfologici, funzionali e composizionali di queste strutture subnucleari indotte da virus, nonché di studiare il loro impatto sulle interazioni ospite-cellula.

Poiché compartimenti di replicazione virale (RC) sono strutture virale indotta subnucleari composte da proteine ​​e acidi nucleici, in modo simile ad altri domini nucleari, hanno dimostrato di essere suscettibili di isolamento dai gradienti di velocità basati su caratteristiche biochimiche. Passaggi critici nel protocollo di frazionamento sono illustrati nella Figura 1. Ad ogni passo i campioni devono essere monitorati mediante microscopia in campo chiaro per garantire l&#39;integrità d...

Forniamo una nuova strategia per isolare i compartimenti di replicazione virale (RC) dalle cellule umane infettate da adenovirus (Ad). Questo approccio rappresenta un sistema cell-free che può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che regolano la replicazione e l'espressione del genoma virale, nonché la regolazione delle interazioni virali-ospite stabilite al RC.

Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una frazione non nucleare arricchita di compartimenti di replicazione formati in cellule infettate da adenovirus, per lo studio dettagliato della loro composizione, struttura ultrastrutturale e attività associate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia del DNA, come lo studio dei meccanismi molecolari che controllano la replicazione e l'espressione del genoma virale, i quali a loro volta dipendono dai compartimenti di replicazione per la regolazione delle interazioni tra virus e cellula ospite. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si tratta di una procedura semplice, basata su un gradiente di velocità, per ottenere un sistema acellulare adatto allo studio dei meccanismi che consentono ai virus a DNA replicanti nel nucleo di prendere il controllo della cellula infettata.Per eseguire questo saggio, preparare innanzitutto l'adenovirus di tipo cinque o D cinque e i fibroblasti di prepuzio umano o HFF come descritto nel protocollo testuale allegato, quindi iniziare a infettare 10 alla settima potenza di HFF in piastre da coltura tessutale da 100 millimetri utilizzando un millilitro di 85 e DMM per piastra a un MOI di 30 unità formanti placche o FFU per cellula. Incubare le cellule per due ore in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, agitando delicatamente le piastre ogni 15 minuti per garantire una distribuzione omogenea dell'inoculo virale sulle cellule. Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo e aggiungere dmem fresco.Integrato con FBS al 10%, quindi incubare le cellule per 16, 24 o 36 ore utilizzando un raschietto per cellule. Raccogliere delicatamente le cellule infette e quelle di controllo dopo l'infezione e raccogliere la sospensione cellulare in provette sterili per centrifuga su ghiaccio. Contare le cellule utilizzando una camera di Neubauer e quindi centrifugare le cellule a 220 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio, centrifugare e lavare le cellule tre volte in cinque millilitri di PBS freddo di ghiaccio, scartando i soprannatanti di lavaggio per lisare le cellule. Risospendere il pellet cellulare in 700 microlitri di tampone ipotonico freddo di ghiaccio contenente inibitori della proteasi e lasciare gonfiare le cellule sul ghiaccio per tre ore. Omogeneizzare le cellule utilizzando un pestello in teflon di tipo A con 10-20 movimenti verso il basso.Controllare periodicamente il lisato al microscopio ogni 20 passaggi per monitorare la lisi cellulare. Ripetere il processo per circa 80 passaggi fino a quando tutte le cellule non sono state completamente rotte. Successivamente, centrifugare l'omogenato a 300 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Conservare il soprannatante a meno 20 gradi Celsius in un tubo come frazione citoplasmatica per rimuovere i detriti cellulari dai nuclei. Sospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione di saccarosio 0,25 molare uno, pipettare 750 microlitri di soluzione di saccarosio 0,35 molare due in un tubo da centrifuga e stratificare con attenzione l'omogenato risospeso sopra la soluzione due. Centrifugare il cuscino di saccarosio a 1400 ×g a 4 gradi Celsius per cinque minuti, quindi scartare il soprannatante.Risospendere il pellet in 750 microlitri di soluzione due per lisare. Sonicare la sospensione nucleare in un bagno ad ultrasuoni, mantenuto a o al di sotto di quattro gradi Celsius, con due impulsi di cinque minuti ciascuno. Verificare la lisi nucleare al microscopio in campo chiaro tra un impulso e l'altro e continuare la sonica finché i nuclei non sono completamente lisiati.Successivamente, pipettare 750 microlitri di soluzione tre di saccarosio 0,88 molare in un tubo da centrifuga; stratificare la soluzione del lisato nucleare sopra la soluzione tre. Centrifugare il lisato a 3000 × g a 4 gradi Celsius per 10 minuti. Il soprannatante di 1,5 millilitri ottenuto è la frazione nucleoplasmatica, che viene conservata a meno 70 gradi Celsius.Quindi risospendere il pellet in 700 microlitri della soluzione due. Questa è la frazione del compartimento di replicazione 85 o RCF del nucleo dell'ospite, che viene anche conservata a meno 70 gradi Celsius. Per iniziare l'analisi di immunofluorescenza, aggiungere una goccia di cinque microlitri della RCF su un vetrino rivestito con soluzione salina.Lasciare asciugare la goccia all'aria a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 500 microlitri di PBS sotto forma di goccia accanto al punto e inclinare il vetrino in modo da far scorrere il PBS sul punto. Rimuovere il PBS dal vetrino.Successivamente, bloccare il punto campione con 500 microlitri di PBS contenente l'albumina sierica bovina al 5% per due ore a temperatura ambiente. Per rimuovere l'eccesso di soluzione di blocco, aggiungere delicatamente 500 microlitri di PBS al campione depositato sul vetrino senza pipettare direttamente sul campione. Eseguire il lavaggio tre volte.Successivamente, aggiungere 20 microlitri di anticorpo primario diluito contro la proteina virale E2A legante il DNA sul campione. Coprire il vetrino per evitare l'evaporazione e incubare in una camera umidificata a temperatura ambiente per due ore. A questo punto, lavare delicatamente il campione tre volte con PBS contenente 0,02% di Tween 20.Evitare di pipettare direttamente sul campione dopo questi lavaggi. Aggiungere 20 microlitri di anticorpo secondario murino coniugato con fluoro quattro direttamente sul campione, incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. In una camera umidificata, aggiungere 500 microlitri di PBS con 0,02% di Tween 20 ai vetrini, evitando nuovamente di pipettare direttamente sul campione.Quindi aggiungere due microlitri di soluzione di montaggio e capovolgere un coprioggetto sul campione. Sigillare i bordi dei coprioggetti con smalto per unghie. Osservare il vetrino al microscopio a fluorescenza con un obiettivo 63x alla lunghezza d'onda desiderata specifica per il fluorocromo utilizzato. Un risultato dell'immunofluorescenza della proteina legante il DNA E2A del adenovirus o DBP è mostrato qui.Le strutture contenenti DBP sono repliche virali subnucleari; si noti che la DBP E due A è localizzata all'interno della RC e appare in verde. Inoltre, l'arricchimento del DNA virale nella frazione RC è stato confermato mediante PCR, confrontando la frazione RC con la frazione nucleoplasmatica (NPL) a 24 e 36 ore dall'infezione. Il DNA virale è stato trovato selettivamente nella frazione RC e non nella frazione NPL.Il testo allegato fornisce ulteriori prove della presenza di MNA adenovirale nel RCF. Una volta padroneggiata questa tecnica, è possibile completarla in sei ore, a partire dal momento del raccolto delle cellule infette fino all'isolamento del RCF, se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale ricordare di mantenere sempre i campioni sul ghiaccio e di monitorare al microscopio in campo chiaro i passaggi di omogeneizzazione, isolamento, sonificazione e isolamento delle frazioni subnucleari. Seguire questa procedura.Altri metodi come la R-T-P-C-R e la microscopia elettronica a trasmissione possono essere eseguiti per studiare la regolazione dell'espressione genica virale associata ai compartimenti di replicazione virale e l'ultrastruttura di queste particelle. Questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo della virologia dei tumori a DNA per esplorare i meccanismi molecolari che alterano la regolazione del ciclo cellulare e promuovono la replicazione virale nelle cellule umane. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i compartimenti di replicazione virale dai nuclei delle cellule infette per effettuare studi morfologici, funzionali e composizionali di queste strutture indotte dal virus.Non dimenticare che lavorare con un indicatore SAN può essere pericoloso e precauzioni, come indossare protezioni per le orecchie, devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

isolation-viral-replication-compartment-enriched-sub-nuclear

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il genoma del virus influenzale A si compone di otto complessi separati di RNA e proteine, chiamate complessi ribonucleoproteina virale (vRNPs). Questo documento descrive la purificazione gradiente glicerolo e microscopia elettronica visualizzazione trasmissione di influenza A vRNPs.

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Noi descriviamo il processo di isolamento del DNA ad alta herpesvirus nucleocapside purezza dalle cellule infette. Il DNA finale catturato dalla soluzione è di alta concentrazione e purezza, rendendolo ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni per produrre nuovi ricombinanti virali.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Qui si descrive un protocollo basato solo sulle infezione delle cellule, che migliora l'efficienza della produzione di parvovirus ricombinante di oltre 100 volte in confronto ad altri protocolli in uso. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di un adenovirus nuovo 5-helper base contenente la VP parvovirus unità di trascrizione (Ad-VP).

Efficienti di produzione Parvovirus ricombinante con l&#39;aiuto delle Adenovirus sistemi derivati

I virus influenzali replicare il loro genoma RNA in associazione con la cellula ospite cromatina. Qui, vi presentiamo un metodo per purificare intatti complessi ribonucleoproteina virali dalla cromatina delle cellule infette. Purificato complessi virali possono essere analizzati mediante Western blot e sia di estensione del primer di proteine ​​e RNA, rispettivamente.

Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l'analisi molecolare della differenziazione delle cellule T...

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Viene presentato un protocollo per la generazione di vettori adenovirali ad alta capacità privi di tutte le sequenze di codifica virale. Il clonaggio dei transgeni contenuti nel genoma del vettore si basa sulle endonucleasi di homing. L'amplificazione del virus nelle cellule produttrici cresciute come cellule aderenti e in sospensione si basa su un virus helper che fornisce geni virali in trans.

Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di adenovirus utilizzando il sistema pAdEasy. La tecnologia include la ricombinazione dei plasmidi pAdTrack e pAdEasy-1, l'imballaggio e l'amplificazione dell'adenovirus, la purificazione delle particelle adenovirali dal litorato cellulare e dal mezzo di coltura, la titolazione virale e il test funzionale dell'adenovirus.

Un metodo efficiente per la produzione di adenovirus

Il virus adeno-associato viene prodotto in coltura cellulare in sospensione e purificato mediante centrifugazione a gradiente di densità a doppio iodixanolo. Sono incluse misure per aumentare la resa totale del virus, diminuire il rischio di precipitazione del virus e concentrare ulteriormente il prodotto finale del virus. I titoli finali attesi raggiungono10-12 particelle virali/mL e sono adatti per l'uso preclinico in vivo .

Produzione e purificazione in coltura in sospensione di virus adeno-associati mediante centrifugazione a gradiente di densità di iodixanolo per applicazioni in vivo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un'elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Impara a isolare compartimenti di replicazione virale da cellule umane infettate da adenovirus. Questo metodo basato su gradiente di velocità permette di studiare i meccanismi molecolari della replicazione del genoma virale e le interazioni ospite-patogeno.

Isolamento di frazioni sub-nucleare virale replica Vano-arricchite da Adenovirus-infetti cellule normali umane

Esplora altri video