חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה

כאן אנו מדגימים את השימוש בפפטיד חודר תאים עם אוליגו-נוקלאוטיד אנטי-סנס מושנה כדי להשתיק באופן ספציפי micro RNA במוח של עכברים. הדבר הושג על ידי עיצוב antigo נגד May 29. במחקר זה, השתמשנו ב-antigo זכרים כדי לטרגט microRNAs עם מודיפיקציות של lock nucleic acid.

כלומר, בוצעו מודיפיקציות LNA בחמישה מיקומים שונים. שילוב של מודיפיקציות LNA מחזק את זיקת הקישור של המולקולה ל-microRNA. כמו כן, הדבר מעניק עמידות לפניוקלאזים ובכך משפר את יעילות התקיפה של ה-microRNA.

קומפלקסים של ANTIGO MAR עם הפפטיד הוכנו in vitro והוזרקו לעכברים דרך וריד הזנב. השהיית הביטוי (knockdown) של ה-microRNA גרמה לשינויים התנהגותיים המצביעים על מעורבותו של microRNA זה באטקסיה; שלוש הזרקות רצופות הספיקו כדי להוביל לשינוי ניכר בהליכה. לאחר הטיפול, נדגמו רקמות מוח והשהיית הביטוי של ה-microRNA אוששה. CPPs, או פפטידים חודרי-עצמיים, הופיעו לאחרונה כנשאיים אטרקטיביים להעברת חומצות גרעין.

כאן השתמשנו בפפטיד נוירוטרופי עשיר בארגינין המסוגל לעבור קומפלקסציה מבוססת מטען עם ה-LNA, אשר לאחר הזרקה למחזור הדם המערכתי, יגיע לאתר המטרה המיועד לו – במקרה זה תאי עצב – ויבטיח שחרור תקין של ה-LNA לתוך תאים אלו. רצפי בני המשפחה של ME 29 נשגלו מ-mease, ו-16 ה-MER antisense סונטזו עם מודיפיקציות של lock nucleic acid בחמישה מיקומים במרווחים שווים להכנת קומפלקסים. תמיסות הפפטיד וה-antigo בריכוזים המתאימים הוכנו בנפרד ב-10% glucose סטרילי.

בתנאים אספטיים. תמיסת ה-Antigo הוספה באיטיות, טיפה אחר טיפה, לתמיסת הפפטיד תוך כדי ערבוב עדין. הוספה איטית וערבוב עדין הם קריטיים להיווצרות של קומפלקסים מפוזרים באופן מונו-דיספרסיבי שגודלם הוא בסדר גודל של tric.

את ה-antigo הוסיפו בשלושה חלקים שווים בכל פעם, תוך מתן דקה לערבוב, ולאחריה דקה של דגירה ללא ערבוב. הוספה מהירה עלולה להוביל לצבירה של הקומפלקסים ולשיקוע. קומפלקס ה-antigo מוכן כעת להזרקה.

הקומפלקס הוגש באמצעות הזרקה לווריד הזנב. העכברים הוחזרו לאותו כלוב. בדיקות התנהגותיות לאטקסיה בוצעו מדי יום, שלוש שעות לאחר ההזרקה.

העכבר הוחזק בזנבו, מבלי לאפשר לו לגעת בחפצים סביבו. שימו לב לאופן שבו הגפיים האחוריות פרושות למשך 10 שניות. במבחן השפה, העכברים נדרשו ללכת לאורך השפה הדקה של הכלוב.

העכברים הולכים דרך תעלה צרה ומותירים עקבות של רגליים עם דיו על רצועה של נייר סופג עבה; רק הרגליים האחוריות נצבעות בדיו. כדי למנוע נתונים מעורבבים מארבע הגפיים, נבחן את השפעת הטיפול האנטיגני. בידדנו את המוח ורקמות אחרות מהעכברים המטופלים ומהעכברים בקבוצת הביקורת.

מצאנו כי הפפטיד R VG העביר siRNA מסומן פלואורסצנטית באופן ספציפי למוח, אך לא לרקמות אחרות כמו הכבד. פפטיד ביקורת שאינו נוירוטרופי, RVM, העביר את ה-siRNA לכבד. עכברים שטופלו ב-ANTIER 29 הראו פגמים בגפיים האחוריות.

עכברים שנשלטו והטופלו ב-anme scrambled הצליחו לעבור את המדרגה, אך לאחר טיפול ב-anme נגד MARE 29, העכברים הראו פגמים קלים בבדיקה זו. בבדיקת טביעות הרגל, נצפתה קיצור בולט של אורך הצעד בעכברים המטופלים. בנוסף, איששנו באמצעות QR tpcr שרמות של mid 29 A ו-mid 29 B היו מופחתות (downregulated) לצורך פיתוח טיפולים מבוססי micro NNA.

ההגעה של anti-microRNAs למטרה ספציפית במוח מהווה אתגר בשל מחסום הדם-מוח. באמצעות הטכניקה המוצגת כאן, ניתן להימנע משיטת ההעברה המקובלת של anti-microRNAs למוח. שיטה זו הופכת את השביית (knockdown) של microRNAs לאפשרית מבחינה טכנית ומגבירה את הספציפיות לרקמה.