Name: Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Impara a misurare il pH dei fagosomi nelle cellule fagocitarie vive mediante microscopia a fluorescenza raziometrica. Questa tecnica consente il monitoraggio in tempo reale delle variazioni di pH durante la maturazione fagosomiale.

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Gli autori sono sostenuti finanziariamente dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica attraverso una sovvenzione operativa N° 31003A-149566 (a N.D.), e dal Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust attraverso una sovvenzione per giovani ricercatori (a P.N.).

Etica Dichiarazione: Tutte le manipolazioni sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le linee guida del Comitato delle Università di Ginevra Animal Research. 1. Preparazione di obiettivi fagocitiche <ol><li> Aggiungere 20 mg di zimosan essiccata a 10 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS). Vortex e calore in un bagno di acqua bollente per 10 min. Raffreddare e centrifugare a 2000 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere in 1 ml di PBS e ultrasuoni per 10 minuti in un bagno sonicatore acqua. Trasferire 500 microlitri di due provette da 1,5 ml. Centrifugare a 11.000 g per 5 min. </li><li> Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di PBS. Il zymosan bollito può essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C. </li><li> Lavare zymosan due volte in 500 microlitri preparate 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 come sopra (punto 1.2). </li><li> Risospendere in 490 microlitri dopo il lavaggio finale. Aggiungere 10 ml di 10 mg / ml FITC sciolto in dimetil sulfoxide (DMSO), vortice, coprire con un foglio, e incubare con agitazione per 4 ore a temperatura ambiente. </li><li> Per rimuovere il colorante, lavare come in precedenza (punto 1.2), prima con 0,5 ml di DMSO + 150 l di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 300 ml di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 450 l di PBS, poi PBS da solo. </li><li> Conte zymosan utilizzando un emocitometro. Aggiungere 1 ml di zymosan a 500 microlitri di PBS, vortex, quindi aggiungere 10 microlitri al bordo della camera dell&#39;emocitometro, dove incontra il coprioggetto posto sopra la griglia centrale. Montare il emocitometro su un microscopio in campo chiaro equipaggiato con un obiettivo 20X. </li><li> Focus su nell&#39;angolo in alto a sinistra contenente 16 piazze e contare tutte le particelle zymosan in questo settore con un contatore riscontro mano. Ripetere con l&#39;angolo in basso a destra. Calcolare la concentrazione zymosan utilizzando la seguente equazione: concentrazione Zymosan = Count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Zymosan etichettati, possono essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C. </li><li> Opsonize l&#39;etichetta wi zymosanTh A anticorpo anti-coniglio di zymosan a diluizione 1: 100. Vortex e incubare per 1 ora in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Lavare con 500 microlitri di PBS come sopra (punto 1.2). Nota: Sonicazione è altamente raccomandato, in particolare dopo opsonizzazione, come zymosan tende a formare grumi che possono rendere l&#39;analisi più difficile in seguito. Opsonizzazione con il 65% v / v di ratto o siero umano può essere utilizzato in alternativa. </li><li> Conte zymosan utilizzando un emocitometro come descritto nei passaggi 1,7-1,8, e portare a 100 x 10 6 particelle / ml. Opsonizzazione con altri stimolatori fagocitosi, come complemento o no opsonizzazione, può essere effettuata in alternativa. </li></ol> 2. Live Video Microscopia <ol><li> Isolare neutrofili principale del mouse come descritto in dettaglio altrove 38. <ol><li> In alternativa, utilizzare qualsiasi tipo di cellula fagocitica. Mantenere neutrofili sul ghiaccio in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 5% di siero fetale bovino (v / v), penicillina 200 U / streptomycin, ad una concentrazione di 10 x 10 6 cellule / ml fino al momento dell&#39;uso. Altri tipi di cellule possono essere seminate 1-4 giorni prima. </li></ol></li><li> Aggiungere 2 x 10 5 (20 ml) di neutrofili al centro di un piatto fondo di vetro 35 mm, diffondere il calo aggiungendo 50 ml di terreno ed incubare a 37 ° C per 5 minuti per consentire cellule di aderire. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) riscaldato a 37 ° C che contiene la specifica MPO idrazide inibitore 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 micron). Non specifici inibitori MPO, come il sodio azide (5 mm), possono anche essere utilizzati, ma sono state recentemente suggerito di esercitare ulteriori effetti non specifici sul pH 39. </li><li> Montare il piatto su un microscopio a fluorescenza widefield dotato di un sistema di riscaldamento 37 ° C e un obiettivo 40X olio. Incubare le cellule senza l&#39;imaging per 10 minuti per consentire alle cellule e attrezzature equilibrare. </li><li> Regolare le impostazioni del microscopio per acquisire un&#39;immagine di trasmissione in campo chiaro [phase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC), se disponibile] con 440 nm o 490 nm di eccitazione e 535 nm di emissione ogni 30 sec. </li><li> Regolare il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione secondo il sistema microscopio per evitare troppo photobleaching e fototossicità e seconda delle domande sperimentali viene chiesto. Inizia l&#39;acquisizione delle immagini. </li><li> Dopo 2 min, aggiungere 10 x 10 6 (50 microlitri) opsonizzati FITC-zymosan al centro del piatto. Regolare bersaglio: i rapporti di cellule a seconda del tipo di fagociti e target utilizzato. </li><li> Continuare di imaging per 30 min. Dopo 30 minuti fermare l&#39;acquisizione time-lapse e avviare un timer. Spostare lo stadio e catturare più di 10 istantanee in diversi campi di vista di immagine altri fagosomi, tutti a 5 minuti. </li></ol> 3. taratura e controllo Esperimenti <ol><li> Preparare le soluzioni di taratura pH (ricette sono descritti nella Tabella 1) prima del giorno di esperimento e congelare in 10 ml aliquote.Scongelare le soluzioni di taratura e la calda a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua. Controllare il pH con un pHmetro e registrare il pH effettivo di soluzioni. </li><li> Montare una pompa peristaltica sul fondo piatto di vetro prima acquisizione dell&#39;immagine ed eseguire la microscopia video dal vivo come descritto sopra (sezione 2). </li><li> Alla fine del periodo di acquisizione 30 min accendere la pompa per rimuovere la soluzione all&#39;interno del piatto, aggiungere 1 ml della prima soluzione di calibrazione e arrestare la pompa. </li><li> Attendere che il segnale si stabilizza, di solito 5 min. Ripetere con ogni soluzione di calibrazione. <ol><li> Effettuare almeno una calibrazione al giorno sperimentale, e calibrare iniziando con il più alto pH e sequenzialmente lavorare al minimo, così come a partire dal pH basso e lavorando in sequenza verso l&#39;alto. </li></ol></li><li> Come controllo, aggiungere 100 ml di 100 mM inibitore NADPH ossidasi difenil propionium ioduro (DPI) diluiti in HBSS alle cellule in 900 microlitri HBSS nel piatto fondo di vetro, eincubare per 10 min. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione e aggiungere zymosan come sopra (punto 2.7). Dopo 15 min di fagocitosi, aggiungere 10 ml di 10 mM inibitore V-ATPasi concanamycin A (ConcA) diluiti in HBSS e continuare l&#39;imaging per altri 15 min. </li></ol> 4. Analisi <ol><li> L&#39;analisi dei filmati time-lapse e istantanee phagosome. Nota: Le seguenti istruzioni sono specifici per ImageJ. Step-by-passo le istruzioni possono variare ampiamente a seconda del software utilizzato, ma le funzioni descritte in questa sezione sono disponibili nella maggior parte dei software di analisi immagine professionale. <ol><li> Aprire le immagini con il software di analisi di immagine professionale. Sottrarre il fondo nel canale 490 tracciando una piccola ROI piazza con lo strumento di selezione del poligono piazza in una zona dove non ci sono le cellule, e facendo clic su Plugins&gt; BG Sottrazione di ROI. Poi caricare lo stesso ROI sul canale 440 facendo clic su Modifica&gt; Selezione&gt; Ripristina selezione e ripetere. </li><li>Fare un rapporto di immagine a 32 bit del canale 490 diviso per il canale 440 cliccando processo&gt; Calcolatrice Immagine ..., selezionando le immagini appropriate nei menu a scorrimento visualizzati Image1 e Image2, quindi selezionando &#39;Divide&#39; nel menu a discesa Operazione , e controllando il risultato casella di controllo a 32 bit (float). </li><li> Cambia il look-up table colori per una codifica a colori compatibile rapporto facendo clic su Immagine&gt; tabelle di ricerca&gt; Arcobaleno RGB. Soglia l&#39;immagine rapporto di eliminare 0 e infinito pixel facendo clic su Immagine&gt; Regola&gt; Soglia .... Regolare le barre di scorrimento in modo che zymosan appare in rosso e fare clic su Applica, assicurandosi che i pixel dello sfondo Imposta la casella di controllo per NaN è selezionata. </li><li> Combinate questo rapporto stack con il canale in campo chiaro in un composito multi-canale cliccando Immagine&gt; Colore&gt; Unisci canali, e selezionando l&#39;immagine in campo chiaro nel menu a discesa dei canali grigio e l&#39;immagine il rapporto nel menu a discesa canale verde, e selezionando laMantenere immagini di origine check-box. Scansione film time-lapse o istantanee per determinare quale phagosomes devono essere analizzati. Il canale in campo chiaro è utile per questo. </li><li> Disegna regioni di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione ovale poligono attorno fagosomi, e aggiungerli al gestore ROI facendo clic su Analizza&gt; Strumenti&gt; ROI Manager&gt; Aggiungi. Misurare il loro rapporto di intensità zymosan facendo clic su Altro&gt; multimisura e de-selezionando l&#39;Una riga per fetta casella di controllo. </li><li> Per i filmati time-lapse, pista phagosomes uno alla volta disegnando un ROI, digitando CTRL + M per misurare ogni punto di tempo, e spostando il ROI in caso di necessità di monitorare i valori di intensità nel corso del tempo. Copiare le misurazioni dalla finestra Risultati in un foglio elettronico. Nota: Analisi di 15 (5 andamenti temporali per esperimento x 3) esperimenti indipendenti è ideale, ma più o meno può essere richiesta a seconda della variabilità osservata. Salvataggio delle ROI è sempre consigliato. Alcuni pacchetti software consentono regi immaginestrazione e aggiornamento dinamico di ROI, facilitare questo parte dell&#39;analisi. </li></ol></li><li> La conversione da fluorescenza a valori di pH <ol><li> Misurare il rapporto 490/440 per phagosomes nella calibrazione film time-lapse, come descritto nella sezione 4.1. </li><li> In un foglio di calcolo, tracciare i valori del rapporto nel corso del tempo, e calcolare i valori medi del rapporto da tutti i fagosomi all&#39;interno del campo di vista (di solito, tra 5-20) da 5 punti temporali entro la metà del periodo di tempo corrispondente ad ogni calibrazione pH soluzione. (Vedi anche le caselle rosse nella figura 5A.) </li><li> Tracciare questi medi 490/440 valori del rapporto contro il pH attuale di misura. Combina almeno 3 tarature indipendenti in un unico grafico. Utilizzare un pacchetto software statistico o numerico per eseguire una regressione lineare (migliore misura della curva), di solito per una equazione sigmoidale. Nota: per esempio, nella Figura 5B l&#39;equazione utilizzata era un sigmoidale Boltzmann [Y = inferiore + ((Alto-Basso)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], dove i valori di Y sono i rapporti 490/440, X sono i valori di pH e alto, in basso, i parametri V50 e pendenza sono calcolati dal software. </li><li> Usare l&#39;equazione ottenuto di trasformare valori di rapporto al pH. Nota: Per esempio, nella Figura 5B nell&#39;equazione ottenuto per la curva di calibrazione in presenza di sodio azide è 490/440 Ratio = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Risolvendo per pH dà la seguente equazione: pH = 6.993 - 0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sebbene più tempo rispetto metodi alternativi, come la spettroscopia e FACS, che impiegano una simile strategia di utilizzo di un colorante sensibile al pH accoppiato obiettivi ma misurano il pH medio di una popolazione di fagosomi, microscopia offre diversi vantaggi. Prima è che interno ed esterno vincolati, ma non interiorizzato, le particelle possono essere facilmente distinguibili, senza dover aggiungere altre sostanze chimiche, come trypan blu o di anticorpi, per placare o etichettare particelle esterne, rispettiva...

La fagocitosi, il processo attraverso il quale le cellule immunitarie innate inghiottono particelle di grandi dimensioni, si è evoluta dal meccanismo alimentare degli organismi unicellulari, e comporta il legame con un bersaglio, avvolgendolo con una membrana e pizzicando la membrana per formare un vacuolo all'interno del citosol chiamato fagosoma. Mentre la membrana fagosomiale è derivata dalla membrana plasmatica, lo smistamento attivo delle proteine e dei lipidi, così come la fusione con le endomembrane durante la formazione dei fagosomi, trasformano il fagosoma in un organello distinto all'interno della cellula con proprietà degradative che consentono l'uccisione, la neutralizzazione e la rottura del materiale ingerito1-3. Questo processo, chiamato maturazione fagosomiale, si basa sulla somministrazione di una serie di enzimi proteolitici e microbicidi, tra cui la nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi che trasferisce elettroni nei fagosomi producendo il forte ossidante O2- e le sue specie reattive dell'ossigeno derivate (ROS) 2,4. 
Il pH luminale dei fagosomi ha una profonda influenza su diversi eventi necessari per la funzione dei fagosomi. In primo luogo, il pH influenza il traffico delle endomembrane in generale, poiché i cambiamenti conformazionali pH-dipendenti dei regolatori del traffico transmembrana alterano il reclutamento di determinanti del traffico come Arfs, Rabs e proteine del rivestimento vescicolare, che a loro volta definiscono quali vescicole possono fondersi con i fagosomi 5-8. In secondo luogo, anche la composizione ionica del lume fagosomiale si trasforma man mano che i fagosomi maturano, e alcuni trasportatori ionici, come lo scambiatore Na+/H+ o gli antiportatori Cl-/H+ della famiglia ClC, che promuovono la funzione fagocitica, si basano sulla traslocazione H+ 9,10. Allo stesso modo, la produzione di ROS è intimamente legata al pH fagosomiale. I ROS e i suoi sottoprodotti ossidanti tossici sono stati a lungo riconosciuti come cruciali per l'uccisione fagosomiale nei neutrofili 4,11,12 e hanno dimostrato di svolgere un ruolo critico in altri fagociti, tra cui i macrofagi, le cellule dendritiche (DC) e l'ameba 13-16. La NADPH ossidasi è un enzima elettrogenico che rilascia H+ nel citosol quando viene consumato e che richiede il trasferimento simultaneo di H+ attraverso i canali HVCN1 insieme agli elettroni trasportati nel lume fagosomiale, al fine di alleviare la massiccia depolarizzazione che altrimenti porterebbe all'autoinibizione dell'enzima 17-21. Infine, diversi enzimi proteolitici hanno un'attività ottimale a pH diversi, quindi le variazioni di pH fagosomiale dipendenti dal tempo possono influenzare quali enzimi sono attivi e quando. L'importanza del pH fagosomiale è evidenziata da organismi come Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis e Salmonella typherium che sovvertono l'uccisione fagocitaria almeno in parte alterando il pH fagosomiale 22-24.
Nei mammiferi i principali fagociti sono neutrofili, macrofagi e cellule dendritiche e, a seconda del tipo di cellula, le variazioni di pH fagosomiale dipendenti dal tempo possono variare notevolmente e sembrano svolgere ruoli diversi. Nei macrofagi una forte e rapida acidificazione mediata dall'ATPasi vacuolare della pompa protonica ATP-dipendente (V-ATPasi) è uno dei fattori chiave che mediano l'uccisione 25-27, simile ai meccanismi presenti nell'ameba che utilizza la fagocitosi come meccanismo alimentare 28. In queste cellule si ritiene che l'attivazione delle proteasi acide svolga un ruolo chiave. Al contrario, l'uccisione dei neutrofili si basa maggiormente sui ROS e sull'HOCl prodotto dalla mieloperossidasi (MPO)11, e il pH rimane neutro o alcalino durante i primi 30 minuti, acidificandosi solo successivamente a 29,30. È stato suggerito che il pH neutro favorisca l'attività delle proteasi ossidative come alcune catepsine. Nelle DC il pH fagosomiale è controverso, con alcune che riportano acidificazione e altre con pH neutro o alcalino 31,32, ma i ROS e il pH possono influenzare profondamente la capacità di queste cellule di presentare antigeni alle cellule T, una delle loro principali funzioni 33. 
È importante sottolineare che ormoni, chemochine e citochine possono produrre eventi di segnalazione che inducono la maturazione e i cambiamenti nel comportamento dei fagociti e, a loro volta, influenzano il pH fagosomiale 34,35. Allo stesso modo, i farmaci, ad esempio l'antimalarico clorochina, che è anche considerato per le terapie antitumorali 36, possono influenzare il pH fagosomiale e quindi gli esiti immunitari. Pertanto, una varietà di biologi cellulari, immunologi, microbiologi e sviluppatori di farmaci può essere interessata a misurare il pH fagosomiale quando cerca di comprendere i meccanismi alla base degli effetti di una particolare alterazione genetica, composto bioattivo o microrganismo sulle risposte immunitarie innate e adattative. 
Qui descriviamo un metodo per misurare il pH fagosomiale nei neutrofili che ci ha permesso di mostrare l'importanza del canale HVCN1 nella regolazione del pH 19 dei neutrofili. Il metodo si basa sulla proprietà raziometrica dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC) la cui emissione di fluorescenza a 535 nm è sensibile al pH quando eccitata a 490 nm ma non a 440 nm 37. Quando questo colorante è accoppiato chimicamente a un bersaglio, in questo caso lo zimosoma, può essere seguito utilizzando la microscopia a fluorescenza ad ampio campo, in cui le cellule vengono visualizzate mentre fagocitano e le variazioni di pH fagosomiale vengono misurate in tempo reale durante la maturazione del fagosoma. Il pH effettivo viene quindi raccolto eseguendo un esperimento di calibrazione in cui le cellule che hanno fagocitato sono esposte a soluzioni di pH diverso che contengono gli ionofori nigericina e monensina, che consentono il rapido equilibrio del pH all'interno dei fagosomi con la soluzione esterna. I valori del rapporto vengono quindi confrontati con il pH noto delle soluzioni, viene costruita una curva di calibrazione mediante regressione non lineare e l'equazione risultante viene utilizzata per calcolare il pH dal valore del rapporto.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Esistono vari fornitori Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-zymosan (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 è un prodotto equivalente. In alternativa, il siero al 25% può essere utilizzato come reagente opsonante.</td></tr><tr><td>4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Difenileneodonio cloruro (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Concanamicina A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono</td></tr><tr><td>Hank's balance salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Ringer's balanced salt solution o altri chiari tamponi fisiologici possono essere sostituito.</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td>Esistono diversi fornitori</td></tr><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td>Esistono diversi fornitori</td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&primo;,acido N&primo;-tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&nbsp;</td><td>Esistono diversi fornitori</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Esistono vari fornitori</td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 35 mm con fondo in vetro (Fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Possono essere sostenute piastre o vetrini coprioggetti Ibidi &micro;-clear con camere di imaging appropriate</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua sonicante</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>Al suo posto può essere utilizzato un sonicatore, esistono vari fornitori di strumenti</td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Esistono vari fornitori</td></tr> <tr><td>di strumentiMicroscopio a distanza larga per immagini dal vivo</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Esistono diversi fornitori di strumenti, ma il microscopio deve essere in grado di visualizzare rispettivamente l'eccitazione/emissione 440/535 e 490/535. Le configurazioni confocali a disco rotante con capacità di campo chiaro possono essere sostituite, ma lo zimosano tende ad andare fuori fuoco più spesso. &nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Esistono diversi fornitori di strumenti</td></tr><tr><td>pHmetro</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>Esistono vari fornitori di strumenti</td></tr><tr><td>Contatore manuale</td><td>Milian SA</td><td></td><td>Esistono vari fornitori di strumenti</td></tr></tbody></table>

misurare phagosome ph raziometrico microscopia a fluorescenza

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Fagocitosi è un processo fondamentale attraverso il quale le cellule immunitarie innate fagocitare batteri, cellule apoptotiche o altre particelle estranee al fine di uccidere o neutralizzare il materiale ingerito, o di presentarlo come antigeni e di avviare le risposte immunitarie adattive. Il pH di fagosomi è un parametro critico regolazione fissione o fusione con endomembrane e l&#39;attivazione degli enzimi proteolitici, eventi che permettono al vacuolo fagocitosi di maturare in un organello degradativa. Inoltre, è richiesto di traslocazione H + per la produzione di elevati livelli di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), che sono essenziali per l&#39;uccisione efficiente e segnalazione ad altri tessuti dell&#39;ospite. Molti patogeni intracellulari sovvertono uccisione fagocitico limitando phagosomal acidificazione, sottolineando l&#39;importanza del pH in phagosome biologia. Qui si descrive un metodo per misurare raziometrica phagosomal pH nei neutrofili con fluoresceina isotiocianato (FITC) -labeled zymosan come phagocytic targETS e live-cell imaging. Il saggio si basa sulle proprietà di fluorescenza di FITC, che si spegne da pH acido quando eccitato a 490 nm ma non quando eccitato a 440 nm, permettendo la quantificazione di un rapporto pH-dipendente, piuttosto che di fluorescenza assoluta, di un singolo colorante. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l&#39;esecuzione in loco di calibrazione tintura e la conversione del rapporto di valori reali di pH. Single-dye metodi raziometriche sono generalmente considerati superiori a singola lunghezza d&#39;onda o protocolli pseudo-raziometrico dual-dye, in quanto sono meno sensibili alle perturbazioni, come lo sbiancamento, concentrarsi modifiche, variazioni laser, e l&#39;etichettatura irregolare, che distorcono il segnale misurato. Questo metodo può essere facilmente modificato per misurare il pH in altri tipi di cellule fagocitiche e zymosan può essere sostituita da qualsiasi altra particella contenente ammina, da perline inerti ai microrganismi viventi. Infine, questo metodo può essere adattato a fare uso di altre sonde fluorescenti sensibili a diversi intervalli di pH o altri phagosomattività al, rendendolo un protocollo generale per l&#39;imaging funzionale di fagosomi.

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi per un esperimento in cui il pH phagosomal dei neutrofili topo primari isolati dal midollo osseo di wild-type o Hvcn1 - / - sono stati confrontati topi. Per un esperimento riuscito, è importante ottenere abbastanza fagosomi all&#39;interno del campo visivo durante tutta la durata del film accelerato, evitando troppi fagosomi, che sarà poi essere più difficile segmento durante l&#39;analisi delle immagini. La figura 1 mostra</str...

Il pH fagosomico influenza la maturazione dei fagosomi, la produzione di ossidanti, l'uccisione fagosomiale e la presentazione dell'antigene. Qui descriviamo un metodo raziometrico per misurare le variazioni di pH nel corso temporale e nel punto finale nei singoli fagosomi nei fagociti viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

L'obiettivo generale di questo insieme di esperimenti è misurare il pH fagosomale nelle cellule vive mediante microscopia fluorescente a rapporto metrico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dei fagociti, come l'identificazione di molecole chiave nelle interazioni con i patogeni o l'effetto di alterazioni genetiche o di farmaci sulla fagocitosi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, a differenza dei metodi basati su popolazioni come FACS o spettroscopia, effetti quali cambiamenti nel legame delle particelle, nella migrazione o nell'eterogeneità dei singoli fagosomi possono essere rilevati.L'implicazione di questa tecnica si estende alle nostre terapie contro gli organismi chimici patogeni, poiché molti di questi microrganismi possono alterare il pH del fragoso al fine di evitare la distruzione all'interno dei fagosomi. Per iniziare questa procedura, aggiungere 20 milligrammi di Xan essiccato a 10 millilitri di PBS sterile, vorticare e riscaldare in un bagno d'acqua in ebollizione per 10 minuti. Successivamente, raffreddare e centrifugare a 2000 G per cinque minuti.Successivamente, rimuovere il soprannatante e risospendere l'Xan in un millilitro di PBS. Sottoporre a sonicazione per 10 minuti in bagno ad ultrasuoni. Dopo la sonicazione, trasferire 500 microlitri dell'Xan risospeso in due provette da 1,5 millilitri e centrifugare a 11.000 ×g per cinque minuti.Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di PBS. Quindi lavare due volte lo Xan con 500 microlitri di soluzione di carbonato di sodio 0,1 molare appena preparata a pH 9,3 e RISOSPENDERE in 490 microlitri di soluzione di carbonato di sodio dopo l'ultimo lavaggio. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di FZ disciolto in DMSO a 10 milligrammi per millilitro allo Xan vortex.Coprire con pellicola e incubare con agitazione per quattro ore a temperatura ambiente. Per rimuovere l'occhio non legato, lavare prima con 0,5 millilitri di DMSO più 150 microlitri di PBS, inclusa la sonicazione tra i passaggi di lavaggio. Successivamente, lavare con 0,5 millilitri di DMSO più 300 microlitri di PBS, quindi con 0,5 millilitri di DMSO più 450 microlitri di PBS, seguito da PBS da solo. Dopo di ciò, aggiungere un microlitro di Xan a 500 microlitri di PBS e vortexare.Quindi aggiungere 10 microlitri di xma sand diluito sul bordo della camera dell'emocitometro, nel punto in cui si incontra con il coprioggetto. Montare l'emocitometro su un microscopio a campo chiaro dotato di un obiettivo 20x. Mettere a fuoco l'angolo superiore sinistro contenente 16 quadrati e contare tutte le particelle di xma sand in quest'area. Utilizzando un contatore manuale, ripetere la procedura nell'angolo inferiore destro.Quindi calcolare la concentrazione di Xan utilizzando questa equazione. Successivamente, opsonizzare il Xan marcato con l'anticorpo anti Xan a una diluizione di uno a 100 mediante vortex e incubare il campione per un'ora in un bagno a 37 gradi Celsius. In seguito, contare i granuli di xmas utilizzando un emocitometro, quindi diluire a 100 volte 10 alla sesta particelle per millilitro.Dopo aver isolato i neutrofili primari del topo, aggiungere due volte 10 alla quinta di neutrofili al centro di una piastra da 35 millimetri con fondo in vetro. Quindi distribuire la goccia aggiungendo 50 microlitri di mezzo e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti per consentire l'adesione delle cellule. Successivamente, aggiungere un millilitro di HBSS riscaldato a 37 gradi Celsius contenente l'inibitore della mieloperossidasi.Montare la piastra su un microscopio a fluorescenza con campo ampio, dotato di un sistema di riscaldamento a 37 gradi Celsius e di un obiettivo a immersione in olio 40x. Incubare le cellule senza acquisire immagini per 10 minuti, in modo da permettere alle cellule e all'apparecchiatura di raggiungere l'equilibrio. Successivamente, regolare le impostazioni del microscopio per acquisire un'immagine in campo chiaro con trasmissione utilizzando un'illuminazione a 440 nanometri o 490 nanometri e un'emissione a 535 nanometri ogni 30 secondi.Dopo due minuti, aggiungere 10 volte 10 alla sesta di fitzy zy sand al centro della piastra e continuare l'acquisizione di immagini per 30 minuti. Dopo 30 minuti, interrompere l'acquisizione in time-lapse e avviare un cronometro. Spostare la piastra e acquisire 10 o più immagini in diversi campi visivi per osservare altre zone vaga entro cinque minuti.In questo procedimento, scongelare le soluzioni di calibrazione e riscaldarle a 37 gradi Celsius in un bagno termico. Verificare il pH con un pHmetro e registrarne il valore. Successivamente, montare una pompa peristaltica sulla piastra di vetro prima dell'acquisizione delle immagini.Quindi eseguire la microscopia video in tempo reale al termine del periodo di acquisizione di 30 minuti. Accendere la pompa per rimuovere la soluzione dalla piastra. Successivamente, aggiungere un millilitro della prima soluzione di calibrazione e arrestare la pompa.Attendere cinque minuti fino a quando il segnale si stabilizza. Ripetere la procedura con ogni soluzione di calibrazione. Per analizzare i filmati in time-lapse e le immagini ravvicinate dei fagociti, aprire le immagini con ImageJ. Sottrarre il fondo nel canale 490 disegnando una regione di interesse (ROI) quadrata di piccole dimensioni in un'area priva di cellule.Utilizzare lo strumento di selezione poligonale quadrata e fare clic su plugin. Successivamente eseguire la sottrazione del fondo. Caricare la stessa area di interesse sul canale 440 facendo clic su modifica.Quindi selezionare, seguito dal ripristino della selezione e ripetere la procedura di sottrazione del fondo. Creare un'immagine di rapporto a 32 bit del canale 490 diviso per il canale 440 cliccando prima su elabora, quindi su calcolatore immagine.In seguito, selezionare le immagini appropriate nei menu a discesa immagine uno e immagine due. Selezionare dividi nel menu a discesa operazione e spuntare la casella di controllo risultato a 32 bit. Successivamente, modificare la tabella di codifica del colore in una codifica compatibile con i rapporti cliccando su immagine, quindi su tabelle.Quindi RGB arcobaleno. Impostare una soglia per l'immagine del rapporto per eliminare i pixel zero e infiniti facendo clic sull'immagine. Quindi regolare seguito da soglia.Regolare le barre di scorrimento in modo che la Xan appaia in rosso e fare clic su applica, assicurandosi che la casella di controllo imposta i pixel di sfondo su nan sia selezionata. Se i valori del segnale di sfondo e della Xan producono valori di rapporto molto simili, risultando in un'immagine di rapporto rumorosa, aggiungere nuovamente una piccola quantità di sfondo al canale 440 facendo clic su elabora, quindi su matematica.Quindi aggiungere, quindi ricreare l'immagine del rapporto per ottenere un risultato più pulito. In alternativa, omettere la sottrazione dello sfondo del canale 440. Successivamente, combinare questo stack di rapporti con un canale in campo chiaro in un composito multicanale facendo clic su colore dell'immagine.Quindi unire i canali. Selezionare l'immagine in campo chiaro nel menu a discesa del canale grigio e l'immagine del rapporto nel menu a discesa del canale verde. Quindi selezionare la casella di controllo per mantenere le immagini originali.In seguito, esaminare i filmati in time-lapse o le immagini fisse confrontando i canali in campo chiaro e in rapporto per determinare quali fagociti devono essere analizzati, disegnare una regione di interesse (ROI) attorno ai fagociti utilizzando lo strumento di selezione poligonale ovale e aggiungerli al gestore delle ROI facendo clic su analizza strumenti, quindi gestore ROI, seguito da aggiungi; successivamente misurare il rapporto di intensità Xan facendo clic su più misure multiple e deselezionare la casella di controllo una riga per sezione. Per i filmati in time-lapse.Tracciare le zone di FGA una alla volta disegnando un controllo di tipo ROI M per misurare ogni punto temporale e spostare l'ROI quando necessario per seguire i valori di intensità nel tempo. Successivamente, copiare le misurazioni dalla finestra dei risultati in un foglio di calcolo per convertire la fluorescenza in valori di pH. Dopo aver misurato il rapporto tra 490 e 440 per i fagosomi nei filmati in time-lapse di calibrazione in un foglio di calcolo, riportare i valori del rapporto in funzione del tempo.Quindi calcolare i valori medi dei rapporti per tutti i fagociti nel campo visivo in cinque punti temporali centrali al periodo corrispondente a ciascuna soluzione di calibrazione del pH. Riportare questi valori medi del rapporto 490 su 440 rispetto al pH effettivamente misurato, combinando almeno tre calibrazioni indipendenti in un singolo grafico. Successivamente eseguire un'analisi di regressione non lineare per ottenere un'equazione che trasformi i valori di rapporto in pH.Questa figura mostra come vengono distinti i fagosomi e gli Xan ingeriti. Il pannello a sinistra mostra un'immagine sovrapposta in campo chiaro e un rapporto Fitz zy da 490 a 440. Il pannello a destra mostra invece soltanto l'immagine in campo chiaro.I fagosomi possono essere distinti dalle particelle esterne che o non co-localizzano con le cellule o la cui fluorescenza non corrisponde a un centro scuro circondato da un anello più luminoso, caratteristico dei fagosomi nell'immagine in campo chiaro mostrata. Di seguito sono riportati i tipici andamenti temporali del pH fagosomiale in neutrofili di tipo selvaggio e in neutrofili con knockout di HV CN uno. Nei neutrofili di tipo selvaggio, il pH è neutro o leggermente alcalino nei primi punti temporali. Dopo l'ingestione, i fagosomi nei neutrofili con knockout di HV CN uno possono risultare alcalini o acidi. Le immagini acquisite da 30 a 35 minuti dopo l'aggiunta delle cellule bersaglio permettono di calcolare il pH medio della popolazione a partire da un elevato numero di fagosomi negli istogrammi dei rapporti Fitz Xan mostrati qui.Abbiamo potuto osservare le differenze nel piccolo pH tra neutrofili di tipo selvaggio e quelli con knockout di HVCN1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore. A partire dal passaggio di ottimizzazione, quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni di acquisizione delle immagini. In primo luogo, ottimizzare la concentrazione dell'anticorpo per il passaggio di ottimizzazione può essere utile anche per garantire una fagocitosi robusta seguendo questa procedura.Altri metodi, come la misurazione della produzione di Ross o la valutazione dell'uccisione batterica, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio se la quantità di Ross o la capacità del fagosoma di uccidere i batteri è alterata insieme al pH dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei fagociti per esplorare quali fattori influenzano la capacità delle cellule fagocitiche di uccidere o elaborare i materiali ingeriti per indurre ulteriori risposte immunitarie. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la microscopia fluorescente geometrica per misurare in tempo reale i parametri fisiologici dei fagosomi in cellule vive.Non dimenticare che lavorare con inibitori UNIFOR e cellule vive può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra una tecnica di microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) ad alta risoluzione per la visualizzazione in tempo reale della formazione e della chiusura dei fagosomi durante la fagocitosi mediata dai macrofagi dei globuli rossi (RBC) opsonizzati da IgG attaccati alla superficie di un piatto con fondo di vetro. I macrofagi estendono gli pseudopodi attorno ai globuli rossi e li inghiottono all'interno dei fagosomi, staccandoli dalla superficie del vetro.

Visualizzazione basata su microscopia TIRF della formazione e della chiusura dei fagosomi

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studio di fagolisosoma Biogenesis nei macrofagi in diretta

Sono disponibili diversi metodi per misurare il pH intracellulare, ma pochissimi di questi permettono la misurazione simultanea del pH citoplasmatico e organellare. Qui, descriviamo in dettaglio una metodologia rapida e accurata per misurare simultaneamente il pH citoplasmatico e vescicolare mediante imaging raziometrico di cellule viventi.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Qui presentiamo un protocollo per quantificare la fagocitosi delle particelle fluorescenti da parte di una linea cellulare di macrofagi aderenti utilizzando un metodo fluorimetrico. Questo metodo facilita una quantificazione ad alto rendimento dell'internalizzazione delle particelle e della conseguente polimerizzazione dell'actina.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

Descriviamo una configurazione sperimentale per visualizzare con un'alta risoluzione senza precedenti la formazione e la chiusura di fagosomi in tre dimensioni in macrofagi viventi, utilizzando la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale. Consente il monitoraggio della base della coppa fagocitica, degli pseudopodi estensibili e del sito preciso della scissione fagosomiale.

&quot;Phagosome chiusura Assay&quot; per visualizzare phagosome Formazione in tre dimensioni utilizzando la riflessione totale interna fluorescente Microscopy (TIRFM)

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.

Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine ​​Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine ​​nella membrana ER e nel plasma periferico.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Le malattie neurodegenerative sono associate a funzioni microglia disregolate. Questo articolo delinea un test in vitro della fagocitosi delle cellule di neuroblastoma da parte dei macrofagi iPSC. Le lettura quantitative al microscopio sono descritte sia per l'imaging time-lapse a cellule vive che per l'imaging ad alto contenuto a cellule fisse.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Qui viene presentato un protocollo per quantificare e produrre immagini dinamiche della regolazione mediata da cellule staminali mesenchimali (MSC) della fagocitosi macrofagica (MΦ) di particelle di lievito non opsonizzato (zymosan) coniugate a una molecola fluorescente sensibile al pH.

Regolazione mesenchimale delle cellule staminali della fagocitosi dei macrofagi; Quantificazione e imaging

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

Impara a misurare il pH dei fagosomi nelle cellule fagocitarie vive mediante microscopia a fluorescenza raziometrica. Questa tecnica consente il monitoraggio in tempo reale delle variazioni di pH durante la maturazione fagosomiale.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

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