Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa serie di esperimenti è misurare il pH facosomiale nelle cellule viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza metrica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei fagociti, come l'identificazione di molecole chiave nelle interazioni tra patogeni o l'effetto della distruzione genetica o dei farmaci sulla fagocitosi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, a differenza dei metodi basati sulla popolazione, come i fatti o gli effetti spettroscopici, come i cambiamenti nella migrazione del legame delle particelle o nell'eterogeneità dei singoli fagosomi possono essere rilevati.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle nostre terapie contro gli organismi chimici patogeni perché molti di questi microrganismi possono alterare il pH dei fragosi per evitare distrazioni all'interno dei fagosomi. Per iniziare questa procedura, aggiungere 20 milligrammi di Xan essiccato a 10 millilitri di vortice PBS sterile e scaldare a bagnomaria bollente per 10 minuti. Quindi raffreddare e centrifugare a 2000 G per cinque minuti.

Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere lo Xan in un millilitro di PBS. Sonicare per 10 minuti a bagnomaria. Sonicare, quindi trasferire 500 microlitri di Xan risospeso in due provette da 1,5 millilitri e centrifugarle a 11.000 Gs per cinque minuti.

Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di PBS. Quindi lavare lo Xan due volte in 500 microlitri di soluzione di carbonato di sodio 0,1 molare appena preparata a pH 9,3 e RISOSPESO in 490 microlitri di soluzione di carbonato di sodio dopo il lavaggio finale. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di FZ disciolti in DMSO a 10 milligrammi per millilitro al vortice Xan.

Coprire con un foglio e incubare agitando per quattro ore a temperatura ambiente Per rimuovere l'occhio non legato, lavare prima con 0,5 millilitri di DMSO più 150 microlitri di PBS, compresa la sonicazione tra le fasi di lavaggio. Successivamente lavare con 0,5 millilitri di DMSO più 300 microlitri di PBS, quindi lavare con 0,5 millilitri di DMSO più 450 microlitri di PBS seguito dal solo PBS. Successivamente, aggiungi un microlitro di Xan a 500 microlitri di PBS e vortex.

Quindi aggiungere 10 microlitri di sabbia xma diluita sul bordo della camera dell'emocitometro dove incontra il vetrino coprioggetti Montare l'emocitometro su un microscopio a campo chiaro dotato di un obiettivo 20x. Concentrati sull'angolo in alto a sinistra contenente 16 quadrati e conta tutte le particelle di sabbia natalizia in quest'area. Utilizzando un contatori manuali, ripetere la procedura nell'angolo in basso a destra.

Quindi calcola la concentrazione di Xan usando questa equazione. Successivamente, opsonizzare lo Xan marcato con l'anticorpo rabbioso anti Xan in un vortice di diluizione da uno a 100 e incubare il campione per un'ora in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Successivamente contare la sabbia di Natale utilizzando un emocitometro poi diluito a 100 volte da 10 alla sesta particella per millilitro.

Dopo aver isolato i neutrofili primari di topo, aggiungere due volte 10 al quinto dei neutrofili al centro di un piatto di vetro da 35 millimetri. Quindi stendere la goccia aggiungendo 50 microlitri di terreno e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti per consentire alle cellule di aderire. Successivamente, aggiungere un millilitro di HBSS caldo a 37 gradi Celsius contenente inibitore della mielo perossidasi.

Monta la parabola su un microscopio a fluorescenza ad ampio campo, dotato di un sistema di riscaldamento a 37 gradi Celsius e di un obiettivo a olio 40x. Incubare le cellule senza imaging per 10 minuti per consentire alle cellule e all'attrezzatura di equilibrarsi. Quindi, regolare le impostazioni del microscopio per acquisire un'immagine di trasmissione in campo chiaro con eccitazione di 440 nanometri o 490 nanometri ed emissione di 535 nanometri ogni 30 secondi.

Dopo due minuti, aggiungere 10 volte 10 alla sabbia fitzy zy sei al centro del piatto e continuare l'imaging per 30 minuti. Dopo 30 minuti, interrompere l'acquisizione time-lapse e avviare un timer. Sposta il palco e cattura 10 o più istantanee in diversi campi visivi per riprendere altre zone vaghe in cinque minuti.

In questa procedura, scongelare le soluzioni di calibrazione e riscaldarle a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Controllare il pH con un pHmetro e registrarlo. Quindi montare una pompa peristaltica sul piatto inferiore in vetro prima dell'acquisizione dell'immagine.

Quindi eseguire la microscopia video dal vivo al termine del periodo di acquisizione di 30 minuti. Accendere la pompa per rimuovere la soluzione nel piatto. Successivamente, aggiungere un millilitro della prima soluzione di calibrazione e arrestare la pompa.

Attendere cinque minuti fino a quando il segnale si stabilizza. Ripetere la procedura con ogni soluzione di calibrazione. Per analizzare i filmati time-lapse e le istantanee fagosomiche, aprire le immagini con l'immagine J.Sottrarre lo sfondo nel canale 490 disegnando un piccolo ROI quadrato in un'area senza celle.

Utilizzando lo strumento di selezione del poligono quadrato e facendo clic sui plug-in. Poi sottrazione BG in seguito. Carica lo stesso ROI sul canale 440 facendo clic su modifica.

Quindi la selezione seguita dal ripristino della selezione e ripetere la procedura di sottrazione dello sfondo. Crea un'immagine con rapporto a 32 bit del canale 490 diviso per il canale 440 con il primo processo di clic. Quindi calcolatrice di immagini.

Successivamente, seleziona le immagini appropriate nei menu a discesa dell'immagine uno e dell'immagine due. Seleziona Dividi nel menu a discesa dell'operazione e seleziona la casella di controllo del risultato a 32 bit. Successivamente, modifica la tabella di ricerca della codifica dei colori in una codifica dei colori compatibile con il rapporto facendo clic sull'immagine, quindi sulle tabelle.

Poi l'arcobaleno RGB. Imposta una soglia per il rapporto immagine per eliminare zero e infinity pixel facendo clic sull'immagine. Quindi regolare seguito dalla soglia.

Regola le barre di scorrimento in modo che lo Xan appaia in rosso e fai clic su Applica, quindi assicurati che la casella di controllo imposta pixel di sfondo su nan sia selezionata. Se i valori del segnale di sfondo e Xan producono valori di rapporto molto simili risultando in un'immagine con rapporto disturbato, aggiungere nuovamente una piccola quantità di sfondo al canale 440 facendo clic su Processo. Poi la matematica.

Quindi aggiungere, quindi rifare l'immagine del rapporto per ottenere un risultato più pulito. In alternativa, ometti la sottrazione di sfondo a 440 canali. Quindi, combina questo stack di rapporti con un canale di campo chiaro in un composito multicanale facendo clic sul colore dell'immagine.

Quindi unisci i canali. Seleziona l'immagine in campo chiaro nel menu a discesa del canale grigio e l'immagine del rapporto nel menu a discesa del canale verde. Quindi seleziona la casella di controllo Mantieni immagini sorgente.

Successivamente, scansiona i filmati time-lapse o le istantanee confrontando i canali del campo chiaro e del rapporto per determinare quali fagosomi devono essere analizzati, disegna un ROI attorno ai fagosomi utilizzando lo strumento di selezione del poligono ovale e aggiungili al gestore ROI facendo clic su strumenti di analisi. Quindi ROI manager, seguito da aggiungi e successivamente misura il loro rapporto di intensità Xan facendo clic su più misure multiple e deseleziona la casella di controllo di una riga per fetta. Per filmati time-lapse.

Traccia le zone FGA una alla volta disegnando un controllo di tipo ROI M per misurare ogni punto temporale e spostare la ROI quando necessario per tenere traccia dei valori di intensità nel tempo. Quindi copiare le misurazioni dalla finestra dei risultati in un foglio di calcolo per convertire la fluorescenza in valori di pH. Dopo aver misurato il rapporto da 490 a 440 per i fagosomi nei filmati time-lapse di calibrazione in un foglio di calcolo, tracciare i valori del rapporto nel tempo.

Quindi calcolare i valori medi del rapporto per tutti i fagosomi all'interno del campo visivo in cinque punti temporali entro la metà del periodo di tempo corrispondente a ciascuna soluzione di calibrazione del pH. Tracciate questi valori medi di rapporto da 490 a 440 rispetto al pH effettivamente misurato combinando almeno tre calibrazioni indipendenti in un unico grafico. Quindi eseguire un'analisi di regressione non lineare per ottenere un'equazione per trasformare i valori del rapporto in pH.

Questa figura mostra come si distinguono i fagosomi e lo Xan ingerito. Il pannello di sinistra mostra un'immagine in campo chiaro unita e un rapporto Fitz zy da 490 a 440. Mentre il pannello di destra mostra solo l'immagine in campo chiaro.

I fagosomi possono essere distinti dalle particelle esterne che non co-localizzano con le cellule o la cui fluorescenza non corrisponde a un centro scuro circondato da un anello più luminoso caratteristico dei fagosomi nell'immagine in campo chiaro mostrata. Ecco i corsi temporali tipici del pH omale FGA dei neutrofili wild type e HV CN one knockout nei neutrofili wild type, il pH neutro neutro o leggermente alcalino durante i primi punti temporali Dopo l'ingestione, i fagosomi dei neutrofili HV CN one knockout possono essere alcalini o acidi. Le istantanee scattate da 30 a 35 minuti dopo l'aggiunta dei bersagli consentono di calcolare il pH medio della popolazione da un gran numero di fagosomi negli istogrammi dei rapporti di Fitz Xan mostrati qui.

Abbiamo potuto vedere le differenze di pH piccolo tra neutrofili wild type e HVCN one knockout Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sei ore. A partire dalla fase di ottimizzazione durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare le condizioni di imaging. In primo luogo, l'ottimizzazione della concentrazione di anticorpi per la fase di ottimizzazione può anche essere utile per garantire una fagocitosi robusta Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come la misurazione della produzione di Ross o l'uccisione batterica, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se il Ross piccolo o la capacità del fagosoma di uccidere i batteri sono alterati insieme al pH dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei fagociti per esplorare quali fattori influenzano la capacità delle cellule fagocitiche di uccidere o elaborare i materiali ingeriti per suscitare ulteriori risposte immunitarie. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la microscopia a fluorescenza geometrica per misurare i parametri fisiologici dei fagosomi in tempo reale nelle cellule viventi.

Non dimenticare che lavorare con gli inibitori UNIFOR e le cellule viventi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti.