Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico
5 aprile 2017
Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.
L'obiettivo generale di questa tecnica di microscopia confocale è quello di ottenere immagini del pH e dell'area della vacuolo fagocitico e del citoplasma dei neutrofili. Questo metodo consente il monitoraggio e la quantificazione dei cambiamenti dinamici del pH all'interno del vacuolo fagocitico e del citoplasma, nonché del volume del vacuolo fagocitico. Queste misurazioni variano in base all'attività della NADPH ossidasi e possono essere utilizzate come marcatori indiretti della sua funzione e dei flussi ionici attraverso la membrana del vacuolo fagocitico.
Il principale vantaggio di questa tecnica è che sia il fagosoma che il citoplasma possono essere contemporaneamente visualizzati con un colorante che ha un ampio intervallo di pH. Per iniziare questa procedura, preparare un'aliquote di carbossi-S-1 estere succinimidilico diluendo 50 microgrammi di esso in 100 microlitri di DMSO di alta purezza. Vortexare accuratamente per mescolare.
Successivamente, preparare un millilitro di Candida uccisa dal calore (HK) a una concentrazione di uno per dieci alla ottava in bicarbonato di sodio 0,1 molare in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di carbossi-S-1, una goccia alla volta, alla Candida HK mescolando contemporaneamente con un vortex a 2.000 giri al minuto. Dopo questa operazione, avvolgere il tubo con carta d'alluminio e posizionarlo su un rullo a temperatura ambiente per un'ora.
Dopo un'ora, lavare le HKC-S-1 tre volte mediante centrifugazione a 2.250 ×g per 10 minuti ogni volta. Per i primi due lavaggi, risospendere il pellet in 15 millilitri di bicarbonato di sodio 0,1 M. Dopo il terzo lavaggio, risospendere il pellet in un millilitro di tampone BSS.
Trasferire la sospensione di HKC-S-1 in provette da 100 microlitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Per opsonizzare HKC-S-1 per neutrofili umani, aggiungere 100 microlitri di siero umano IGG a 100 microlitri di HKC-S-1 scongelato. Mescolare in uno shaker a caldo a 37 gradi Celsius e 1.100 giri al minuto per 60-90 minuti, quindi su un rullo a quattro gradi Celsius per due ore.
Successivamente, lavare il campione tre volte in tampone BSS mediante centrifugazione a 17.000 × g per un minuto ciascuna. In seguito, risospendere il campione in 100 microlitri di tampone BSS. Per i neutrofili del sangue periferico umano, prelevare 15 millilitri di sangue mediante puntura venosa da un donatore sano e trasferirli in una siringa da 20 millilitri contenente 90 microlitri di soluzione di sodio eparina a 1.000 UI per millilitro.
Utilizzando una punta pipetta, iniettare 1,5 millilitri di soluzione di destano al 10% nella siringa. Capovolgerla delicatamente tre volte e quindi lasciarla in posizione eretta sul banco per 30-60 minuti. Dopo 30-60 minuti, il sangue dovrebbe dividersi approssimativamente a metà, con uno strato superiore di colore giallo paglierino costituito dal buffy coat e uno strato inferiore contenente gli eritrociti.
Spingere delicatamente lo strato superiore attraverso un ago o rimuoverlo con la punta di una pipetta, quindi trasferirlo in un tubo da 15 millilitri evitando di prelevare lo strato rosso. Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, aggiungere tre-quattro millilitri di mezzo di gradiente di densità nella parte inferiore del tubo, al di sotto dello strato del buffy coat, in modo da ottenere due strati distinti. Successivamente, centrifugare il campione a 900 ×g per 10 minuti.
Versare il soprannatante e lasciare il pellet rosso. Successivamente, vortexare delicatamente per disperdere il pellet. Poi, aggiungere sette millilitri di acqua distillata e sterilizzata con autoclave al pellet e capovolgere per 20 secondi per risospendere il pellet.
In seguito, aggiungere sette millilitri di soluzione salina 2x e capovolgere alcune volte per mescolare, lisando i globuli rossi rimanenti, quindi centrifugare il campione a 300 ×g per cinque minuti. Versare il soprannatante e risospendere il pellet nel buffer BSS a circa quattro volte 10 alla sesta per millilitro. In questo procedimento, pretrattare una piastra da microscopia a otto pozzetti con 200 microlitri di poli-L-lisina in ciascun pozzetto per 40-60 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la poli-L-lisina e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di acqua distillata.
Successivamente, aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare preparata in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Dopodiché, preparare un'aliquote di estere S-1-AM aggiungendo 100 microlitri di DMSO di alta purezza in un tubo e miscelare mediante vortex. In un tubo piccolo, aggiungere 1,7 millilitri di tampone BSS e 20 microlitri di S-1-AM e miscelare la soluzione mediante vortex.
In seguito, lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di tampone BSS e sostituire il tampone con la soluzione S-1-AM. Avere cura di non disturbare il monostrato cellulare aderente al fondo del pozzetto, pipettando delicatamente il liquido lungo la parete dei pozzetti. Successivamente, incubare il campione a temperatura ambiente per almeno 25 minuti.
In seguito, lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di buffer BSS. Per testare un inibitore, preparare una miscela madre del farmaco appropriato in buffer BSS e lavare i pozzetti due volte con questa soluzione. Successivamente, sottoporre a sonicazione l'HKC-S-1 opsonizzato per circa tre secondi a cinque micron e aggiungere 10 microlitri del campione a ciascun pozzetto; quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti, rendendo le cellule pronte per l'acquisizione di immagini relative a istantanee della fagocitosi.
Utilizzando un microscopio confocale, regolare la lunghezza d'onda del laser in modo che le cellule vengano eccitate a 555 nanometri e l'emissione venga rilevata da due rivelatori tra 560 e 600 nanometri e oltre 610 nanometri. Successivamente, osservare le cellule utilizzando un obiettivo ad immersione in olio da 63X. Utilizzare un'immagine di scansione a tasselli in modalità continua per visualizzare il tassello centrale.
Utilizzando l'intensità della fluorescenza e il guadagno dei canali del rivelatore, regolare la messa a fuoco e l'intensità del laser e il guadagno dei due canali per ottimizzare l'immagine. Successivamente, dividere l'immagine utilizzando le impostazioni per visualizzare entrambi i canali. Prima dell'inizio dell'esperimento, verificare che non vi sia saturazione dell'intensità della fluorescenza nel citoplasma o nelle vacuole, che si presenterebbe come puntini rossi.
Se così fosse, ridurre l'intensità del laser in modo da ottenere un numero minimo di puntini rossi, ma garantendo che le cellule e i fagosomi siano abbastanza luminosi e nitidi da essere visibili. In questa procedura, aprire ImageJ e caricare il file dell'immagine scelto per l'analisi sulla barra degli strumenti. Per combinare i due canali, utilizzare Immagine, Colore, quindi Crea Composita.
Fare clic con il tasto destro per scegliere un file in cui salvare i risultati. Successivamente, fare clic sullo strumento Linea nella barra degli strumenti e fare doppio clic per aumentare la larghezza a due. Tracciare una linea lungo la larghezza di un fagosoma, quindi fare clic con il tasto destro per misurare il pH.
Il pH citoplasmatico può essere misurato nello stesso modo tracciando una linea attraverso il citoplasma. Al termine delle misurazioni, fare clic con il tasto destro per scegliere Salva file. Per misurare l'area del fagocita, utilizzare l'icona quarta lungo la barra degli strumenti per disegnare a mano libera attorno all'area.
Successivamente, fare clic con il tasto destro per selezionare Misura Area. Di seguito è riportata una chiave visiva qualitativa del colore approssimativo dei fagosome colorati con S-1 corrispondente al pH. Il colore giallo indica un ambiente più acido, mentre il rosso indica un ambiente più alcalino.
Questa immagine mostra neutrofili del midollo osseo di topo privi del canale Hvcn1, 20 minuti dopo la fagocitosi. I fagosomi appaiono molto rossi, alcalini e gonfi. La freccia rossa indica un'entità intracellulare di Candida, mentre questa freccia indica un'entità extracellulare di Candida.
Questa immagine mostra neutrofili del midollo osseo di topo di tipo selvatico che hanno ingerito Candida. Sono molto meno alcalini rispetto ai neutrofili knockout per Hvcn1. Questa immagine mostra neutrofili del sangue periferico umano nello stesso momento successivo alla fagocitosi.
Appaiono leggermente più alcalini rispetto alle cellule di tipo selvaggio del topo, ma i fagosomi non sono ancora ampi e rossi come nelle cellule con knockout di Hvcn1, e questa immagine mostra neutrofili umani che hanno fagocitato Candida in presenza di cinque micromoli di difenilene iodio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro-cinque ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prestare attenzione durante l'isolamento dei neutrofili in modo che non vengano attivati.
Per determinare se gli effetti osservati su variazioni del pH vacuolare o citosolico o sul volume vacuolare sono dovuti a cambiamenti nel burst respiratorio, questo burst respiratorio può essere misurato mediante altri metodi che misurano direttamente la produzione di radicali liberi o il consumo di ossigeno. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i neutrofili umani, quindi colorare e visualizzare il fagosoma e il citoplasma. Non dimenticare che lavorare con campioni di sangue umano può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di guanti e abbigliamento protettivo devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo manoscritto descrive un metodo per misurare il pH e l'area del fagosoma, nonché il pH citoplasmatico di neutrofili umani e murini, utilizzando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF)-1. La tecnica impiega la microscopia confocale a fluorescenza su cellule vive e l'analisi delle immagini per monitorare i cambiamenti dinamici di pH e volume della vacuolo fagocitico.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Immunologia
Sfondo
- Comprendere la funzione dei neutrofili è fondamentale per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie.
- La fagocitosi comporta cambiamenti dinamici del pH e del volume delle vacuole.
- SNARF-1 è un colorante sensibile al pH adatto all'immagine in tempo reale su cellule vive.
- La microscopia confocale consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione dei processi cellulari.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per misurare il pH nei neutrofili.
- Valutare la relazione tra le variazioni di pH e l'attività della NADPH ossidasi.
- Fornire uno strumento per lo studio dei flussi ionici attraverso le membrane dei vacuoli fagocitici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del carbossi-S-1 estere succinimidilico per la misurazione del pH.
- Opsonizzazione di Candida uccisa termicamente per l'interazione con i neutrofili.
- Isolamento di neutrofili umani dal sangue periferico.
- Acquisizione di immagini di cellule vive mediante microscopia confocale per catturare la fagocitosi.
Risultati principali
- Misurazione riuscita del pH fagosomiale e citoplasmatico nei neutrofili.
- Dimostrata correlazione tra variazioni di pH e attività della NADPH ossidasi.
- Forniti spunti sulle dinamiche della fagocitosi.
- Convalidato l'uso di SNARF-1 per l'immagine simultanea del pH in diversi compartimenti cellulari.
Conclusioni
- Questo metodo offre uno strumento prezioso per lo studio della funzione dei neutrofili.
- Migliora la comprensione delle risposte immunitarie a livello cellulare.
- Applicazioni future potrebbero includere l'indagine di altri tipi di cellule immunitarie.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale della dinamica del pH fagosomiale nei neutrofili, fornendo un'analisi quantitativa dell'attività della NADPH ossidasi e del flusso ionico attraverso le membrane fagosomiali. Queste misurazioni rappresentano biomarcatori funzionali per valutare le risposte delle cellule immunitarie innate in modelli preclinici di immunologia e di malattie infettive. L'indicatore raziometrico di pH S-1 permette l'acquisizione simultanea di immagini del fagosoma e del citoplasma, supportando l'analisi meccanicistica e la riduzione dei rischi legati a composti immunomodulanti, collegando l'attività del burst respiratorio alla maturazione fagosomiale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'alcalinizzazione fagosomiale dipendente dalla NADPH ossidasi come parametro funzionale per la validazione di bersagli in vie mediate dai neutrofili.
- Valore operativo: Fornisce un saggio di imaging su cellule vive per correlare la modulazione genetica o farmacologica dei canali ionici con variazioni del pH fagosomiale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di pH e volumetriche che consentono lo screening ad alto contenuto di composti che influenzano la maturazione del fagosoma.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione del saggio mediante rilevamento raziometrico a doppia emissione, riducendo gli artefatti dovuti alla variabilità della concentrazione del colorante o dell'eccitazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la modellizzazione di sistemi pertinenti alle malattie mediante il confronto della dinamica del pH fagosomale tra neutrofili umani e murini in condizioni controllate.
- Valore operativo: Consente il monitoraggio longitudinale dei cambiamenti di dimensione e forma del fagosoma, supportando la previsione dell'efficacia negli studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta come saggio funzionale per la valutazione dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso in programmi di immunologia centrati sui neutrofili.
- Biologia della scoperta Supporta il test di ipotesi sui regolatori fagosomiali collegando l'attività della NADPH ossidasi a variazioni misurabili di pH e volume.
- Screening: Fornisce output quantitativi e riproducibili per campagne di screening di composti mirate alla maturazione del fagosoma o al flusso ionico.
- Analitica: Fornisce misurazioni di fluorescenza raziometriche che consentono la normalizzazione e il confronto tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale Collega i fenotipi neutrofili in vitro a modelli preclinici attraverso risposte conservate del pH fagosomale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per gruppi di immunologia e malattie infettive che studiano i meccanismi effettori innati.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nei confronti del bersaglio fornendo informazioni meccanicistiche sulla regolazione del fagosoma e sul collegamento al burst respiratorio.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio mediante la rilevazione ratiometrica del pH e protocolli standardizzati di isolamento dei neutrofili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo riducendo l'ambiguità meccanicistica nella selezione di immunomodulatori.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base a profili di attività neutrofila funzionale, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento dei neutrofili, nella microscopia confocale su cellule vive e nell'analisi del rapporto di fluorescenza.
- È subordinato all'accesso a sistemi di microscopia confocale dotati di rilevamento a doppio canale e di eccitazione laser appropriata.
- Necessita di standardizzazione tra laboratori per le procedure di preparazione dei neutrofili, opsonizzazione e carico del colorante.
- Comporta considerazioni di adattamento quando il metodo viene esteso a fagociti non neutrofili o a modelli patogeni alternativi.
- Comprende limitazioni pratiche, come l'attivazione dei neutrofili durante l'isolamento e la necessità di manipolare con attenzione campioni di sangue umano.
