Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.

L'obiettivo generale di questa tecnica di microscopia confocale è quello di visualizzare il pH e l'area del vacuolo fagocitico neutrofilo e del citoplasma. Questo metodo consente il monitoraggio e la quantificazione delle variazioni dinamiche del pH nel vacuolo fagocitico e nel citoplasma, nonché del volume del vacuolo fagocitico. Queste misure cambiano con l'attività della NADPH ossidasi e possono essere utilizzate come marcatori surrogati della sua funzione e dei flussi ionici attraverso la membrana del vacuolo fagocitico.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che sia il fagosoma che il citoplasma possono essere visualizzati contemporaneamente con un colorante che ha un ampio intervallo di pH. Per iniziare questa procedura, preparare un'aliquota di estere carbossi-S-1 succinimidil diluendo 50 microgrammi di esso in 100 microlitri di DMSO di alta qualità. Agitare bene per mescolare.

Successivamente, preparare un millilitro di uno per 10 all'ottavo calore ucciso o HK Candida in bicarbonato di sodio molare 0,1 in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di carbossi-S-1 una goccia alla volta all'HK Candida mentre si mescola su un vortice a 2.000 giri/min. Dopodiché, avvolgere il tubo con un foglio di alluminio e posizionarlo su un rullo a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo un'ora, lavare l'HKC-S-1 tre volte per centrifugazione a 2, 250 volte g per 10 minuti ogni volta. Per i primi due lavaggi, risospendere il pellet in 15 millilitri di bicarbonato di sodio 0,1 molare. Dopo il terzo lavaggio, risospenderlo in un millilitro di tampone BSS.

Trasferire la sospensione HKC-S-1 nei tubi di aliquote da 100 microlitri e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Per opsonizzare HKC-S-1 per i neutrofili umani, aggiungere 100 microlitri di siero IGG umano a 100 microlitri di HKC-S-1 scongelato. Mescolalo su uno shaker a 37 gradi Celsius e 1, 1000 giri/min per 60-90 minuti, e poi su un rullo, a quattro gradi Celsius per due ore.

Successivamente, lavare il campione tre volte in tampone BSS mediante centrifugazione a 17.000 volte g per un minuto ciascuna. Successivamente, risospendere il campione in 100 microlitri di tampone BSS. Per i neutrofili del sangue periferico umano, prelevare 15 millilitri di sangue mediante venipuntura da un donatore sano e trasferirli in una siringa da 20 millilitri contenente 90 microlitri di soluzione di eparina sodica a 1.000 UI per millilitro.

Utilizzando la punta di una pipetta, iniettare 1,5 millilitri di soluzione di destrano al 10% nella siringa. Capovolgerlo delicatamente tre volte e poi lasciarlo in posizione verticale sulla panca per 30-60 minuti. Dopo 30-60 minuti, il sangue dovrebbe dividersi approssimativamente a metà, con uno strato superiore di buffy coat color paglierino e uno strato inferiore contenente eritrociti.

Spingere con cautela lo strato superiore attraverso un ago o rimuoverlo con la punta di una pipetta, quindi trasferirlo in una provetta da 15 millilitri ed evitare di rimuovere lo strato rosso. Utilizzando una pipetta da cinque millilitri, aggiungere da tre a quattro millilitri di terreno di gradiente di densità sul fondo della provetta, sotto lo strato di buffy coat, per ottenere due strati distinti. Successivamente, centrifugare il campione a 900 volte g per 10 minuti.

Versare il surnatante e lasciare il pellet rosso. Successivamente, vorticare delicatamente per disturbare il pellet. Quindi, aggiungere sette millilitri di acqua distillata autoclavata al pellet e capovolgerlo per 20 secondi per risospendere il pellet.

Successivamente, aggiungere sette millilitri di soluzione fisiologica 2x e capovolgerlo alcune volte per mescolare, lisare i globuli rossi rimanenti, quindi centrifugare il campione a 300 volte g per cinque minuti. Versare il surnatante e risospendere il pellet in tampone BSS a circa quattro volte da 10 al sesto per millilitro. In questa procedura, pretrattare una piastra per microscopia a otto pozzetti con 200 microlitri di poli-L-lisina in ciascun pozzetto per 40-60 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere la poli-L-lisina e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di acqua distillata.

Quindi, aggiungere 200 microlitri della sospensione cellulare preparata a ciascun pozzetto e incubarla a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Successivamente, preparare un'aliquota di estere S-1-AM aggiungendo 100 microlitri di DMSO di alta qualità a un tubo e vortice per mescolare. In un tubicino, aggiungere 1,7 millilitri di tampone BSS e 20 microlitri di S-1-AM e agitare la miscela.

Successivamente, lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di tampone BSS e sostituire il tampone con la soluzione S-1-AM. Fare attenzione a non disturbare il monostrato di cellule attaccato al fondo del pozzetto pipettando delicatamente il liquido lungo la parete dei pozzetti. Successivamente, incubare il campione a temperatura ambiente per almeno 25 minuti.

Successivamente, lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di tampone BSS. Per testare un inibitore, preparare una miscela master del farmaco appropriato nel tampone BSS e lavare i pozzetti due volte con esso. Successivamente, sonicare l'HKC-S-1 opsonizzato per circa tre secondi a cinque micron e aggiungerne 10 microlitri a ciascun pozzetto, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15-20 minuti, rendendo le cellule pronte per essere visualizzate per le istantanee della fagocitosi.

Utilizzando un microscopio confocale, regolare la lunghezza d'onda del laser in modo che le cellule siano eccitate a 555 nanometri e l'emissione venga rilevata da due rivelatori da 560 a 600 nanometri e oltre 610 nanometri. Quindi, visualizza le celle utilizzando una lente a immersione in olio 63X. Utilizzare un'immagine di scansione delle tessere con l'impostazione continua per visualizzare la tessera centrale.

Utilizzando l'intensità della fluorescenza e il guadagno dei canali del rivelatore, regolare la messa a fuoco e l'intensità del laser e il guadagno dei due canali per ottimizzare l'immagine. Successivamente, dividi l'immagine utilizzando le impostazioni per visualizzare entrambi i canali. Prima dell'inizio dell'esperimento, verificare che non vi sia saturazione dell'intensità della fluorescenza nel citoplasma o nei vacuoli, che apparirebbero come punti rossi.

In tal caso, ridurre l'intensità del laser in modo che ci sia un numero minimo di punti rossi, ma le cellule e i fagosomi siano abbastanza luminosi e chiari da poter essere visti. In questa procedura, aprire ImageJ e caricare il file di immagine scelto per l'analisi sulla barra degli strumenti. Per combinare i due canali, utilizzare Immagine, Colore, quindi Crea composito.

Fare clic con il pulsante destro del mouse per scegliere un file in cui memorizzare i risultati. Quindi, fai clic sullo strumento Linea sulla barra degli strumenti e fai doppio clic per aumentare la larghezza a due. Disegna una linea lungo la larghezza di un fagosoma, quindi fai clic con il pulsante destro del mouse per misurare il pH.

Il pH citoplasmatico può essere misurato allo stesso modo tracciando una linea attraverso il citoplasma. Dopo aver terminato le misurazioni, fare clic con il pulsante destro del mouse per scegliere Salva file. Per misurare l'area del fagosoma, utilizzare la quarta icona lungo la barra degli strumenti per disegnare a mano libera intorno all'area.

Successivamente, fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Misura area. Ecco una chiave visiva qualitativa del colore approssimativo dei fagosomi colorati con S-1 corrispondente al pH. Il colore giallo indica più acidità mentre il rosso indica più alcalinità.

Questa immagine mostra neutrofili del midollo legati al topo privi del canale Hvcn1 20 minuti dopo la fagocitosi. I fagosomi appaiono molto rossi, alcalini e gonfi. La freccia rossa qui indica una Candida intracellulare, mentre questa freccia indica una Candida extracellulare.

Questa immagine mostra neutrofili di midollo osseo di topo selvatico che hanno ingerito Candida. Sono molto meno alcalini dei neutrofili knockout per Hvcn1. Questa immagine mostra i neutrofili del sangue periferico umano nello stesso momento dopo la fagocitosi.

Sembrano leggermente più alcalini delle cellule wild type di topo, ma i fagosomi non sono ancora grandi e rossi come le cellule knockout per Hvcn1, e questa immagine mostra neutrofili umani che hanno fagocitato la Candida in presenza di cinque micromolari di difenilene iodonio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro o cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di fare attenzione quando si isolano i neutrofili in modo che non vengano attivati.

Al fine di determinare se gli effetti che si vedono sulle variazioni del pH vacuolare o citosolico o del volume vacuolare sono dovuti a variazioni dello scoppio respiratorio, questo scoppio respiratorio può essere misurato in altri modi che misurano direttamente la produzione di radicali liberi o il consumo di ossigeno. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i neutrofili umani, quindi colorare e visualizzare il fagosoma e il citoplasma. Non dimenticare che lavorare con campioni di sangue umano può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e indumenti protettivi.