In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

L'obiettivo generale di questo procedimento è osservare il movimento di proteine marcate con fluorescenza sulle superfici delle cellule vegetali mediante microscopia a fluorescenza epiluminescente con angolo variabile. Questo metodo può aiutarci a fare progressi nel campo della biologia cellulare vegetale, ad esempio comprendendo come le proteine agiscono sulle superfici delle cellule vegetali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di visualizzare in tempo reale la dinamica delle proteine marcate con fluorescenza prima di iniziare il procedimento.

Calibrare il centraggio e la messa a fuoco del laser del microscopio secondo le istruzioni del produttore. Successivamente, utilizzare un percorso ottico libero dell'obiettivo per individuare il centro del soffitto della stanza del microscopio e segnare la posizione con un sigillo colorato. Quindi, illuminare il soffitto con l'obiettivo e spostare la zona illuminata nella posizione centrale.

Quindi focalizzare il laser e regolare con precisione la posizione del laser al centro del soffitto. La centratura e la messa a fuoco del laser sono molto importanti per un'osservazione riuscita con microscopio epi scent a angolo variabile (VAEM). Gli utenti dovrebbero essere formati da un tecnico professionista della società produttrice del microscopio prima di iniziare un esperimento.

Quando il microscopio è pronto, dispensare 30 microlitri di tampone basale al centro di un vetrino in vetro di 76 per 26 millimetri. Successivamente, utilizzare forbici da dissezione per rimuovere un coledone da una piantina di sette giorni e far galleggiare il coledone con il lato di osservazione rivolto verso l'alto sulla goccia di tampone basale. Quindi, aggiungere 30 microlitri di tampone basale al centro di un vetrino quadrato di 18 per 18 millimetri.

Coprire con il vetrino e capovolgerlo. La tensione superficiale impedirà delicatamente alla goccia di cadere; tenere il vetrino con una pinzetta su un bordo. Appoggiare il bordo opposto sul vetrino da microscopia in modo che il tampone si trovi sopra l'ingresso del collimatore.

Quindi, mantenendo il bordo del vetrino coprioggetto appoggiato sul vetrino portaoggetto, regolare la posizione della goccia in modo che si trovi direttamente sopra il campione di oleina e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetto. Se non sono presenti bolle d'aria, utilizzare tessuti privi di lanugine per asciugare il buffer in eccesso e trasferire immediatamente il preparato sul microscopio.

Utilizzando l'illuminazione in campo chiaro, selezionare le cellule da osservare. Successivamente, verificare che la proteina fluorescente possa essere osservata e utilizzare l'illuminazione in epifluorescenza per impostare la posizione dell'asse Z sulla superficie della cellula. Per eseguire la VAEM, utilizzare il box di controllo per inclinare l'angolo di ingresso del fascio laser.

Gradualmente, monitorando attentamente l'immagine in tempo reale. Inizialmente, l'immagine apparirà sfocata. Aumentando l'angolo del laser, l'immagine VAEM diventerà meno sfocata, producendo alla fine un'immagine nitida.

A questo punto, interrompere l'aumento dell'angolo del laser. Ora va bene. Regolare finemente l'angolo di ingresso del laser per ottenere un'immagine migliore, aggiustando i parametri ottici e del sensore di immagine secondo necessità.

Quindi, utilizzando il software commerciale del microscopio, acquisire un filmato come file immagine TIFF multipagina. In questo caso, il filmato mostra puntini marcati con GFP che lampeggiano sulla superficie di cellule modello STA. Per quantificare il tempo di permanenza dei puntini marcati con GFP utilizzando Fiji, andare al menu apri file e aprire il file TIFF multipagina acquisito.

Utilizzare lo strumento di selezione della linea retta per posizionare una linea sul lato di interesse. Successivamente, utilizzare il plugin dinamico di sezione delle serie di immagini per generare un'immagine del grafico. Al variare della linea, l'immagine del grafico verrà aggiornata dinamicamente.

Salvare l'immagine come file TIFF tramite il menu salva come TIFF. Successivamente, per eseguire una riduzione del rumore, andare al menu filtri di elaborazione sfocatura gaussiana ed applicare un filtro gaussiano alle immagini cronografiche. Il parametro del raggio sigma deve essere regolato secondo necessità.

Utilizzando lo strumento di regolazione della soglia dell'immagine, segmentare le regioni del segnale mediante sogliatura ed aprire il menu Analizza impostazione misure. Successivamente, selezionare il rettangolo di delimitazione nella finestra di impostazione delle misure, scegliendo il numero minimo possibile di pixel. Quindi, accedere al menu Analizza, Analizza particelle.

Misurare il tempo del punto di interesse rispetto all'asse Y e verificare i risultati visualizzati, quindi aggiungere alle finestre di gestione per visualizzare i valori dei dati. Infine, nel menu della tabella dei risultati, selezionare File, Salva con nome ed elaborare il set di dati delle durate delle immagini dei punti mediante il software di analisi appropriato. Qui, i tempi di permanenza di 185 punti GFP-Patrol1 da 12 cellule secondarie indipendenti in ottava edin, misurati mediante analisi del grafico chm, sono mostrati come illustrato nel grafico.

La funzione di densità interpolata ha rivelato che la maggior parte dei punti GFP patrol one risiedeva in una cellula accessoria per un periodo compreso tra due e 10 secondi, con un picco di circa 3,5 secondi. Questo suggerisce un rapido riciclo mediante esocitosi e endocitosi delle pompe protoniche sulla superficie della cellula accessoria. Dopo aver analizzato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare e quantificare la dinamica di proteine di tipo ary sulla superficie delle cellule vegetali mediante microscopia a fluorescenza epiluminiscenza con angolo variabile.