In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il movimento delle proteine marcate in fluorescenza sulle superfici cellulari delle piante con la microscopia a epifluorescenza ad angolo variabile. Questo vaso può aiutarci a progredire nel campo della biologia delle cellule vegetali, ad esempio come funzionano le proteine sulle superfici cellulari a piastre. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di visualizzare in tempo reale le dinamiche delle proteine di attacco fluorescenti prima di iniziare la procedura.

Calibrare la centratura e la messa a fuoco del laser del microscopio secondo le istruzioni del produttore. Quindi utilizzare un percorso luminoso libero da una lente dell'obiettivo per individuare il centro del soffitto della sala di microscopia e contrassegnare la posizione con un sigillo colorato. Quindi, illuminare il soffitto con una lente dell'obiettivo e spostare la regione illuminata in posizione centrale.

Quindi mettere a fuoco il laser e regolare con precisione la posizione del laser al centro del soffitto. Il centraggio e la messa a fuoco del laser sono molto importanti per il successo dell'osservazione con epiprofumo ad angolo variabile o VAEM. Gli utenti devono essere formati da un professionista dell'azienda produttrice di microscopi prima di iniziare un esperimento.

Quando il microscopio è pronto, erogare 30 microlitri di tampone basale al centro di un vetrino di vetro da 76 x 26 millimetri. Quindi utilizzare le forbici da dissezione per rimuovere una co-piombo da una piantina di sette giorni e far galleggiare la co-piombo con il lato di osservazione rivolto verso l'alto sulla goccia del tampone basale. Quindi, aggiungere 30 microlitri di tampone basale al centro di un 18 x 18 millimetri.

Coprire il vetro e capovolgere il vetro di copertura. Una leggera tensione superficiale impedirà la caduta della goccia, tenendo il vetro di copertura con una pinzetta su un bordo. Posizionare il bordo opposto sul vetrino in modo che il tampone si trovi sopra l'ingresso del co.

Quindi mantenendo il bordo del vetro di copertura sul vetrino. Regolare la posizione della goccia in modo che si trovi direttamente sopra il campione di oleina e far cadere il vetro di copertura. Se non ci sono bolle d'aria, utilizzare fazzoletti privi di lanugine per rimuovere il tampone in eccesso e trasferire immediatamente il preparato al microscopio.

Utilizzando l'illuminazione in campo chiaro, selezionare le celle per l'osservazione. Successivamente, verificare che la proteina fluorescente possa essere osservata e utilizzare l'illuminazione a epifluorescenza per impostare la posizione dell'asse Z sulla superficie cellulare. Per eseguire il VAEM, utilizzare la scatola del controller per inclinare l'angolo di ingresso del raggio laser.

Gradualmente monitorando attentamente l'immagine dal vivo. Inizialmente, l'immagine apparirà sfocata. All'aumentare dell'angolo del laser, l'immagine VAEM diventerà meno sfocata, producendo infine un'immagine nitida.

A questo punto, smetti di aumentare l'angolo del laser. Ora va bene. Regolare l'angolo di ingresso del laser per ottenere un'immagine migliore, regolando i parametri ottici e del sensore di immagine secondo necessità.

Quindi, utilizzando il software per microscopio commerciale, è possibile acquisire un filmato come file immagine TIFF multipagina. Qui il filmato mostra i punti etichettati GFP che lampeggiano sulla superficie delle celle del modello STA. Per quantificare il tempo di residenza DOT etichettato GFP utilizzando le Fiji, vai al menu di apertura del file e apri il file di suggerimenti multipagina acquisito.

Usa lo strumento di selezione della linea retta per posizionare una linea sul lato di interesse. Quindi, utilizza il plug-in di res slice dinamico delle pile di immagini per generare un'immagine grafica. Quando la linea cambia, l'immagine del grafico cambierà dinamicamente.

Salva l'immagine come file TIFF sotto il file, salva come tiff menu. Quindi, per eseguire una riduzione del rumore, vai al menu Sfocatura gaussiana dei filtri di processo e applica un filtro gaussiano alle immagini del cronografo. Il parametro del raggio sigma deve essere regolato secondo necessità.

Utilizzando lo strumento di regolazione della soglia dell'immagine, segmentare le regioni del segnale in base alla soglia e aprire il menu Analizza misurazioni impostate. Quindi, controlla il rettangolo di delimitazione nella finestra delle misure impostate, selezionando il numero minimo di pixel possibile. Quindi, nel menu Analizza, analizza particelle.

Misurare il tempo del punto di interesse rispetto all'asse Y e controllare i risultati visualizzati e aggiungere alle caselle di gestione per visualizzare i valori dei dati. Infine, nel menu della tabella dei risultati, selezionare il file, salvare con nome ed elaborare il set di dati delle durate delle immagini puntiformi utilizzando il software di analisi appropriato. Qui, i tempi di permanenza di 185 punti di pattuglia GFP da 12 celle sussidiarie indipendenti in ottava edin, misurati dall'analisi del grafico chm, sono mostrati come illustrato nel grafico.

La funzione di densità ha rivelato che la maggior parte dei punti di pattuglia GFP erano residenti in una cella sussidiaria per un periodo compreso tra due e 10 secondi, con un picco di circa 3,5 secondi. Ciò suggerisce una rapida esocitosi endocitotica delle pompe protoniche sulla superficie cellulare sussidiaria. Dopo aver lavorato a questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare e quantificare la dinamica delle proteine di tipo ario sulla superficie cellulare delle piante utilizzando la microscopia a epifluorescenza ad angolo variabile.