Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

L'obiettivo generale di questa procedura HPLC è quello di ottimizzare una colonna di flusso segmentato parallelo per consentire il rilevamento multiplex. Questo metodo risponde a domande chiave nei settori della salute e del benessere, delle scienze ambientali, della medicina legale e di tutte le aree che richiedono l'analisi di campioni complessi come la bioscoperta. Questa tecnica consente l'analisi completa dei campioni, fornendo al contempo informazioni sulla natura chimica e bioattiva delle sostanze in miscele complesse.

I protocolli di rilevamento multiplo consentono inoltre un'analisi rapida. Questo metodo consente lo sviluppo di strategie per definire l'impronta chimica di miscele complesse, come caffè e vino, consentendo ai produttori di distinguere tra i loro prodotti e le varietà contraffatte a basso costo. Inizialmente, potrebbe sembrare poco ortodosso non inviare l'intero campione a un solo rivelatore per un'analisi accurata.

Tuttavia, la concentrazione dell'analita all'interno di ciascun flusso è superiore al flusso totale di una colonna convenzionale. Per iniziare, configurare lo strumento HPLC con acqua UE al 100% e metanolo puro rispettivamente per le fasi mobili A e B. Se si desidera utilizzare un rivelatore MS, aggiungere lo 0,1% di acido formico a entrambe le fasi mobili, quindi spurgare le pompe HPLC secondo le istruzioni del produttore.

Assemblare l'MS UV VS. E rilevatori DPPH. Secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che i componenti siano disposti in modo appropriato, in modo tale che il volume morto nelle linee del rivelatore sia minimo.

Quindi impostare la lunghezza d'onda del rivelatore UV VISTA sulla lunghezza d'onda specifica del campione qui. 280 nanometri per il rivelatore MS. Utilizzare la modalità positiva per la conta ionica totale o l'analisi TIC con il metodo di rilevamento a scansione completa.

Equilibrare la temperatura e il flusso di gas del rilevatore MS ai seguenti valori. Temperatura del vaporizzatore di 500 gradi Celsius, temperatura capillare di 350 gradi Celsius, flusso di gas ausiliario di 40 unità, flusso di gas di spazzamento di cinque unità, velocità del gas di guaina di 60 unità e tensione di spruzzatura di 3,5 kilovolt. Per preparare il reagente radicale DPPH iniziare sciogliendo 25 milligrammi di radicale DPPH in 250 millilitri di metanolo in un matraccio tarato.

Aggiungere 250 microlitri di acido formico alla soluzione e sonicare la soluzione per 10 minuti. Quindi coprire il pallone e la pellicola per evitare l'esposizione alla luce. Quindi, spurgare la pompa con la soluzione radicale DPPH come consigliato dal produttore per configurare il sistema radicale DPPH.

Assicurarsi che la linea della pompa sia fissata all'ingresso di un raccordo a T, quindi collegare la bobina di reazione da 100 microlitri all'uscita del raccordo a T. Collegare il rivelatore all'altra estremità della custodia ENC della bobina di reazione, alla bobina di reazione e a un riscaldatore a colonna. Infine impostare il rivelatore UV V radicale DPPH a 520 nanometri.

Per costruire il flusso segmentato parallelo o la colonna PSF, collegare prima l'ingresso della colonna allo strumento HPLC. Quindi, utilizzare un pezzo di tubo per collegare la porta centrale al rilevatore MS. Utilizzare tubi delle stesse dimensioni per collegare una porta periferica della colonna al rivelatore UV VS e un'altra al raccordo a T del sistema di rilevamento dei radicali DPPH.

Bloccare tutte le porte periferiche inutilizzate con i fermi delle colonne. Regolare la portata dell'HPLC a un millilitro al minuto di fase B mobile al 100% per una colonna di 4,6 millimetri, diametro interno e 250 millimetri di lunghezza. Equilibrare per 20 minuti.

Per iniziare a mettere a punto il sistema PSF, strappare prima i recipienti di raccolta vuoti. Utilizzare queste fiale per raccogliere separatamente la fase mobile dall'UV VS. E le porte radicali DPPH. Prendere nota del periodo di raccolta e raccogliere almeno 500 milligrammi di solvente in ogni recipiente.

Quindi, pesare i recipienti di raccolta per determinare la massa della fase mobile e dividere la massa per la densità del metanolo per calcolare il volume della fase mobile raccolta da ciascuna porta. Infine, determinare la portata del rivelatore MS e calcolare le proporzioni di flusso di tutti i rivelatori come percentuale del flusso totale come indicato nel protocollo di testo. Se le proporzioni di flusso si discostano notevolmente dai valori ideali, aggiungere ulteriori tubi se necessario per regolare la contropressione e ripetere il processo di raccolta e calcolo.

Infine, impostare la portata della pompa per reagenti radicali DPPH in modo che corrisponda alla portata della porta di uscita collegata al rivelatore. È stata eseguita un'analisi HPLC multiplexata su un campione di caffè. La capacità di registrare DPPH radicale UV VS. E contemporaneamente Ms.Chromatograms consente ai composti nel campione che hanno risposto positivamente al radicale DPPH di essere facilmente abbinati alle risposte UV vs.And

MS in base all'allineamento del tempo di ritenzione in cui è stata osservata una risposta positiva dal rivelatore MSS TIC, è stata registrata la massa molecolare del picco. La facilità di corrispondenza dei picchi tra diversi processi di rilevamento consente una forma rapida e più efficiente di screening e caratterizzazione per un campione complesso come il caffè. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere impostata in appena un'ora circa e pronta per l'analisi del campione Seguendo questa procedura. Altri rivelatori, come l'indice di rifrazione, la fluorescenza e la rilevazione basata su sostanze chimiche, come la luminescenza chimica, possono essere utilizzati per ottenere ulteriori informazioni sul campione.

Dopo aver visto questo video, è necessario riconoscere l'importanza dei processi di rilevamento multiplexing per ottenere una maggiore comprensione di un campione complesso. Inoltre, il rilevamento multiplex con colonne di flusso segmentate parallele è un modo estremamente efficiente per intraprendere l'esplorazione biologica.