Ottimizzazione di una colonna parallela segmentata Flow e Abilitazione rilevamento Multiplexer

L'obiettivo generale di questa procedura HPLC è regolare una colonna a flusso segmentato parallelo per consentire la rilevazione multiplex. Questo metodo risponde a domande fondamentali nei settori della salute e del benessere, delle scienze ambientali, della criminalistica e in tutti gli ambiti che richiedono l'analisi di campioni complessi, come la scoperta biochimica. Questa tecnica permette un'analisi completa del campione fornendo al contempo informazioni sulle caratteristiche chimiche e bioattive delle sostanze presenti in miscele complesse.

I protocolli di rilevamento multiplo consentono anche un'analisi rapida. Questo metodo permette lo sviluppo di strategie per definire l'identità chimica di miscele complesse, come il caffè e il vino, consentendo ai produttori di distinguere i propri prodotti da varietà contraffatte di bassa qualità. Inizialmente, potrebbe sembrare poco ortodosso non inviare l'intero campione a un singolo rivelatore per un'analisi accurata.

Tuttavia, la concentrazione dell'analita all'interno di ogni flusso è superiore rispetto al flusso totale di una colonna convenzionale. Per iniziare, configurare lo strumento HPLC con acqua UE al 100% e metanolo puro come fasi mobili A e B rispettivamente. Se si utilizza un rivelatore MS, aggiungere lo 0,1% di acido formico a entrambe le fasi mobili, quindi spurgare le pompe dell'HPLC seguendo le istruzioni del produttore.

Assemblare i rilevatori MS UV VS e DPPH. Secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che i componenti siano disposti in modo appropriato, in modo che il volume morto nelle linee dei rilevatori sia minimo.

Quindi impostare la lunghezza d'onda del rilevatore UV VISTA sulla lunghezza d'onda specifica per il campione. 280 nanometri per il rilevatore MS. Utilizzare la modalità positiva per il conteggio totale degli ioni o analisi TIC con il metodo di rilevamento a scansione completa.

Portare a equilibrio la temperatura e il flusso di gas del rivelatore MS ai seguenti valori: temperatura del vaporizzatore di 500 gradi Celsius, temperatura della capillare di 350 gradi Celsius, flusso di gas ausiliario di 40 unità, flusso di gas di spazzamento di cinque unità, portata del gas di schermatura di 60 unità e tensione di spruzzo di 3,5 chilovolt. Per preparare il reagente del radicale DPPH, sciogliere innanzitutto 25 milligrammi di radicale DPPH in 250 millilitri di metanolo in un matraccio tarato.

Aggiungere 250 microlitri di acido formico alla soluzione e sottoporre la soluzione a sonificazione per 10 minuti. Successivamente, coprire il pallone con stagnola per evitare l'esposizione alla luce. Poi, eseguire il purging della pompa con la soluzione del radicale DPPH seguendo le indicazioni del produttore per impostare il sistema del radicale DPPH.

Assicurarsi che la linea della pompa sia fissata all'ingresso di un raccordo a T, quindi collegare la bobina di reazione da 100 microlitri all'uscita del raccordo a T. Collegare il rivelatore all'altra estremità della bobina di reazione ENC, alla bobina di reazione e al riscaldatore della colonna. Infine, impostare il rivelatore UV per i radicali DPPH a 520 nanometri.

Per costruire la colonna a flusso segmentato parallelo (PSF), collegare innanzitutto l'ingresso della colonna allo strumento HPLC. Successivamente, utilizzare un pezzo di tubo per collegare la porta centrale al rivelatore MS. Utilizzare tubi delle stesse dimensioni per collegare una porta periferica della colonna al rivelatore UV-Vis e un'altra al giunto a T del sistema di rilevamento del radicale DPPH.

Bloccare tutte le porte periferiche non utilizzate con tappi per colonna. Regolare la portata dell'HPLC a un millilitro al minuto di fase mobile B al 100% per una colonna di 4,6 millimetri di diametro interno e 250 millimetri di lunghezza. Eseguire l'equilibrazione per 20 minuti.

Per iniziare la taratura del sistema PSF, innanzitutto svuotare i contenitori di raccolta. Utilizzare queste provette per raccogliere separatamente la fase mobile dai flussi uscenti dal rilevatore UV VS e dal radicale DPPH. Registrare l'intervallo di tempo di raccolta e raccogliere almeno 500 milligrammi di solvente in ciascun contenitore.

Successivamente, pesare i contenitori di raccolta per determinare la massa della fase mobile e dividere la massa per la densità del metanolo per calcolare il volume della fase mobile raccolta da ciascuna uscita. Infine, determinare la portata verso il rivelatore MS e calcolare le proporzioni di flusso di tutti i rivelatori come percentuale del flusso totale, come indicato nel protocollo testuale. Se le proporzioni di flusso si discostano in modo significativo dai valori ideali, aggiungere ulteriore tubo ove necessario per regolare la pressione di controspinta e ripetere il processo di raccolta e calcolo.

Infine, impostare la portata della pompa del reagente radicale DPPH in modo che corrisponda alla portata del collegamento di uscita connesso al rivelatore. È stata eseguita un'analisi HPLC multiplex su un campione di caffè. La possibilità di registrare contemporaneamente cromatogrammi UV e MS del radicale DPPH consente di associare facilmente i composti nel campione che hanno risposto positivamente al radicale DPPH ai cromatogrammi UV.

E le risposte MS basate sull'allineamento del tempo di ritenzione in cui si osservava una risposta positiva dal rivelatore MSS TIC, la massa molecolare del picco è stata registrata. La facilità di abbinamento dei picchi tra diversi processi di rilevamento consente una forma di screening e caratterizzazione rapida e più efficiente per un campione complesso come il caffè. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere configurata in circa un'ora ed essere pronta per l'analisi del campione seguendo questa procedura. Altri rivelatori come l'indice di rifrazione, la fluorescenza e il rilevamento basato su reazioni chimiche, come la chemiluminescenza, possono essere utilizzati per ottenere ulteriori informazioni sul campione.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe riconoscere l'importanza dei processi di rilevamento multiplex per ottenere una comprensione più approfondita di un campione complesso. Inoltre, il rilevamento multiplex mediante colonne a flusso segmentato in parallelo rappresenta un metodo estremamente efficiente per condurre esplorazioni biologiche.