Name: Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Impara la derivatizzazione post-colonna con colonne a flusso di reazione per migliorare l'efficienza e la sensibilità dell'HPLC. Questo metodo elimina le bobine di reazione e analizza composti con bassa risposta ai rivelatori.

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Questo lavoro è stato supportato da UWS e ThermoFisher Scientific. Uno degli autori (DK) riconosce di aver ricevuto un premio post-laurea australiano.

Attenzione: Si prega di fare riferimento alle schede di sicurezza dei materiali (MSDS) per tutti i materiali e reagenti prima dell&#39;uso (ad esempio, scheda di sicurezza per il metanolo). Garantire l&#39;uso di tutte le pratiche di sicurezza appropriate durante la manipolazione di solventi e ad alte prestazioni cromatografia liquida eluente (HPLC). Garantire un uso appropriato di controlli tecnici di HPLC, analitica equilibrio e rilevatore di strumentazione, e garantire l&#39;uso di dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, e scarpe chiuse). Nota: Questo protocollo descrive 3 modi di flusso di reazione derivatizzazione post-colonna (RF-PCD) tecniche, ciascuna con un reagente diverso specifico per la natura di un composto chimico di interesse. Per l&#39;analisi del ROS vai alla sezione &quot;1. Rilevamento di ROS utilizzando DPPH •&quot;, per l&#39;analisi delle ammine primarie vedere la sezione &quot;2. Individuazione di ammine primarie con fluorescamina&quot;, e per l&#39;analisi dei composti fenolici andare alla sezione &quot;3 . rilevamento di fenoliusando 4 aminoantipyrene e ferricianuro di potassio &quot;. Utilizzare acqua ultra-pura (ad esempio, acqua Milli-Q) in tutto. Nota: Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC. 1. Rilevamento di ROS Utilizzando DPPH • <ol><li> Messa a punto di strumenti HPLC <ol><li> Preparazione dello strumento HPLC con 100% di acqua sulla linea A e 100% metanolo sulla linea B come fase mobile. Eliminare le pompe secondo i requisiti del produttore. </li><li> Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A. </li><li> Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d&#39;onda di 520 nm. </li></ol></li><li> Messa a punto dicolonna RF <ol><li> Collegare l&#39;ingresso della colonna RF allo strumento HPLC. </li><li> Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF. </li><li> Collegare un porto periferico di uscita al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubi id. </li><li> Collegare il DPPH • linea di pompa ad una porta periferica sull&#39;uscita della colonna RF. </li><li> Bloccare la porta periferica inutilizzata sull&#39;uscita della colonna RF con un tappo di colonna. </li><li> Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea B - 100% metanolo. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile metanolo 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo deve essere scalata in base alle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li></ol></li><li> Preparazione del DPPH • reagente <ol><li> Preparare una soluzione / ml 0,1 mg di DPPH • in metanolo. </li&gt; <li> Sonicare il pallone contenente il DPPH • reagente per 10 min. </li><li> Coprire il pallone in foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Spurgare la pompa DPPH • con il preparato DPPH • reagente secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Mettere a punto il uscita della colonna RF <ol><li> Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l&#39;altro come periferica. </li><li> Raccogliere l&#39;effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min. </li><li> Pesare nuovamente la nave porto centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue: Peso di Port centrale (g) = peso finale di Port Central Vessel (g) - peso iniziale di Port Central Vessel (g) </li><li> Ripetere i punti 1.4.2 e 1.4.3 per l&#39;effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per la nave porta periferica comesegue: Peso di porta periferica (g) = peso finale della porta periferica Vessel (g) - peso iniziale della porta periferica Vessel (g) </li><li> Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue: % Port Centrale = Peso di Port centrale (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100 % Porta periferica = Peso della porta periferica (g) / (peso di Port centrale (g) + Peso della porta periferica (g)) x 100 </li><li> Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 30:70 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore a 30%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all&#39;uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è inferiore al 30% diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale. </li><li> Ripetere il passaggio da 1.4.1 a 1.4.6 fino a un rapporto di segmentazione di 30:70 (centrale: periferica) è raggiunto. </li><li> Impostare la portata del DPPH • Pompa reagente per 0,5 ml min -1. Nota: La colonna RF impostato con DPPH • reagente è ora pronto per l&#39;analisi. I campioni possono ora essere iniettati. </li></ol></li><li> Posta eseguire condizioni di arresto <ol><li> Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, fermare il flusso pompa derivatizzazione reagente. </li><li> Rimuovere il DPPH • linea di pompa del reagente dalla porta periferiche e si chiude il porto. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile in cui deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min -1 per 10 min. </li><li> Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC. </li><li> Sostituire il DPPH • reagente con metanolo e spurgare la pompa aggiuntiva. Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto. </li></ol></li></ol> 2. Rilevamento di ammine primarie Uso flammina <ol><li> Preparazione della fase mobile <ol><li> Preparare 1 L di una soluzione di acetato di ammonio 10 mM, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume. </li><li> Aggiungere 52,6 ml di acetonitrile (ACN) al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95:05 (buffer: ACN). </li></ol></li><li> Messa a punto di strumenti HPLC <ol><li> Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa secondo i requisiti del produttore. </li><li> Impostare i componenti strumentali HPLC e la pompa derivatizzazione supplementare come illustrato nella figura 4A. </li><li> Fissare una bobina attenuatore di pulsazioni alla pompa derivatizzazione. </li><li> Set-up rivelatore di fluorescenza (FLD) con lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 390 nm ed emissione lunghezza d&#39;onda di 475 nm. </li></ol></li><li> Messa a punto di colonna RF <ol><li> Collegare °e all&#39;ingresso della colonna RF allo strumento HPLC. </li><li> Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF. </li><li> Collegare un porta periferica all&#39;uscita della colonna RF al rivelatore FLD usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id. </li><li> Collegare la linea pompa derivatizzazione ad una porta periferica sull&#39;uscita della colonna RF. </li><li> Bloccare la porta periferica inutilizzata sull&#39;uscita della colonna RF con un tappo di colonna. </li><li> Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea A - 10 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% ACN. </li><li> Equilibrare la colonna con la linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li></ol></li><li> Preparazione del reagente fluorescamina <ol><li> Rendere 100 ml di 0,1 mg ml -1 fluorescamina reagente. </li> &lt;li&gt; ultrasuoni per 1 min. </li><li> Coprire con un foglio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Spurgare la pompa del reagente con il reagente fluorescamina preparato secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Mettere a punto il uscita della colonna RF <ol><li> Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l&#39;altro come periferica. </li><li> Raccogliere l&#39;effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min. </li><li> Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3. </li><li> Ripetere i punti 2.5.2 a 2.5.3 per l&#39;effluente uscire dal FLD che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4. </li><li> Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5. </li><li> Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e perifericaflusso è 43:57 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è sopra 43%, diminuire la quantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id all&#39;uscita della porta centrale. Se il flusso centrale è sotto 43%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale. </li><li> Ripetere il passaggio 2.5.1 a 2.5.6 fino a un rapporto di segmentazione di 43:57 (centrale: periferica) è raggiunto. </li><li> Impostare la portata della pompa fase mobile a 0,7 ml min -1. </li><li> Impostare la pompa derivatizzazione a scorrere a 0,1 ml min -1. Nota: La colonna RF impostato con il reagente fluorescamina è ora pronto per l&#39;analisi. I campioni possono ora essere iniettati. </li></ol></li><li> Posta eseguire condizioni di arresto <ol><li> Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati, indicando che la corsa è terminata, arrestare la pompa derivatizzazione. </li><li> Rimuovere la riga pompa derivatizzazione dalla porta periferiche e tappo. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile inquale deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min -1 per 10 min. </li><li> Arrestare il flusso della pompa fase mobile. </li><li> Sostituire il reagente fluorescamina con acetonitrile e spurgare la pompa derivatizzazione. Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto. </li></ol></li></ol> 3. Rilevamento di fenoli con 4-Aminoantipyrene e Potassio ferricianuro <ol><li> Preparazione della fase mobile <ol><li> Preparare 1 L di una soluzione di 100 mM di acetato di ammonio, regolando il pH della soluzione a 9,0 con 5 M di idrossido di ammonio prima della diluizione a volume. </li><li> Aggiungere 52,6 ml di metanolo al tampone di acetato di ammonio a raggiungere una fase mobile premiscelata di 95: 5 (buffer: metanolo). </li></ol></li><li> Messa a punto di strumenti HPLC <ol><li> Preparare lo strumento HPLC con il tampone preparata premiscelato sulla linea A come fase mobile. Spurgare la pompa come da produttore &#39;; S requisiti. </li><li> Impostare i componenti strumentali HPLC e le due pompe reagenti supplementari come illustrato in Figura 4B. </li><li> Attaccare una bobina attenuatore di pulsazioni a ciascuna delle pompe reagenti. </li><li> Impostare il rivelatore UV-Vis per analizzare alla lunghezza d&#39;onda di 500 nm. </li></ol></li><li> Messa a punto di colonna RF <ol><li> Collegare l&#39;ingresso della colonna RF allo strumento HPLC. </li><li> Collegare una lunghezza 15 cm da 0,13 millimetri tubi id alla presa della porta centrale della colonna RF. </li><li> Collegare un porta periferica all&#39;uscita della colonna RF al rivelatore UV-Vis usando una lunghezza di 15 cm da 0,13 millimetri tubo id. </li><li> Collegare ciascun reagente (cioè, 4-aminoantipyrene e ferricianuro di potassio) linea di pompe a una porta periferica sull&#39;uscita della colonna RF. </li><li> Portare la portata della pompa HPLC a 1 ml min -1 a 100% linea A - 100 mM ammonio acetato tampone a pH 9, premiscelato con 5% di metanolo. </li><li> Equilibrare la colonna wesima linea A fase mobile 100% per 10 minuti per una colonna di lunghezza mm 4,6 mm di diametro x 100. Questo tempo può essere scalata a seconda delle dimensioni delle altre colonne l&#39;utente può impiegare. </li></ol></li><li> Preparazione del reagente 4 aminoantipyrene <ol><li> Preparare un tampone di acetato di ammonio con un pH di 9, seguendo passo 3.1.1. </li><li> Pesare 150 mg 4 aminoantipyrene e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio preparati (pH 9). </li><li> Con ultrasuoni per 1 min. </li><li> Coprire con un foglio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Eliminare la prima pompa reagente con il preparato Reattivo 4 aminoantipyrene secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Preparazione di potassio reagente ferricianuro <ol><li> Pesare 150 mg di ferricianuro di potassio e sciogliere in 100 ml di tampone di acetato di ammonio (pH 9) preparati secondo passo 3.1.1. </li><li> Con ultrasuoni per 1 min. </li><li> Copertura in foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Purge la seconda pompa reagente con il preparato reagente ferricianuro di potassio secondo i requisiti del produttore. </li></ol></li><li> Messa a punto di colonna RF <ol><li> Pesare due navi pulite e asciutte. Etichettare una nave come centrale e l&#39;altro come periferica. </li><li> Raccogliere l&#39;effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente etichettato centrale per 1,0 min. </li><li> Re-pesare il vaso centrale e calcolare il peso del flusso dal porto centrale come segue al punto 1.4.3. </li><li> Ripetere i punti da 3.6.2 a 3.6.3 per l&#39;effluente esce dalla UV-Vis che è collegato alla porta periferiche della colonna RF e calcolare il peso per periferiche come segue al punto 1.4.4. </li><li> Calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrali e periferici come segue al punto 1.4.5. </li><li> Assicurarsi che il rapporto tra il flusso di segmentazione centrale e il flusso periferico è 50:50 (centrale: periferica). Se il flusso centrale è superiore al 50%, diminuire laquantità di portata in uscita aggiungendo una lunghezza di 0,13 millimetri tubo id al porto centrale di uscita. Se il flusso centrale è inferiore al 50%, diminuire la lunghezza del tubo 0,13 millimetri dal porto centrale. </li><li> Ripetere il passaggio 3.6.1 a 3.6.6 fino a un rapporto di segmentazione di 50:50 (centrale: periferica) è raggiunto. </li><li> Impostare la portata della pompa 4 aminoantipyrene a 0,5 ml min -1. </li><li> Impostare la portata della pompa ferricianuro di potassio 0,25 ml min -1. Nota: La colonna RF istituito con i reagenti bicomponenti è ora pronto per l&#39;analisi. I campioni possono ora essere iniettati. </li></ol></li><li> Posta eseguire condizioni di arresto <ol><li> Una volta che tutti i campioni sono stati iniettati corsa è terminata, indicando che la corsa è terminata, fermare entrambe le pompe reagenti. </li><li> Rimuovere le linee della pompa del reagente dalle porte periferiche e sostituirli con un 15 centimetri pezzo di tubo 0,13 millimetri. </li><li> Equilibrare la colonna con la fase mobile in WHIch esso deve essere memorizzato, consentendo la fase mobile di passare attraverso la colonna ad 1 ml min -1 per 10 min. </li><li> Arrestare il flusso della pompa fase mobile sullo strumento HPLC. </li><li> Sostituire entrambi i reagenti sul reagente pompe con metanolo ed eliminare le pompe supplementari secondo il requisito del produttore. Nota: Il sistema HPLC può ora essere arresto. </li></ol></li></ol>

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<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations%3A+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

RF-PCD consente la miscelazione efficiente del reagente derivatizzazione con l&#39;effluente post-colonna HPLC senza l&#39;uso di bobine di reazione, minimizzando gli effetti di banda allargamento e migliorando le prestazioni di separazione. Metodi RF-PCD hanno anche mostrato miglioramenti nella risposta del segnale rispetto al metodo di rilevazione. Camenzuli et al. 28 è stato il primo a segnalare l&#39;uso di colonne di flusso di reazione con DPPH • per la rilevazione di ROS in un campio...

cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con la colonna montante derivatizzazione (PCD) è un potente strumento che è utile a risolvere una serie di questioni nel laboratorio di analisi. Può essere usato per rilevare composti che sono altrimenti non rilevabili con la serie di rivelatori disponibili 1,2, aumentare il segnale dell&#39;analita bersaglio, che permette limiti inferiori di rivelazione e quantificazione 3-5 o selettivamente derivatize un analita bersaglio per evitare effetti di matrice 6. Reazioni PCD comunemente usati includono la reazione di ammine, come aminoacidi, con orto-phthaladehyde 7-9, ninidrina 9,10 o fluorescamina 11,12, la derivatizzazione di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) con il 2,2-difenil- 1-picrylhydrazil radicali (DPPH •) 13,14 o 2,2&#39;-Azino-bis (acido 3-ethylbenzothiazoline-6-solfonico (ABTS) 15,16, e l&#39;uso del reagente ioduro-azide per derivatize zolfo ccomposti ontaining 17,18. Vi sono, tuttavia, numerosi inconvenienti all&#39;utilizzo di reazioni PCD con sistemi HPLC 6. Principalmente fra questi è l&#39;uso di bobine di reazione tra il punto di aggiunta del reagente di derivatizzazione (s) e il rilevatore, che consentono il tempo per la miscelazione e la reazione avvenga 8. Questi reazione loop spesso hanno volumi di 500 ml o più, che è significativo rispetto al volume del resto del sistema HPLC 19. L&#39;uso di questi reazione alto volume passanti comporta un&#39;accresciuta allargamento di picco rispetto a quello che sarebbe osservata senza la presenza del ciclo di reazione. Ciò si traduce in brevi picchi più ampi che hanno limiti superiori di quantificazione e rilevazione e negativamente effetti risoluzione cromatografica. Figure 1 e 2 evidenziare il deterioramento della forma del picco che risultano dalla somma dei vari postale colonna volumi ciclo di reazione. Questa analisiè stata eseguita con un cellulare composizione di fase di 94% metanolo e 6% di acqua Milli-Q. La portata della fase mobile era 1 ml / min, il volume di iniezione era di 20 microlitri e la lunghezza d&#39;onda di analisi era 265 nm. Bobine di varia volumi morti da 20 ml a 1000 ml sono stati inseriti fra la colonna ed il rivelatore per simulare gli effetti di ciclo reazione volume morto nei metodi PCD. Questi cicli sono stati preparati da tubi di acciaio inossidabile di diametro interno 0,5 mm. L&#39;esperimento è stato eseguito su un sistema HPLC costituito da un controllore (SCL-10AVP), una bassa pressione gradiente valvola (FCL-10ALVP), una pompa (LC-20AD), un iniettore (SIL-10ADVP), ed un rivelatore PDA ( SPD-M10ADVP). La fase mobile è stata pompata attraverso un sistema di degasaggio prima dell&#39;introduzione nel sistema HPLC. La separazione è stata effettuata utilizzando un x 4.6 mm di diametro 5 micron colonna di 250 mm. Le condizioni sperimentali sono stati scelti per essere tipico delle reazioni PCD che sono stati recentemente pubblicati in letteratura. Ilsemplice, più comune alberino configurazione reattore a colonna è definito un reattore tubolare non segmentato che è effettivamente un tubo lungo e sottile attraverso il quale il liquido può fluire e la reazione può avvenire. In questo picco sistema allargamento dipende non solo il volume morto aggiunto al sistema, ma anche il diametro interno del tubo, come evidenziato da Iijima et al. 8. Inoltre, la geometria della bobina gioca un ruolo nella ampliamento marchio osservato. Stewart 20 affermato che l&#39;avvolgimento del reattore cambia i profili di flusso secondario, con conseguente migliore miscelazione, il che significa che il volume morto può essere minimizzato. E &#39;stato affermato che il picco allargamento non è significativo se si utilizza un tubolare aperto maglia della bobina 21. Quando l&#39;allargamento picco è troppo grande, altri tipi di reattore possono essere considerati 20,22. Questi possono includere reattori a letto o reattori flusso segmentati. Questi reattori sono particolarmente utili per le reazioni lente che altrimenti require grande reazione loop. Come non segmentati reattori tubolari sono i tipi più comuni di reattori utilizzati in applicazioni PCD, il resto di questa voce con questo tipo di configurazione del reattore. Il disegno della colonna flusso di reazione (RF) comprende un raccordo terminale multi-porta che permette fase mobile per uscire (o entrare) della colonna attraverso un singolo porto situato nella zona centrale radiale della colonna o tre porte situata al esterno regione di parete della colonna (vedi Figura 3). Questi due flussi sono separati usando un raccordo terminale contenente una fritta porosa centrale che è circondato da un anello impermeabile che è a sua volta circondato da un setto poroso esterna che si estende verso la parete della colonna. A causa del flusso anello trasversale impermeabile centrale non è possibile tra le due zone porose. Durante reazione cromatografia flusso, il reagente di derivatizzazione (s) vengono pompati contro la direzione del flusso della fase mobile in uno o two delle porte esterne della colonna flusso di reazione. L&#39;eluente colonna viene miscelato con il reagente di derivatizzazione (s) in fritta esterno e passa al rivelatore tramite una porta esterna libera. flusso di reazione può essere utilizzato sia per una derivatizzazione reattivo unico (1 porta per il reagente derivatizzazione, 1 porta per passare l&#39;eluente della colonna al rivelatore e 1 porta bloccata) oppure un sistema di reagente doppio (2 porte per i reagenti di derivatizzazione e 1 porta ad passare l&#39;eluente della colonna al rivelatore). Il flusso dal flusso centrale può essere utilizzato sia per rilevare eluente colonna underivatized, efficace rilevamento multiplexing 23, o passato sprecato. Un importante tecnica sintonizzazione che è disponibile quando si esegue RF-PCD cromatografia è il rapporto tra i flussi centrali e periferici. Il rapporto ottimale per ogni derivatizzazione dipende da una serie di fattori come se il flusso centrale sarà rilevato o passato a perdere. Pertanto una volta che il rapporto ottimale è stato determinato, Occorre garantire che il rapporto corretto flusso è ottenuta prima di essere eseguita ogni corsa. Si è trovato che l&#39;uso di una fritta di mescolare il flusso della colonna eluente ed il reagente derivatizzazione in RF-PCD risultati in miscelazione più efficiente rispetto alle tecniche di miscelazione tradizionali che impiegano tipicamente un raccordo a T di zero volume morto o volume morto partire W- pezzo per mescolare i due flussi. Ciò ha permesso l&#39;uso di relativamente piccoli cicli di reazione, o addirittura l&#39;eliminazione del ciclo di reazione del tutto. La riduzione dei risultati di reazione formato loop in picchi più rispetto ai metodi tradizionali di derivatizzazione post-colonna. Ciò significa che, nonostante il fatto che non tutti dell&#39;eluente colonna viene derivatizzato, maggiore rapporto segnale rumore sono osservati e limiti quindi minori di rivelazione e quantificazione può essere raggiunto. cromatografia flusso di reazione è stata sviluppata per superare le difficoltà con l&#39;adattamento reazione PCDs alle moderne colonne HPLC e sistemi, in particolare la perdita di efficienza causata da banda ampliando causa di grande colonna montante volumi morti dovuti alla necessità di impiegare grandi volumi di reazione loop. I processi di miscelazione più efficienti in RF-PCD rispetto al PCD convenzionale significa che i volumi del ciclo di reazione più piccoli possono essere impiegati portando ad un aumento di efficienza di separazione osservata. Inoltre RF-PCD cromatografia mostra sia il segnale aumentata e diminuita rumore rispetto alle tecniche convenzionali PCD con conseguente limiti inferiori di rilevazione e quantificazione rispetto ai metodi convenzionali PCD. Un ulteriore vantaggio di RF-PCD rispetto ai metodi convenzionali PCD è la capacità di monitorare il flusso underivatized che eluisce dalla porta centrale della colonna RF nonché il flusso derivatizzato che eluisce dalla regione periferica della colonna. RF-PCD è una relativamente nuova, ma promettente tecnica che consente di visualizzare molti vantaggi rispetto ai metodi tradizionali PCD. <p class="jove_content"&gt; Collegamento della colonna RF è realizzato quasi nello stesso modo di una colonna HPLC convenzionale con la differenza principale è il numero di raccordi di estremità su una colonna RF. Raccordi utilizzati per collegare una colonna HPLC standard al sistema HPLC possono essere utilizzate per collegare una colonna RF al sistema HPLC.

<table><tbody><tr><td>Strumento HPLC</td><td>Agilent</td><td>Serie 1290 HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Pompa/e aggiuntiva/e per sistema di derivatizzazione</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>Colum</td><td></td><td></td> RF <td>Tubi in</td></tr><tr><td>PEEK</td> non commerciali <td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Tappi a</td><td></td><td></td> colonna <td>Fornito con</td></tr><tr><td>colonna Tagliatubi in PEEK</td><td>Sigma Bilancia</td> analitica <td>Aldrich Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td></td><td></td><td>analitica Bilancia analitica a 4 punti</td></tr><tr><td>Cronometro</td><td></td><td></td><td>Attrezzatura non scientifica Fiale</td></tr><tr><td></td><td></td> di<td>raccolta dell'eluente</td><td>Qualsiasi fiala piccola con fondo piatto andrà bene, ad es, Fiale HPLC Fiale</td></tr><tr><td></td><td></td><td>HPLC</td><td>Dipenderà dallo strumento utilizzato</td></tr><tr><td>Recipienti per la fase mobile e le soluzioni di derivatizzazione></td> <td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>Vetreria</td><td></td><td></td> da laboratorio generale <td>Palloni volumetrici, pipette, ecc.</tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniaca</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Acetonitrile corrosivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4- amminoantipirene&nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianuro di potassio&nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

messaggio colonna derivatizzazione utilizzando reazione flusso high performance liquid chromatography colonne

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Viene presentato un protocollo per l'uso di colonne per cromatografia liquida ad alte prestazioni con flusso di reazione per metodi che utilizzano la derivatizzazione post-colonna (PCD). Una delle principali difficoltà nell'adattare la PCD ai moderni sistemi e colonne HPLC è la necessità di bobine di reazione di grande volume che consentano la miscelazione dei reagenti e quindi la reazione di derivatizzazione. Questo grande volume morto della colonna porta all'allargamento della banda, che si traduce in una perdita dell'efficienza di separazione osservata e del rilevamento della sensibilità. Nella derivatizzazione post colonna del flusso di reazione (RF-PCD), i reagenti di derivatizzazione vengono pompati contro il flusso della fase mobile in una o due delle porte esterne della colonna del flusso di reazione, dove vengono miscelati con l'effluente della colonna all'interno di una fritta alloggiata all'interno del raccordo terminale della colonna. Questa tecnica consente una miscelazione più efficiente dell'effluente della colonna e dei reagenti di derivatizzazione, il che significa che il volume dei cicli di reazione può essere ridotto al minimo o addirittura eliminato del tutto. È stato riscontrato che i metodi RF-PCD hanno prestazioni migliori rispetto ai metodi PCD convenzionali in termini di efficienza di separazione osservata e rapporto segnale/rumore. Un ulteriore vantaggio delle tecniche RF-PCD è la capacità di monitorare l'effluente proveniente dal porto centrale nel suo stato non derivatizzato. La RF-PCD è stata attualmente sperimentata su una gamma relativamente piccola di reazioni post-colonna, tuttavia, attualmente non vi è motivo di suggerire che la RF-PCD non possa essere adattata a qualsiasi reazione di derivatizzazione post-colonna esistente a uno o due componenti (purché entrambi i reagenti vengano aggiunti contemporaneamente).

Il primo metodo PCD che è stato adattato per l&#39;utilizzo da RF-PCD era la derivatizzazione di antiossidanti utilizzando la 2,2-difenil-1-picrylhydrazil radicale (DPPH •) 24. Questa reazione è stato introdotto da Koleva et al. 25 ed è stato ampiamente utilizzato fin. Il rilevamento si basa sulla decolorazione del DPPH • radicalico in presenza di specie reattive dell&#39;ossigeno, quindi, la presenza di antiossidanti risultati in una goccia assorbanza osservata. La r...

Viene presentato un protocollo per l'uso di colonne per cromatografia liquida ad alte prestazioni con flusso di reazione per metodi che utilizzano la derivatizzazione post-colonna (PCD).

Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

L'obiettivo generale di questo metodo è migliorare l'efficienza e la sensibilità della derivatizzazione post-colonna in cromatografia liquida ad alte prestazioni, o metodo PCD, attraverso l'utilizzo di una colonna di reazione in flusso. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in campi come le scienze farmaceutiche, biomediche e ambientali, in cui vengono analizzati composti con bassa risposta ai rivelatori HPLC. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non sono necessarie bobine di reazione.Dato che la miscelazione dell'eluito della colonna con il reagente di derivatizzazione avviene in modo più efficiente rispetto ai metodi convenzionali, questo metodo è stato utilizzato per ottenere informazioni sugli antiossidanti, sugli aminoacidi e sui fenoli. Può inoltre essere applicato ad altre classi di composti, come tioli, metalli, antibiotici e tossine.Sebbene l'intero campione non venga derivatizzato, a causa di una minore allargamento di banda, la concentrazione dell'analita all'interno del flusso effluente è più elevata rispetto all'analisi convenzionale con derivatizzazione post-colonna. Per iniziare questa procedura, preparare lo strumento HPLC con il 100% di acqua sulla Linea A e il 100% di metanolo sulla Linea B come fase mobile, effettuando la purga delle pompe secondo le indicazioni del produttore. Configurare i componenti dello strumento HPLC e la pompa aggiuntiva per la derivatizzazione.In seguito, impostare il rivelatore UV/VIS per analizzare alla lunghezza d'onda di 520 nanometri. Collegare l'ingresso della colonna a flusso di reazione, o RF, allo strumento HPLC. Collegare una porta periferica di uscita al rivelatore UV/VIS utilizzando un tubo lungo 15 centimetri con diametro interno di 0,13 millimetri.Successivamente, collegare il tubo della pompa DPPH a un porto periferico in uscita dalla colonna RF. Bloccare il porto periferico non utilizzato in uscita dalla colonna RF mediante un tappo per colonna. Collegare un tratto di tubo lungo 15 centimetri con diametro interno di 0,13 millimetri al porto centrale in uscita della colonna RF.Portare la portata della pompa HPLC a un millimetro al minuto al 100% di metanolo. Quindi equilibrare la colonna con metanolo al 100% per 10 minuti. A questo punto, preparare una soluzione di DPPH e metanolo a 0,1 milligrammi per millilitro.Sonicare il matraccio contenente il reagente DPPH per 10 minuti. Spurgare la pompa del DPPH con il reagente DPPH preparato secondo le indicazioni del produttore. Successivamente, prendere due recipienti asciutti e puliti ed etichettarne uno come "centrale" e l'altro come "periferico". Pesare con precisione i due recipienti.Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nel recipiente contrassegnato come "centrale" per un minuto. Dopo aver ripesato il recipiente del porto centrale, calcolare il peso del flusso proveniente dal porto centrale. Ripetere i passaggi precedenti per l'effluente in uscita dallo spettrofotometro UV/VIS collegato al porto periferico della colonna RF.Calcolare il peso per il vaso della porta periferica. Successivamente, calcolare la percentuale di flusso proveniente dalle porte centrale e periferica. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando il rapporto di flusso è corretto, quindi impostare la portata della pompa DPPH a 0,5 millilitri al minuto.Al termine della corsa, arrestare il flusso della pompa del reagente di derivatizzazione. Rimuovere la linea della pompa del reagente DPPH dal porto periferico e tappare il porto. Equilibrare la colonna con la fase mobile in cui verrà conservata, facendo passare la fase mobile attraverso la colonna a una velocità di un millimetro al minuto per 10 minuti.Quindi, arrestare il flusso della pompa della fase gassosa sullo strumento HPLC. Infine, sostituire il reagente DPPH con metanolo e spurghare la pompa aggiuntiva. Qui vengono mostrati due cromatogrammi di un campione di caffè ristretto, derivatizzato con un radicale DPPH utilizzando sia lo strumento PCD convenzionale che quello RF-PCD.I limiti calcolati di quantificazione e di rilevamento per ciascuno degli aminoacidi analizzati nelle modalità RF-PCD e PCD convenzionale sono elencati qui. Un cromatogramma dei quattro aminoacidi analizzati mediante il metodo PCD convenzionale, il metodo RF-PCD e il flusso non derivatizzato dal metodo RF-PCD è mostrato qui. Un confronto dei segnali ottenuti per i picchi dovuti a glicina e leucina utilizzando entrambi i metodi PCD convenzionale e RF-PCD è visualizzato qui.Viene mostrato qui un confronto tra la larghezza dei picchi del triptofano ottenuti analizzando con il metodo convenzionale PCD, con il metodo RF-PCD e con il flusso non derivatizzato del metodo RF-PCD. Un campione test di 21 componenti, contenente alcune sostanze che rispondono allo schema di derivatizzazione e altre che non rispondono, è stato separato, derivatizzato e rilevato. La stessa miscela è stata inoltre separata e rilevata senza derivatizzazione, per effettuare il confronto.Viene mostrato qui un confronto della forma del picco del para-creosolo, sia derivatizzato utilizzando la colonna RF-PCD che non derivatizzato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere impostata nello stesso tempo richiesto per l'analisi convenzionale di derivatizzazione post-colonna. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere i rapporti di flusso il più possibile vicini a quelli prescritti.Seguendo questa procedura, altri reagenti di derivatizzazione post-colonna, come OPA, ninidrina o alogeni, possono essere utilizzati per analizzare altri composti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea su come impostare e ottimizzare una colonna a flusso per reazioni.

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