Messaggio Colonna Derivatizzazione Utilizzando reazione flusso High Performance Liquid Chromatography Colonne

L'obiettivo generale di questo metodo è migliorare l'efficienza e la sensibilità della cromatografia liquida ad alte prestazioni dopo la derivatizzazione della colonna, o metodo PCD, attraverso l'uso di una colonna a flusso di reazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campi come le scienze farmaceutiche, biomediche e ambientali, dove vengono analizzati i composti che hanno una bassa risposta ai rivelatori HPLC. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non sono necessarie bobine di reazione.

Poiché la miscelazione dell'effluente della colonna e del reagente derivatizzante avviene in modo più efficiente rispetto ai metodi convenzionali. Questo metodo è stato utilizzato per fornire informazioni su antiossidanti, aminoacidi e fenoli. Può anche essere applicato ad altri composti di classe, come tioli, metalli, antibiotici e tossine.

Sebbene l'intero campione non sia derivatizzato, a causa dell'allargamento della banda inferiore, la concentrazione di analita all'interno del flusso dell'effluente è superiore rispetto all'analisi convenzionale post-colonna. Per iniziare questa procedura, preparare lo strumento HPLC con il 100% di acqua sulla linea A e il 100% di metanolo sulla linea B come fase mobile, spurgando le pompe secondo i requisiti del produttore. Predisporre i componenti strumentali HPLC e la pompa di derivatizzazione aggiuntiva.

Successivamente, impostare il rivelatore UV/VIS per l'analisi a una lunghezza d'onda di 520 nanometri. Collegare l'ingresso della colonna del flusso di reazione, o RF, allo strumento HPLC. Collegare una porta periferica di uscita al rilevatore UV/VIS utilizzando un tubo di 15 centimetri di lunghezza e 0,13 millimetri di diametro interno.

Quindi, collegare la linea della pompa DPPH a una porta periferica sull'uscita della colonna RF. Bloccare la porta periferica inutilizzata sull'uscita della colonna RF utilizzando un tappo della colonna. Collegare un tubo di 15 centimetri di lunghezza di 0,13 millimetri di diametro interno alla porta centrale di uscita della colonna RF.

Portare la portata della pompa HPLC a un millimetro al minuto al 100% di metanolo. Quindi equilibrare la colonna con metanolo al 100% per 10 minuti. A questo punto, preparare una soluzione di 0,1 milligrammi per millilitro di DPPH e metanolo.

Sonicare il pallone contenente il reagente DPPH per 10 minuti. Spurgare la pompa DPPH con il reagente DPPH preparato secondo i requisiti del produttore. Successivamente, prendi due recipienti asciutti e puliti ed etichettane uno come centrale e l'altro come periferico.

Raccogliere l'effluente in uscita dal porto centrale nella nave etichettata come centrale per un minuto. Dopo aver ripesato la nave del porto centrale, calcolare il peso del flusso dal porto centrale. Ripetere i passaggi precedenti per l'effluente in uscita dall'UV/VIS collegato alla porta periferica della colonna RF.

Calcolare il peso per la nave portuale periferica. Quindi, calcolare la percentuale del flusso proveniente dalle porte centrale e periferica. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando il rapporto di flusso non è corretto, quindi impostare la portata della pompa DPPH su 0,5 millilitri al minuto.

Una volta terminata la corsa, arrestare il flusso della pompa del reagente di derivatizzazione. Rimuovere la linea della pompa del reagente DPPH dalla porta periferica e tappare la porta. Equilibrare la colonna con la fase mobile in cui deve essere immagazzinata, lasciando che la fase mobile attraversi la colonna a un millimetro al minuto per 10 minuti.

Quindi, arrestare il flusso della pompa in fase bolla sullo strumento HPLC. Infine, sostituire il reagente DPPH con metanolo e spurgare la pompa aggiuntiva. Di seguito sono mostrati due cromatogrammi di un campione di caffè ristretto, derivatizzato con un radicale DPPH utilizzando sia la strumentazione PCD convenzionale che RF-PCD.

I limiti calcolati di quantificazione e rilevamento per ciascuno degli amminoacidi analizzati sia in modalità RF-PCD che in modalità PCD convenzionale sono elencati qui. Di seguito è mostrato un cromatogramma dei quattro amminoacidi analizzati utilizzando il metodo PCD convenzionale, il metodo RF-PCD e il flusso non derivatizzato dal metodo RF-PCD. Qui viene mostrato un confronto dei segnali ottenuti per i picchi dovuti alla glicina e alla leucina utilizzando entrambi i metodi PCD convenzionali e RF-PCD.

Di seguito viene mostrato un confronto tra l'ampiezza del picco del triptofano durante l'analisi utilizzando il metodo PCD convenzionale, il metodo RF-PCD e il flusso non derivatizzato dal metodo RF-PCD. Un campione di test a 21 componenti che conteneva alcuni componenti che mostrano una risposta allo schema di derivatizzazione e altri che non lo fanno sono stati separati, derivatizzati e rilevati. La stessa miscela è stata anche separata e rilevata non derivatizzata per il confronto.

Qui viene mostrato un confronto tra la forma del picco del para-Cresolo, sia derivatizzato utilizzando la colonna RF-PCD che non derivatizzato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere messa a punto contemporaneamente all'analisi convenzionale della derivatizzazione post-colonna. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di essere il più vicino possibile ai rapporti di flusso prescritti.

Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri reagenti di derivatizzazione post colonna, come OPA, ninidrina o alogeni per analizzare altri composti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come impostare e ottimizzare una colonna del flusso di reazione.