Un metodo semplice per glucosinolati estrazione e l'analisi con alta pressione cromatografia liquida (HPLC)
15 marzo 2017
Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo consolidato e robusto per l'estrazione di glucosinolati da materiali vegetali macinati. Dopo un trattamento con solfatasi in colonna degli estratti, i desulfoglucosinolati vengono eluiti e analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eseguire un'analisi semplice e diretta dei glucosinolati nelle piante e in altri campioni biologici. Questo metodo, per estrarre e analizzare i glucosinolati, può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nell'ecologia degli insetti vegetali, nella patologia vegetale, nella selezione delle piante e nelle scienze alimentari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ben convalidata e ampiamente applicabile a un'ampia gamma di campioni biologici.
Sebbene questo metodo sia utilizzato principalmente per quantificare i glucosinolati nei materiali vegetali, può essere applicato anche ai terreni o agli alimenti preparati. Questa procedura di estrazione può essere eseguita in quasi tutti i laboratori perché si utilizzano principalmente attrezzature di laboratorio standard. In generale, le persone che non conoscono questo metodo eseguiranno meglio le analisi e l'ispezione quando leggono e osservano il film almeno una volta.
Per iniziare la procedura, mescolare 10 grammi di gel di destrina reticolata G-25 con 125 millilitri di acqua ultrapura. Conservare il composto in una bottiglia con tappo a 4 gradi Celsius. Quindi, sciogliere 10.000 unità di arilsulfatasi di tipo H-1 in 30 millilitri di acqua ultrapura.
Aggiungete a questo 30 millilitri di etanolo assoluto e mescolate bene il composto. Centrifugare il composto a 2, 650 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente. Unire il surnatante con 90 millilitri di etanolo assoluto in un becher.
Mescolare e versare le nuove provette da centrifuga. Centrifugare la miscela a 1,030 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
Sciogliere e unire i pellet in un totale di 25 millilitri di acqua ultrapura. Agitare bene il composto e poi trasferire il composto in tubi da 1 millilitro. Conservare i campioni di solfato a 20 gradi Celsius per un massimo di un anno.
Successivamente, pesare circa 90 milligrammi di sinogramma e registrare il peso con una precisione di 1 microgrammo. Quindi, sciogliere il sinogramma monoidrato in 10 millilitri di acqua ultrapura. Preparare da questa soluzione madre di sinogramma cinque soluzioni di riferimento con concentrazioni comprese tra 50 e 750 micromolari.
Conservare le soluzioni di riferimento in provette da 1,5 millilitri a 20 gradi Celsius. Quindi, per ogni campione e riferimento, etichettare una provetta per microcentrifuga da 2 millilitri in una posizione di rack a colonna. Forare il tappo di ogni provetta per microcentrifuga con un ago da dissezione per la successiva liofilizzazione.
Posizionare i tubi etichettati in un blocco con la stessa configurazione e spaziatura delle colonne etichettate. Per preparare le colonne per pipette in vetro, utilizzare un'asta di legno o di vetro per premere delicatamente un pezzo di lana di vetro di 1 centimetro per 1 centimetro nella pipetta. Imballare la lana di vetro nel passaggio dal cilindro della pipetta allo stelo.
Posizionare una colonna per pipette in ciascuna posizione etichettata sul rack. Posizionare la griglia su un vassoio di scarto. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta di plastica da 1 millilitro.
Agitare bene il gel di destrina preparato. E poi usa la punta della pipetta allargata per caricare 0,5 millilitri di gel di destrina preparato in ciascuna colonna. Controllare le colonne per verificare la presenza di perdite di gel di destrina e sostituire eventuali colonne che perdono.
Una volta che tutte le colonne sono state caricate con gel di destrina, lavare ogni colonna con 1 millilitro di acqua ultrapura. Pesare tra 50 e 100 milligrammi di materiale vegetale a passo libero, finemente macinato in una provetta di reazione da 2 millilitri con tappo di sicurezza, e registrare il peso con una precisione di 0,1 milligrammi. Posizionare due sfere metalliche di 3 millimetri di diametro in ogni tubo.
Aggiungere a ciascun tubo 1 millilitro di metanolo al 70% in acqua ultrapura e agitare brevemente ogni miscela. Chiudere i tubi con tappi di sicurezza aggiuntivi e metterli immediatamente in un bagnomaria a 90-92 gradi Celsius. Scaldare i tubi fino a quando la sega inizia a bollire.
Trasferire le provette in un bagno a ultrasuoni e riscaldare sonicamente i campioni per 15 minuti. Durante la sonicazione, iniziare a scongelare il campione di solfato e i riferimenti ai sinogrammi. Dopo la sonicazione, centrifugare i campioni a 2.700 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Caricare i surnatanti e i riferimenti al sinogramma scongelati sulle colonne corrispondenti, facendo attenzione a non aspirare materia vegetale nella pipetta. Aggiungere 1 millilitro di metanolo al 70% in ogni tubo. Agitare le miscele.
E gli ultrasuoni riscaldano le miscele per 15 minuti. Centrifugare nuovamente le provette nelle stesse condizioni di prima. Caricare i surnatanti sulle colonne corrispondenti.
Aggiungere due porzioni da 1 millilitro di metanolo al 70% a ciascuna colonna, lasciando che le colonne si asciughino tra una porzione e l'altra. Lavare il metanolo residuo da ogni colonna con 1 millilitro di acqua ultrapura. Quindi, lavare ogni colonna con due porzioni da 1 millilitro di tampone acetato di sodio 20 millimolare, pH 5,5.
Una volta che le ultime porzioni di tampone in acetato di sodio sono state scaricate nel rack dei rifiuti, rimuovere il rack dal vassoio dei rifiuti e asciugare i piedini del rack con un fazzoletto. Posizionare il rack sul blocco di provette per microcentrifuga etichettate, in modo che le punte della colonna si trovino nelle provette corrispondenti. Caricare 20 microlitri di soluzione di solfato su ciascuna colonna, assicurandosi che la soluzione raggiunga la superficie del materiale della colonna.
Lavare la soluzione di solfato nel materiale della colonna con 50 microlitri di tampone acetato di sodio. È molto importante che il solfato venga lavato nella colonna. L'enzima deve essere sulla colonna per reagire ai glucosinolati intatti legati sulla colonna.
Una volta che la soluzione di solfato è stata lavata su ciascuna colonna, coprire le colonne con un foglio di alluminio. Lasciare riposare le colonne per una notte. Quindi, alludere ai desolfo-glucosinolati di ciascuna colonna con due porzioni da 0,75 millilitri di acqua ultrapura.
Una volta che le colonne si sono asciugate, rimuovere il rack della colonna e tappare ogni provetta. Congelare le provette in azoto liquido o a 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Liofilizzare i campioni per 12-24 ore.
Sciogliere ogni residuo in 1 millilitro di acqua ultrapura. E poi trasferire ogni campione e riferimento su fiale di campioni HPLC etichettate. Separare gli estratti su una colonna CAT a fase inversa.
Utilizzare una lunghezza d'onda di rilevamento di 229 nanometri. Una volta separati mediante HPLC, i glucosinolati possono essere identificati confrontando i tempi di ritenzione e gli spettri UV con gli standard noti dei glucosinolati. Le concentrazioni di glucosinolati nel campione sono calcolate da una curva di calibrazione del sinogramma e dai valori di letteratura per i fattori di risposta.
Da questo si possono determinare le concentrazioni di glucosinolati nel campione originale della pianta. Nelle condizioni HPLC utilizzate, la progoitrina malsana allude abbastanza presto e viene separata dalla glucorafanina biologicamente benefica. Anche gli endoglucosinolati sono ben separati.
Si osservano serie liotropiche con legami a catena laterale crescenti per alconolo, metilfol-alconolo e metil-solfinolo-glucosinolati a catena più lunga. I glucosinolati sconosciuti possono quindi essere provvisoriamente classificati in base a queste serie liotropiche in combinazione con spettri UV. Con un'adeguata preparazione, è possibile estrarre da 150 a 200 campioni da una persona in un giorno lavorativo.
Ci vorrà un altro giorno per alludere alle colonne, liofilizzare i campioni e prepararli per l'HPLC. Seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi, come la LCMS, per identificare i desulfo-glucosinolati sconosciuti nel cromatogramma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre i glucosinolati dai tuoi campioni biologici e analizzarli tramite HPLC.
Non dimenticare che lavorare con il metanolo può essere estremamente pericoloso e dovrebbe essere sempre fatto sotto la cappa aspirante.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'estrazione di glucosinolati da materiali vegetali mediante cromatografia liquida ad alta pressione. Il metodo è stato progettato per essere semplice e applicabile a diversi tipi di campioni biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ecologia pianta-insetto
- Patologia vegetale
- Scienze alimentari
Sfondo
- I glucosinolati sono composti importanti nelle piante.
- Svolgono un ruolo nei meccanismi di difesa delle piante.
- Comprendere la loro concentrazione può essere utile in vari studi biologici.
- Questo protocollo è stato convalidato per un'ampia gamma di campioni.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'estrazione e l'analisi delle glucosinolati.
- Facilitare la ricerca in ambiti legati alle piante.
- Permettere la quantificazione dei glucosinolati in campioni diversificati.
Metodi Utilizzati
- Preparazione del gel di destrina e della soluzione di solfatasio.
- Estrazione del campione utilizzando metanolo e sonificazione.
- Chromatografia liquida ad alta pressione per l'analisi.
- Confronto dei tempi di ritenzione e degli spettri UV con standard.
Risultati principali
- Estrazione riuscita di glucosinolati da materiali vegetali.
- Convalida del metodo su diversi campioni biologici.
- Identificazione dei glucosinolati mediante HPLC.
- Potenziali applicazioni in ecologia e scienze alimentari.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per l'analisi dei glucosinolati.
- Può essere utilizzato in diversi contesti di ricerca.
- Studi futuri possono ampliarne le applicazioni nelle scienze vegetali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Una quantificazione accurata delle glucosinolati supporta la validazione degli obiettivi nella scoperta di composti bioattivi di origine vegetale, consentendo una riduzione del rischio meccanicistica nei candidati nutraceutici e nei protettori vegetali. Questo metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva nell'identificazione di profili di glucosinolati benefici rispetto a quelli dannosi, orientando l'individuazione dei composti promettenti e la selezione del portafoglio in ambito di biotecnologie agricole e sviluppo di alimenti funzionali. La sua ampia applicabilità su tessuti vegetali e campioni biologici migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla valutazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche collegando specifiche strutture di glucosinolati ad attività biologiche come il progoitrina (dannoso) o il glucorafanina (benefico).
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la quantificazione affidabile di glucosinolati integri dopo l'inattivazione della mirosinasi e il trattamento con sulfatasi.
- Valore predittivo: Favorisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi generando dati quantitativi per l'analisi delle relazioni struttura-attività.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi fornendo desulfoglucosinolati adatti al rilevamento e alla quantificazione mediante HPLC.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio attraverso curve di calibrazione basate sulla sinigrina e fattori di risposta stabiliti.
- Scalabilità: Consente l'elaborazione di 150–200 campioni per persona al giorno, supportando la prontezza per schermature ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega il profiling delle glucosinolati nella fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso sistemi rilevanti per la malattia nelle scienze fitopatologiche e alimentari.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione identificando prodotti di degradazione dannosi (ad esempio, nitrili) rispetto a quelli benefici (ad esempio, isotiocianati), in base ai profili delle glucosinolati.
- Allineamento dei Biomarcatori: Permette lo sviluppo traslazionale di biomarcatori correlando le concentrazioni di glucosinolati con gli esiti fenotipici in studi ecologici e di miglioramento genetico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto attivo e al supporto preclinico, in particolare nei processi di sviluppo di nutraceutici e caratteristiche delle colture.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi metabolici quantificando i profili di glucosinolati che determinano la formazione di prodotti di degradazione bioattivi.
- Screening: Fornisce output quantitativi pronti per il saggio mediante HPLC con rilevamento PDA/UV, consentendo una valutazione affidabile dei composti in diverse matrici vegetali.
- Analisi: Fornisce letture misurabili (tempi di ritenzione, spettri UV, calcoli di concentrazione) che permettono il confronto tra diverse condizioni e la classificazione basata sulla struttura.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso applicazioni nella sicurezza alimentare e nella salute delle piante, dove i prodotti di degradazione dei glucosinolati influenzano gli esiti biologici.
- Riutilizzo Aziendale: Funziona come piattaforma analitica riutilizzabile grazie all'uso di attrezzature di laboratorio standard e alla compatibilità con un'ampia varietà di campioni (piante, suolo, alimenti).
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'identificazione di composti bioattivi.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità tra laboratori mediante l'uso di attrezzature accessibili.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di composti bioattivi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate sulla quantificazione validata di glucosinolati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella preparazione dei campioni vegetali, nel trattamento enzimatico e nell'uso dell'HPLC.
- Presuppone l'accesso a centrifughe, bagni termostatici, bagni ad ultrasuoni, liofilizzatori e sistemi HPLC con rilevamento PDA/UV.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi di estrazione, l'incubazione con sulfatasi e la preparazione delle curve di riferimento.
- Comporta considerazioni di adattamento per matrici vegetali diverse (foglia, seme, radice) e campioni non vegetali (suolo, alimenti).
- Comprende limitazioni pratiche, come i rischi associati alla manipolazione del metanolo che richiede l'uso della cappa chimica e il passaggio di liofilizzazione della durata di 12–24 ore, che influisce sui tempi di analisi.
