Un metodo semplice per glucosinolati estrazione e l'analisi con alta pressione cromatografia liquida (HPLC)
March 15th, 2017
Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo consolidato e robusto per l'estrazione di glucosinolati da materiali vegetali macinati. Dopo un trattamento con solfatasi in colonna degli estratti, i desulfoglucosinolati vengono eluiti e analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di eseguire un'analisi semplice e diretta dei glucosinolati nelle piante e in altri campioni biologici. Questo metodo, per estrarre e analizzare i glucosinolati, può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nell'ecologia degli insetti vegetali, nella patologia vegetale, nella selezione delle piante e nelle scienze alimentari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ben convalidata e ampiamente applicabile a un'ampia gamma di campioni biologici.
Sebbene questo metodo sia utilizzato principalmente per quantificare i glucosinolati nei materiali vegetali, può essere applicato anche ai terreni o agli alimenti preparati. Questa procedura di estrazione può essere eseguita in quasi tutti i laboratori perché si utilizzano principalmente attrezzature di laboratorio standard. In generale, le persone che non conoscono questo metodo eseguiranno meglio le analisi e l'ispezione quando leggono e osservano il film almeno una volta.
Per iniziare la procedura, mescolare 10 grammi di gel di destrina reticolata G-25 con 125 millilitri di acqua ultrapura. Conservare il composto in una bottiglia con tappo a 4 gradi Celsius. Quindi, sciogliere 10.000 unità di arilsulfatasi di tipo H-1 in 30 millilitri di acqua ultrapura.
Aggiungete a questo 30 millilitri di etanolo assoluto e mescolate bene il composto. Centrifugare il composto a 2, 650 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente. Unire il surnatante con 90 millilitri di etanolo assoluto in un becher.
Mescolare e versare le nuove provette da centrifuga. Centrifugare la miscela a 1,030 volte G per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
Sciogliere e unire i pellet in un totale di 25 millilitri di acqua ultrapura. Agitare bene il composto e poi trasferire il composto in tubi da 1 millilitro. Conservare i campioni di solfato a 20 gradi Celsius per un massimo di un anno.
Successivamente, pesare circa 90 milligrammi di sinogramma e registrare il peso con una precisione di 1 microgrammo. Quindi, sciogliere il sinogramma monoidrato in 10 millilitri di acqua ultrapura. Preparare da questa soluzione madre di sinogramma cinque soluzioni di riferimento con concentrazioni comprese tra 50 e 750 micromolari.
Conservare le soluzioni di riferimento in provette da 1,5 millilitri a 20 gradi Celsius. Quindi, per ogni campione e riferimento, etichettare una provetta per microcentrifuga da 2 millilitri in una posizione di rack a colonna. Forare il tappo di ogni provetta per microcentrifuga con un ago da dissezione per la successiva liofilizzazione.
Posizionare i tubi etichettati in un blocco con la stessa configurazione e spaziatura delle colonne etichettate. Per preparare le colonne per pipette in vetro, utilizzare un'asta di legno o di vetro per premere delicatamente un pezzo di lana di vetro di 1 centimetro per 1 centimetro nella pipetta. Imballare la lana di vetro nel passaggio dal cilindro della pipetta allo stelo.
Posizionare una colonna per pipette in ciascuna posizione etichettata sul rack. Posizionare la griglia su un vassoio di scarto. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta di plastica da 1 millilitro.
Agitare bene il gel di destrina preparato. E poi usa la punta della pipetta allargata per caricare 0,5 millilitri di gel di destrina preparato in ciascuna colonna. Controllare le colonne per verificare la presenza di perdite di gel di destrina e sostituire eventuali colonne che perdono.
Una volta che tutte le colonne sono state caricate con gel di destrina, lavare ogni colonna con 1 millilitro di acqua ultrapura. Pesare tra 50 e 100 milligrammi di materiale vegetale a passo libero, finemente macinato in una provetta di reazione da 2 millilitri con tappo di sicurezza, e registrare il peso con una precisione di 0,1 milligrammi. Posizionare due sfere metalliche di 3 millimetri di diametro in ogni tubo.
Aggiungere a ciascun tubo 1 millilitro di metanolo al 70% in acqua ultrapura e agitare brevemente ogni miscela. Chiudere i tubi con tappi di sicurezza aggiuntivi e metterli immediatamente in un bagnomaria a 90-92 gradi Celsius. Scaldare i tubi fino a quando la sega inizia a bollire.
Trasferire le provette in un bagno a ultrasuoni e riscaldare sonicamente i campioni per 15 minuti. Durante la sonicazione, iniziare a scongelare il campione di solfato e i riferimenti ai sinogrammi. Dopo la sonicazione, centrifugare i campioni a 2.700 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente.
Caricare i surnatanti e i riferimenti al sinogramma scongelati sulle colonne corrispondenti, facendo attenzione a non aspirare materia vegetale nella pipetta. Aggiungere 1 millilitro di metanolo al 70% in ogni tubo. Agitare le miscele.
E gli ultrasuoni riscaldano le miscele per 15 minuti. Centrifugare nuovamente le provette nelle stesse condizioni di prima. Caricare i surnatanti sulle colonne corrispondenti.
Aggiungere due porzioni da 1 millilitro di metanolo al 70% a ciascuna colonna, lasciando che le colonne si asciughino tra una porzione e l'altra. Lavare il metanolo residuo da ogni colonna con 1 millilitro di acqua ultrapura. Quindi, lavare ogni colonna con due porzioni da 1 millilitro di tampone acetato di sodio 20 millimolare, pH 5,5.
Una volta che le ultime porzioni di tampone in acetato di sodio sono state scaricate nel rack dei rifiuti, rimuovere il rack dal vassoio dei rifiuti e asciugare i piedini del rack con un fazzoletto. Posizionare il rack sul blocco di provette per microcentrifuga etichettate, in modo che le punte della colonna si trovino nelle provette corrispondenti. Caricare 20 microlitri di soluzione di solfato su ciascuna colonna, assicurandosi che la soluzione raggiunga la superficie del materiale della colonna.
Lavare la soluzione di solfato nel materiale della colonna con 50 microlitri di tampone acetato di sodio. È molto importante che il solfato venga lavato nella colonna. L'enzima deve essere sulla colonna per reagire ai glucosinolati intatti legati sulla colonna.
Una volta che la soluzione di solfato è stata lavata su ciascuna colonna, coprire le colonne con un foglio di alluminio. Lasciare riposare le colonne per una notte. Quindi, alludere ai desolfo-glucosinolati di ciascuna colonna con due porzioni da 0,75 millilitri di acqua ultrapura.
Una volta che le colonne si sono asciugate, rimuovere il rack della colonna e tappare ogni provetta. Congelare le provette in azoto liquido o a 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Liofilizzare i campioni per 12-24 ore.
Sciogliere ogni residuo in 1 millilitro di acqua ultrapura. E poi trasferire ogni campione e riferimento su fiale di campioni HPLC etichettate. Separare gli estratti su una colonna CAT a fase inversa.
Utilizzare una lunghezza d'onda di rilevamento di 229 nanometri. Una volta separati mediante HPLC, i glucosinolati possono essere identificati confrontando i tempi di ritenzione e gli spettri UV con gli standard noti dei glucosinolati. Le concentrazioni di glucosinolati nel campione sono calcolate da una curva di calibrazione del sinogramma e dai valori di letteratura per i fattori di risposta.
Da questo si possono determinare le concentrazioni di glucosinolati nel campione originale della pianta. Nelle condizioni HPLC utilizzate, la progoitrina malsana allude abbastanza presto e viene separata dalla glucorafanina biologicamente benefica. Anche gli endoglucosinolati sono ben separati.
Si osservano serie liotropiche con legami a catena laterale crescenti per alconolo, metilfol-alconolo e metil-solfinolo-glucosinolati a catena più lunga. I glucosinolati sconosciuti possono quindi essere provvisoriamente classificati in base a queste serie liotropiche in combinazione con spettri UV. Con un'adeguata preparazione, è possibile estrarre da 150 a 200 campioni da una persona in un giorno lavorativo.
Ci vorrà un altro giorno per alludere alle colonne, liofilizzare i campioni e prepararli per l'HPLC. Seguendo questa procedura, è possibile applicare altri metodi, come la LCMS, per identificare i desulfo-glucosinolati sconosciuti nel cromatogramma. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre i glucosinolati dai tuoi campioni biologici e analizzarli tramite HPLC.
Non dimenticare che lavorare con il metanolo può essere estremamente pericoloso e dovrebbe essere sempre fatto sotto la cappa aspirante.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'estrazione di glucosinolati da materiali vegetali utilizzando la cromatografia liquida ad alta pressione. Il metodo è progettato per essere semplice e applicabile a vari campioni biologici.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Ecologia pianta-insetto
- Patologia vegetale
- Scienze alimentari
Sfondo
- I glucosinolati sono composti importanti nelle piante.
- Giocano un ruolo nei meccanismi di difesa delle piante.
- Comprendere la loro concentrazione può aiutare in vari studi biologici.
- Questo protocollo è validato per un'ampia gamma di campioni.
Obiettivo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per l'estrazione e l'analisi dei glucosinolati.
- Facilitare la ricerca nei campi relativi alle piante.
- Consentire la quantificazione dei glucosinolati in diversi campioni.
Metodi utilizzati
- Preparazione del gel di dextrina e della soluzione di sulfatasi.
- Estrazione del campione utilizzando metanolo e sonicazione.
- Cromatografia liquida ad alta pressione per l'analisi.
- Confronto dei tempi di ritenzione e degli spettri UV con gli standard.
Risultati principali
- Estrazione riuscita di glucosinolati da materiali vegetali.
- Validazione del metodo su vari campioni biologici.
- Identificazione dei glucosinolati tramite HPLC.
- Possibili applicazioni in ecologia e scienze alimentari.
Conclusioni
- Il protocollo è efficace per l'analisi dei glucosinolati.
- Può essere utilizzato in vari contesti di ricerca.
- Ulteriori studi possono espandere le sue applicazioni nelle scienze vegetali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of glucosinolates supports target validation in plant-based bioactive compound discovery, enabling mechanistic de-risking of nutraceutical and crop protection candidates. This method provides predictive confidence in identifying beneficial versus detrimental glucosinolate profiles, informing lead identification and portfolio triage in agricultural biotechnology and functional food development. Its broad applicability across plant tissues and biological samples enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glucosinolate structures to biological activities such as progoitrin (detrimental) or glucoraphanin (beneficial).
- Operational Value: Supports biological de-risking through reliable quantification of intact glucosinolates after myrosinase inactivation and sulfatase treatment.
- Predictive Value: Facilitates predictive confidence in target validation by generating quantitative data for structure-activity relationship analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by delivering desulfoglucosinolates suitable for HPLC-based detection and quantification.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through sinigrin-based calibration curves and established response factors.
- Scalability: Enables processing of 150–200 samples per person per day, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glucosinolate profiling to preclinical validation through disease-relevant systems in plant pathology and food sciences.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying harmful breakdown products (e.g., nitriles) versus beneficial ones (e.g., isothiocyanates) based on glucosinolate profiles.
- Biomarker Alignment: Enables translational biomarker development by correlating glucosinolate concentrations with phenotypic outcomes in ecological and breeding studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical support, particularly in nutraceutical and crop trait development pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying glucosinolate profiles that determine bioactive breakdown product formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via HPLC with PDA/UV detection, enabling reliable compound evaluation across diverse plant matrices.
- Analytics: Provides measurable readouts (retention times, UV spectra, concentration calculations) that allow cross-condition comparison and structure-based classification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through applications in food safety and plant health, where glucosinolate breakdown products influence biological outcomes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical platform due to its reliance on standard lab equipment and broad sample compatibility (plant, soil, foodstuffs).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in bioactive compound identification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across laboratories using accessible equipment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bioactive compound development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated glucosinolate quantification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant sample preparation, enzymatic treatment, and HPLC operation.
- Depends on access to centrifuges, water baths, ultrasonic baths, freeze-dryers, and HPLC systems with PDA/UV detection.
- Necessitates cross-team standardization of extraction timing, sulfatase incubation, and reference curve preparation.
- Involves adaptation considerations for varying plant matrices (leaf, seed, root) and non-plant samples (soil, foodstuffs).
- Includes practical limitations such as methanol handling hazards requiring fume hood use and the 12–24 hour freeze-dry step affecting turnaround time.
