Name: Un metodo semplice per glucosinolati estrazione e lanalisi con alta pressione cromatografia liquida (HPLC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Impara un metodo semplice per l'estrazione e l'analisi dei glucosinolati nelle piante mediante cromatografia liquida ad alta pressione. Questa tecnica validata è applicabile a campioni biologici diversi per studi di ecologia e scienze alimentari.

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NMvD ringrazia il Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germania) per aver fornito i primi campioni di riferimento quando ha iniziato a utilizzare questo metodo 16 anni fa. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Paesi Bassi), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, Paesi Bassi) e Christian Ristok (iDiv, Lipsia) sono riconosciuti per aver migliorato il protocollo nel corso degli anni. Mirka Macel e Martine Huberty (Università di Tubinga, Germania) sono state autorizzate a utilizzare il cromatogramma Rorippa. Gli autori ringraziano il Centro tedesco per la ricerca sulla biodiversità integrativa (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, finanziato dalla Fondazione tedesca per la ricerca (FZT 118).

1. Preparazione di soluzioni necessarie per l&#39;estrazione glucosinolati <ol><li> Preparare 500 ml di 70% di metanolo (MeOH) in acqua (ultrapure) in una bottiglia di vetro. Per 100 campioni e 5 standard, 420 ml di 70% MeOH è necessaria. </li><li> Preparare 20 mM acetato di sodio (NaOAc) (pH = 5,5) aggiungendo 0,82 g di NaOAc o 1,36 g di NaOAc x 3 H 2 O in 500 mL di acqua; regolare il pH con acido cloridrico (HCl). Conservare il NaOAc in frigorifero. Per è necessario 100 campioni e 5 standard, 370 ml di 20 mm NaOAc (pH = 5,5) in acqua. </li><li> Per preparare il materiale della colonna, mescolare 10 g di gel di destrano reticolato (tipo G-25) con 125 ml di acqua ultrapura. Conservare la miscela risultante in frigorifero (4 ° C). </li><li> Preparazione della soluzione solfatasi <ol><li> Sciogliere 10.000 unità di aril solfatasi (tipo H-1 da Helix pomatia) in 30 ml di acqua ultrapura e aggiungere 30 ml di etanolo assoluto (EtOH). Mescolare bene la soluzione e trasferirlo ad una cen 250 mLtubo trifuge o più tubi più piccoli, a seconda della disponibilità. </li><li> Centrifugare la miscela a 2.650 xg per 20 min a temperatura ambiente (RT). Trasferire il surnatante (s) in un becher; aggiungere 90 ml di EtOH e mescolare. Centrifugare la miscela in uno o più tubi centrifugare a 1.030 xg per 15 minuti a RT. </li><li> Eliminare il surnatante. Sciogliere e combinare i pellets in un totale di 25 ml di acqua ultrapura. Vortex bene, dispensare in 1 ml tubi, e conservare in un congelatore a -20 ° C; si conserva per almeno un anno. </li></ol></li><li> Preparazione della soluzione di riferimento sinigrina <ol><li> Pesare in circa 9 mg di monoidrato sinigrina con 1-mcg precisione (ad esempio, 8,769 mg). Trasferire in un matraccio tarato da 10 ml e sciogliere il monoidrato sinigrina in 10,0 ml di acqua ultrapura. </li><li> Calcolare la molarità della soluzione di riserva e preparare cinque riferimenti sinigrina tra 50-750 micron diluendo della soluzione di riserva. Per un esempio dettagliato, vedere<html> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/20160918GrosservanDamJoVEGlucosinolates_S1.docx" target="_blank">Supplementare S1 file</a> . </li><li> Erogare i diversi riferimenti sinigrina in provette da 1,5 ml e congelarli a 20 ° C. Include una serie di cinque riferimenti sinigrina in ciascun lotto di estrazione. Utilizzare sempre i valori corretti per il molarità attualmente utilizzato sinigrina riferimenti per il calcolo delle concentrazioni. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del programma di installazione di estrazione <ol><li> Preparare una cremagliera colonna per le colonne pipette Pasteur (per la preparazione di colonne, vedere il punto 3.1). Etichetta il rack o le colonne per tenere traccia dei numeri di esempio (vedi Figura 1). </li><li> Preparare un blocco tenendo lo stesso numero di tubi microcentrifuga da 2 ml etichettati (vedi punto 3.3 e Figura 1) </li></ol>5 / 55425fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Rack per l&#39;estrazione di glucosinolati. Vista frontale (a sinistra) e vista dall&#39;alto (a destra) di un rack colonna di self-made e il blocco per l&#39;estrazione di glucosinolati. Altezza: 100 mm, la distanza tra i fori spostato (per contenere le colonne pipetta Pasteur): 30 mm (asse x) x 15 mm (asse y). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 3. Preparazione delle colonne e microprovette <ol><li> Preparare una colonna per campione e cinque colonne supplementari per i cinque campioni di riferimento sinigrina. <ol><li> In ogni pipetta di vetro, posto un pezzo di lana di vetro circa 1 cm x 1 cm. Utilizzare un bastone di legno o vetro per spingere la lana di vetro fino al punto in cui la pipetta si restringe. La lana di vetro dovrebbe evitare che il materiale colonna di esecuzione, ma non usare troppo, in quanto rallenta l&#39;eluizione delle colonne. Indossare guanti when lavorare con la lana di vetro. </li></ol></li><li> Posizionare le colonne sulla cremagliera della colonna (vedi Figura 1). Inserire la griglia di colonna in un vassoio laboratorio (vassoio dei rifiuti) per prendere gli eluenti utilizzati per i lavaggi delle colonne consecutive. </li><li> Tagliare i primi 5 mm al largo della punta di una plastica punta della pipetta da 1 ml e pipettare 0,5 mL del materiale della colonna preparata (G-25 gel in acqua, vedere il punto 1.3) in ogni colonna. Agitare il flacone contenente il materiale della colonna ben prima pipettaggio. Eliminare colonne perdite (materiale G-25 esaurendo attraverso lo strato di lana di vetro) e sostituirli con quelli nuovi. <ol><li> Dopo aver pipettato il materiale della colonna nelle colonne, aggiungere 1 ml di acqua ultrapura per irrigare giù il materiale. </li></ol></li><li> Preparare un tubo di reazione da 2 ml per campione e cinque tubi per i cinque campioni di riferimento sinigrina; etichettarli. Utilizzare un ago dissezione per fare buchi nei tappi per dopo liofilizzazione e posizionare i tubi preparate nel blocco tubo nella esattamente lo stesso modello come ilcolonne (passo 2.2, vedere la Figura 1). </li></ol> 4. Estrazione di glucosinolati <ol><li> Pesare liofilizzati e materiale vegetale finemente macinato (solitamente 50,0-100,0 mg di peso secco, le concentrazioni finali glucosinolati nell&#39;estratto dovrebbe essere nel range della curva di riferimento) con l&#39;approssimazione di 0,1 mg in 2 mL, etichettati, rotondo provette di reazione -bottom. Aggiungere due piccole sfere di metallo (3 mm di diametro) come ritardanti bollente ad ogni provetta. NOTA: Il protocollo può essere applicato anche a materiali freschi flash congelato, che sono stati terreno sotto azoto liquido e mantenuti congelati fino estrazione. Aumentare la quantità di materiale pesato per l&#39;estrazione e la percentuale di MeOH nel liquido di estrazione al 85% per compensare la diluizione con l&#39;acqua nei materiali 19. </li><li> Pipettare 1 ml di 70% MeOH in ciascuna provetta e vortex brevemente. Chiudere i tubi e chiuderli con tappi di sicurezza prima di loro il più rapidamente possibile in un caldo wBagno Ater (90-92 ° C) per un paio di minuti (~ 5 min), fino a quando il 70% MeOH incomincia a bollire. Attenzione: Indossare occhiali di sicurezza durante questa fase! </li><li> Mettere le provette dei campioni in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti. Nel frattempo, prendere la solfatasi e cinque campioni di riferimento sinigrina fuori dal freezer per scongelare loro a RT. </li><li> Dopo ultra-sonicazione, centrifugare le provette dei campioni a 2.700 xg in una centrifuga da banco per 10 minuti a temperatura ambiente; un pellet dovrebbe formare in ogni provetta. Aggiungere il surnatante alle colonne etichettate e pipetta i campioni di riferimento cinque su colonne separate. <ol><li> Mentre pipettando il surnatante, mantenere la punta ben oltre il pellet per evitare materiali vegetali pipettaggio. Si noti che quando si utilizzano campioni essiccati, il volume surnatante sarà inferiore a 1,0 mL. </li></ol></li><li> Aggiungere 1 ml di 70% MeOH ai rimanenti palline nei tubi campione e vortice i tubi prima di metterli in un bagno ad ultrasuoni per 15 minuti. Centrifugare le provette di nuovo, come al punto 4.4, e aggiungere la Supernaabi- alle rispettive colonne; a causa delle proprietà del materiale della colonna, il gruppo solfato carica negativa dei glucosinolati sarà specificamente trattenuti sulla colonna. </li><li> Lavare le colonne con gli estratti in tre fasi sequenziali. <ol><li> Pipettare 2 x 1 ml di 70% MeOH su ciascuna colonna. Attendere che la colonna di funzionare a secco prima di aggiungere i prossimi 1 ml; Questa operazione rimuoverà più composti apolari dagli estratti (ad esempio, clorofilla). </li><li> Lavare il MeOH con l&#39;aggiunta di 1 ml di acqua ultrapura per ogni colonna. </li><li> Pipettare 2 x 1 ml di 20 mm NaOAc tampone per ogni colonna di creare le condizioni ottimali per la reazione di solfatasi. </li></ol></li><li> Prendere la cremagliera con le colonne dal vassoio di rifiuti e asciugare i piedi del rack con un fazzoletto di carta. Inserire la griglia sopra il blocco con fiale e tubi etichettati. Assicurarsi che ogni punta colonna è nella, l&#39;etichetta, il tubo corrispondente a 2 ml (vedi Figura 1). </li><li> Aggiungere 20 ml di solfatasi solutia colonne. Assicurarsi che il solfatasi raggiunge la superficie del materiale colonna. Pipettare 50 ml di NaOAc tampone su ogni colonna per irrigare giù per la solfatasi. Coprire le colonne con un foglio di alluminio e lasciate riposare per una notte. NOTA: A causa delle attività della solfatasi, il gruppo solfato verrà rimosso, rilasciando le desulfoglucosinolates dalla colonna in modo che possano eluire con l&#39;acqua. Per una descrizione dettagliata, vedere Crocoll et al. 19. </li><li> Il giorno successivo, eluire gli desulfoglucosinolates pipettando 2 x 0,75 ml di acqua ultrapura su ogni colonna. Quando tutte le colonne sono funzionare a secco, alzare la cremagliera della colonna e rimuoverlo dai tubi di reazione. <ol><li> Tappare le provette (assicurarsi che non vi siano fori nei tappi) e congelarli in azoto liquido o in un congelatore -80 ° C per 30 min. Liofilizzare i campioni per 12-24 h (a seconda del numero di campioni e la capacità del blocco-drier) per rimuovere tutta l&#39;acqua. </li></ol></li> &lt;li&gt; Dopo liofilizzazione, ri-sciogliere il residuo in un volume esatto (di solito 1.0 mL) di acqua ultrapura. Trasferire i campioni e le cinque riferimenti sinigrina di fiale HPLC etichettati. Conservare i campioni in frigorifero (4 ° C) per un massimo di due settimane o un congelatore (-20 ° C) fino ad un anno prima analisi con HPLC. </li><li> Lasciate che il vetro colonne asciugare sotto il cofano durante la notte e li smaltire una volta asciutto. Recuperare le sfere di metallo dai tubi di esempio utilizzati nella fase 4.5 per il riutilizzo e mettere i tubi nel bidone dei rifiuti. </li></ol> 5. Le misurazioni HPLC di estratti campioni <ol><li> Separare glucosinolati su un C 18 colonna a fase inversa (4,6 x 150 mm, 3 micron, 300 Å) con un gradiente di acetonitrile-acqua (vedi Tabella 1) ed una portata di 0,75 mL / min e una temperatura della colonna di 40 ° C . Eseguire il rilevamento e la quantificazione a 229 nm. </li><li> Misurare i riferimenti sinigrina sulla stessa colonna ma con un gradiente adattatometodo per ridurre l&#39;uso di solventi (vedere Tabella 2). Inizia con l&#39;iniezione di cinque riferimenti sinigrina, a cominciare con il riferimento con la concentrazione più bassa. Poi iniettare i campioni, compresa una iniezione di metanolo (blank) dopo ogni campione decimo per pulire la colonna e per evitare il riporto di picchi. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo [min] </td><td> Portata [mL / min] </td><td> % A Acqua </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 35 </td><td> 0.750 </td><td> 65 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Colonna Temperatura 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabella 1: gradiente Acetonitrile-acqua per la separazione dei glucosinolati e analisi des su HPLC in fase inversa. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Tempo [min] </td><td> Portata [mL / min] </td><td> % A Acqua </td><td> % B ACN </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.750 </td><td> 89.3 </td><td> 10.7 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 0.750 </td><td> 98 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> Colonna Temperatura 40 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabella 2: abbreviato gradiente di acetonitrile-acqua per la quantificazione dei cinque riferimenti sinigrina utilizzati per la quantificazione dei glucosinolati. 6. glucosinolati identificazione e quantificazione <ol><li> Identificazione <ol><li> Confrontare gli spettri UV e tempi di ritenzione dei picchi nei campioni con risultato in commerciocapaci, riferimenti glucosinolati puri. Vedere la Figura 2 per gli esempi di spettri UV delle varie classi di glucosinolati. </li><li> Identificare i glucosinolati sconosciuti con gli standard di riferimento o LC-MS 18, 19, se possibile. </li><li> Identificare i glucosinolati sconosciuti con la risonanza magnetica nucleare (NMR), se possibile. </li><li> Confrontare gli spettri UV e tempi di ritenzione dei picchi con quelli nella Figura 2 e Tabella 3 riferimenti, basi di dati, o la letteratura. </li></ol></li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig2.jpg" /> Figura 2. spettri UV delle classi glucosinolati più comuni. spettri di assorbimento UV (200-350 nm) di sei desulfoglucosinolates (GSL), basata su soluzioni fatte di composti di riferimento disponibili in commercio estratti come descritto qui, che rappresentano le classi strutturali più comuni. Il nome comune, sNome STRUTTURALI (tra parentesi), e la classe strutturale sono dati. (A) sinigrina (2-propenil GSL), alchenile; (B) glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL), thioalkenyl; (C) glucorafanina (4-methylsulfinlybutyl GSL), sulfinilico; (D) glucobrassicin (indol-3-ilmetil GSL) indolo; (E) gluconasturtiina (2-phenylethyl GSL), aromatico; (F) sinalbina (4-idrossibenzile GSL), aromatico. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="2"><li> quantificazione <ol><li> Integrare l&#39;area sotto le cime delle cinque riferimenti sinigrina e dei campioni. </li><li> Calcolare una curva di calibrazione dei cinque riferimenti sinigrina misurati in base alla zona integrata. Utilizzare l&#39;equazione della retta di regressione (vedi Equazione 1) per calcolare la quantità interpolata di glucosinolati (vedi equazione 2).</li><li> Per calcolare la concentrazione dei vari glucosinolati, moltiplicare la quantità interpolato (x) per il fattore di risposta (M) per il rilevamento a 229 nm da CE (1990) 16, Buchner (1987) 15, o Brown et al. (1993) 17; i fattori di risposta consenso dei desulphoglucosinolates più comunemente rilevati sono riportati nella tabella 3. NOTA: I fattori di risposta possono variare tra i sistemi-questa può essere la ragione che ci sono valori diversi dati da diversi riferimenti (vedi Bibliografia 15-17). Tuttavia, i valori sono principalmente abbastanza vicino e in una gamma simile con classi strutturali. Dopo la convenzione, impostare il fattore di risposta di glucosinolati non identificati a 1, anche se per glucosinolati indolici sconosciuti con uno spettro UV simile a quella di glucobrassicin e altri glucosinolati indolici (figura 2), sarebbe consigliabile usare 0,25 come fattore di risposta per ottenereuna stima realistica della concentrazione (tabella 3). </li><li> Per calcolare la quantità finale di glucosinolati (x t) nel campione, prendere il fattore di diluizione (D) e la massa di campione (w) utilizzato per l&#39;analisi in considerazione (vedi Equazione 3). <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq1.jpg" /> (1) <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq2.jpg" /> (2) <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55425/55425eq3.jpg" /> (3) y = area del picco m = pendenza della curva di regressione a 5 punti di riferimento c = l&#39;intercetta della retta di regressione con l&#39;asse y x = quantità di glucosinolati nell&#39;estratto x t = concentrazione di glucosinolati nel campione impianto D = fattore di diluizione M = fattore di risposta per la rivelazione a 229 nm da Buchner (1987) o Brown et al. (1993) w = massa del campione utilizzato per l&#39;estrazione </li></ol></li></ol>

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<li>Gols, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1439179106000892">Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions.</a> Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I più grandi vantaggi di questo metodo consolidata e ampiamente utilizzato sono che è robusto, piuttosto semplice, e relativamente a basso costo per campione. La maggior parte delle attrezzature necessarie per l&#39;estrazione e l&#39;analisi dovrebbero essere disponibili in un laboratorio standard o può essere auto-costruito, con l&#39;eccezione della HPLC-PDA. Un altro vantaggio è che desulfoglucosinolates disciolti in acqua sono chimicamente abbastanza stabili conservato fresco e in (HPLC) flaconi ermetici, quindi gli estratti possono essere facilmente spediti per l&#39;analisi HPLC altrove. In contrasto con le piattaforme LC-MS, che richiedono una formazione specializzata e una vasta esperienza hands-on per la gestione del software e l&#39;analisi dei dati, HPLC-UV / PDA può essere eseguito facilmente dopo un breve periodo di formazione. Questo non solo riduce i costi del procedimento, ma anche rende questo metodo più accessibile ad una vasta gamma di scienziati, compresi gli studenti. In generale, quando le procedure sopra descritte sono seguite carefully, dovessero verificarsi alcuni problemi. In generale, i picchi glucosinolati sono molto ben separati nel cromatogramma. Se questo non è il caso, il programma gradiente potrebbe essere adattato diminuendo il tasso di aumento di acetonitrile in eluente. In alternativa, la costruzione di una nuova pre-colonna (200-500 iniezioni) o colonna (1.500 -2.000 iniezioni) potrebbe risolvere il problema. Di tanto in tanto, cromatogrammi di campioni singoli in un lotto possono mostrare molto piccolo o senza picchi. Questo è di solito a causa di errori di pipettamento quando si aggiunge il solfatasi (ad esempio, una colonna è stato ignorato o la solfatasi non è stato adeguatamente lavato giù nella colonna). In alternativa, la concentrazione glucosinolati nei materiali sperimentali può essere stata inferiore al previsto e troppo poco materiale è stato utilizzato per l&#39;estrazione. In quest&#39;ultimo caso, il volume di iniezione può essere aumentata a 100 microlitri, o potrebbe essere concentrata un&#39;aliquota esatta (es, 800 microlitri) dell&#39;estratto. Quest&#39;ultimo potrebbe essere ottenuto liofilizzarezione l&#39;estratto, sciogliendo il residuo in un volume più piccolo (ad esempio, 100 ml) di acqua, e reiniettando utilizzando la stessa curva di riferimento. Nei calcoli per la concentrazione originale dell&#39;estratto, i numeri devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione. Se questo non risolve il problema, i materiali devono essere estratti usando ancora più materiale di partenza. Se è superiore a 100 mg, il volume dei solventi di estrazione e le dimensioni dei tubi devono essere regolate in proporzione per mantenere l&#39;efficienza di estrazione. Un ulteriore vantaggio è che questo metodo è stato ben convalidato. Questo perché è stato descritto come un metodo standard per la quantificazione di glucosinolati in colza, per la quale sono state confermate le procedure e precisione in diversi laboratori 16. Inoltre, il background genetico, biosintesi e funzioni biologiche di glucosinolati sono soggetti a intensi sforzi di ricerca, in modEL thaliana specie di piante di Arabidopsis tra gli altri 4, 6, 12. Di conseguenza, molti fattori di risposta per l&#39;esatta quantificazione dei desulfoglucosinolates in relazione alla sinigrina sono ben definiti e disponibili al pubblico 15,17. Anche se protocolli LS-MS-based sono più high-throughput, più sensibile, e sono in grado di (indicativamente) identificare glucosinolati per cui non sono disponibili standard 18, 19, 20, la mancanza di fattori di risposta universali per LC-MS limita la la quantificazione esatta delle concentrazioni di glucosinolati 18. Inoltre, questi metodi di solito non includono una fase di liofilizzazione, e la quantità di acqua nel materiale vegetale fresco è dispersi nei calcoli, rendendo esatta quantificazione difficile. Infine, perché il nostro metodo di estrazione comporta una base di colonnapurificazione e fase di concentrazione, può essere applicato anche a campioni &quot;sporchi&quot; con basse concentrazioni di glucosinolati, come terreni 21. Rispetto ai metodi LC-MS-based che di solito estraggono appena materiali congelati, utilizzano piastre a 96 pozzetti per l&#39;estrazione, e non includono un passo solfatasi 18, 19, il nostro metodo è relativamente lungo e intenso lavoro. Con i rack delle colonne descritte in questo documento, una sola persona può estrarre circa 100-150 campioni in un solo giorno. Eluizione (giorno successivo), liofilizzazione (durante la notte), e ri-dissoluzione può avvenire entro i due giorni successivi. Con un iniettore automatico HPLC, un tempo di esecuzione e di equilibrio di 40-45 min per iniezione, e non eventi imprevisti, ci sarebbero voluti 3-4 giorni di tempo per acquisire i dati per questo set di esempio. Quando il software HPLC consente la quantificazione automatica basata sulla curva sinigrina, un controllo manuale dei cromatogrammi e peassegnazioni ak per 100 campioni possono richiedere solo un altro 1 o 2 ore prima che i dati possono essere utilizzati per le analisi statistiche. Nonostante la crescente disponibilità di standard di glucosinolati, solo una piccola frazione degli oltre 130 candidati attualmente può essere acquistato in commercio. Tuttavia, con alcuni riferimenti per ciascuna delle classi biosintetici; l&#39;accesso alle banche dati di letteratura che specificano i composti precedentemente trovato nelle specie vegetali (ad esempio, Fahey et al 22.); conoscenza di base dei principi cromatografici, come la logica della serie eluotropica (ad esempio, per i numeri di Cs crescente sulla catena laterale di composti alifatici, le figure 3 e 4); e la convalida di singoli campioni in LC-MS 19 o glucosinolati isolato su NMR 23, si può facilmente superare questo limite. La maggior parte dei protocolli per glucosinolati analisi utilizzare curve di riferimento interni(Cioè, una certa concentrazione per l&#39;estrazione di sinigrina o sinalbina del solvente di estrazione 16, 17, 19). Principalmente, le curve di riferimento interni sono più appropriate per correggere gli errori individuali di elaborazione del campione e quindi teoricamente produrre una maggiore precisione. Nonostante questo vantaggio, preferiamo usare una curva di riferimento esterno a cinque punti, come abbiamo spesso analizziamo diverse specie selvatiche, alcune delle quali contengono alti livelli di sinigrina (ad esempio, Brassica nigra 24) o sinalbina (ad esempio, Sinapis alba 25), il due riferimenti glucosinolati per i quali i fattori di risposta sono disponibili. Inoltre, aggiungendo standard interni per ogni campione aumenta il costo delle analisi, come standard di riferimento glucosinolati pregiati sono di solito abbastanza costosi. In conclusione, nonostante i passi in termini di tempo, questo protocollofornisce un metodo semplice e accessibile per estrarre e quantificare glucosinolati in campioni vegetali. Tuttavia, è importante considerare che i livelli glucosinolate stessi sono solo un&#39;indicazione del potenziale attività biologica, visto come la necessità di reagire con mirosinasi e variazione dei prodotti di reazione possono derivare da una singola glucosinolati 11. test di convalida devono essere effettuate per confermare la rilevanza biologica.

Si stima che le piante producono oltre 200.000 diversi tipi di composti chimici 1. Solo una minoranza di questi composti sembra giocare un ruolo nel metabolismo primario delle piante, che alimenta la crescita e la riproduzione; la maggioranza sono i cosiddetti metaboliti secondari. Nonostante il loro nome, metaboliti secondari sono spesso critici per la sopravvivenza delle piante e la riproduzione, in quanto servono per attirare gli impollinatori o per difendere la pianta contro gli agenti patogeni ed erbivori 1. I glucosinolati sono una classe molto eterogeneo di metaboliti secondari che sono stati studiati per oltre 150 anni 2. Ad oggi, più di 130 strutturalmente differenti glucosinolati sono stati identificati 3. In linea di massima, glucosinolati possono essere suddivise in diverse classi basate sulla aminoacido da cui sono sintetizzati. glucosinolati indolo, per esempio, sono sintetizzati dal amminoacidotriptofano, che fenilalanina fornisce lo scheletro di base per la sintesi di glucosinolati aromatici 4. All&#39;interno delle classi, vi è un elevato livello di diversità strutturale, che è causata da sequenziali passaggi catena allungamento nelle vie biosintetiche, come nella classe di glucosinolati alifatici, o da modifiche catena laterale (ad esempio, idrossilazione) 4, 5. Una specie di piante glucosinolati possono contenere fino a 37 diversi glucosinolati appartenenti a diverse classi strutturali 6. Anche se le specie vegetali hanno profili tipici glucosinolati, la variazione intraspecifica per i tipi di glucosinolati è frequente tra gli individui e le popolazioni 6, 7. Glucosinolati intatti vengono memorizzati nei vacuoli delle cellule vegetali e può essere trovato in qualsiasi organo o fuori terra ipogea 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. In caso di rottura delle cellule (ad esempio, da erbivori), glucosinolati vengono rilasciati e sono mescolati con la mirosinasi dell&#39;enzima, scatenando un olio di senape bomba a 10. Grazie all&#39;attività di mirosinasi, e in funzione della struttura del glucosinolato, le condizioni di reazione, e la presenza di enzimi modificanti, si formano composti pungenti, tossiche, nocive o diversi, quali nitrili e (iso) tiocianati 11. I prodotti di reazione hanno elevate attività biologiche; per esempio, servono come repellenti di insetti erbivori generalisti 12. L&#39;ereditabilità e biosintetici percorsi di glucosinolati sono ben studiati, soprattutto a causa della loro importanza per erbivori e resistenza ai patogeni, il loro valore come componenti aromatici a mostarde e cavoli, e il loro negativo (progoitrina) e gli effetti positivi (glucorafanina) sulla salute umana 5, </sup&gt; 13, 14. A causa del grande interesse glucosinolati come composti, estrazione e metodi di rilevamento biologicamente attivi basati su fase inversa liquida ad alta pressione cromatografia (HPLC) equipaggiato con ultravioletti (UV) o di fotodiodi (PDA) rivelatori sono stati comunemente usati dal 1980 15 . In base a questo metodo, le Comunità Europea ha emanato un protocollo standard che è stato testato e convalidato in diversi laboratori per l&#39;analisi dei glucosinolati nei semi oleosi (Brassica napus, colza, canola 16). Altri aggiunti a questo metodo (ad esempio, determinando fattori di risposta aggiuntive per glucosinolati che non sono presenti nella colza) 17. Nonostante la crescente disponibilità di cromatografia-spettrometria di massa piattaforme liquidi (LC-MS) e protocolli di high-throughput per l&#39;analisi dei glucosinolati 18 <sup&gt;, 19, il metodo HPLC-UV / PDA originale è ancora ampiamente utilizzato dagli scienziati. I motivi principali sono che questo metodo è semplice, conveniente e relativamente accessibile ai laboratori senza una vasta infrastruttura conoscenze chimico-analitica. Per servire questa comunità, noi qui dettaglio il protocollo per l&#39;estrazione di glucosinolati da materiali vegetali e l&#39;analisi delle loro desulfo forme con HPLC-PDA.

<table><tbody><tr><td>Metanolo HiPerSolv CHROMANORM® gradiente per HPLC VWR</td><td></td><td>20864.320</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di sodio (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302406-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>1.09057.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120-10G</td><td></td></tr><tr><td>(&minus;)-Sinigrina idrato dal rafano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1647-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Aril Sulfatasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9626-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>20816.298</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>Carl Roth</td><td>4518.1</td><td></td></tr><tr><td>Lana di vetro</td><td>Carl Roth</td><td>7377.1</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncino di vetro/legno</td><td>VWR</td><td>HERE1080766</td><td></td></tr><tr><td>provette di reazione da 2 mL</td><td>VWR</td><td>211-2120</td><td></td></tr><tr><td>Ago da dissezione</td><td>Carl Roth</td><td>KX93.1</td><td></td></tr><tr><td>Piastre da laboratorio Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>0772.1</td><td>Vassoio per rifiuti</td></tr><tr><td>Clip di sigillatura Rotilabo</td><td>Carl Roth</td><td>N217.1</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore Freezone 12 L</td><td>Labconco</td><td>7960030</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril grado super gradiente</td><td>VWR</td><td>83639.320</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>VWR</td><td>462-5112</td><td></td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB 15061</td><td></td></tr><tr><td>PH Elettrodo</td><td>Thermo Fisher Scientific STARA2115</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Heraeus Multifuge X1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>Pre-colonna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69697</td><td>Colonna C18 (4,6 x 10 mm, 5 &; micro; m, 300 &Aring;)&nbsp;</td></tr><tr><td>Colonna Acclaim 300</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60266</td><td>C18 colonna (4,6 x 150 mm, 3 &; micro; m, 300 &Aring;)&nbsp;</td></tr><tr><td>HPLC Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>con forno a colonna e rivelatore UV o PDA</td></tr><tr><td>Pallone 1.000 mL</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>Composti di riferimento glucosinolati</td><td>Phytoplan</td><td>vari</td><td>http://www.phytoplan.de/</td></tr></tbody></table>

un metodo semplice per glucosinolati estrazione e l&#39;analisi con alta pressione cromatografia liquida (hplc)

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

I glucosinolati sono una classe ben studiata e molto diversificata di composti vegetali naturali. Svolgono un ruolo importante nella resistenza delle piante, nella qualità dell'olio di colza, negli aromi alimentari e nella salute umana. L'attività biologica dei glucosinolati viene rilasciata in caso di danno tissutale, quando vengono miscelati con l'enzima mirosinasi. Ciò si traduce nella formazione di prodotti di degradazione pungenti e tossici, come isotiocianati e nitrili. Attualmente, sono stati identificati più di 130 glucosinolati strutturalmente diversi. La struttura chimica del glucosinolato è un importante determinante del prodotto che si forma, che a sua volta ne determina l'attività biologica. Quest'ultimo può variare da dannoso (ad esempio, progoitrina) a benefico (ad esempio, glucorafanina). Ogni specie vegetale contenente glucosinolati ha il suo profilo glucosinolato specifico. Per questo motivo, è importante identificare correttamente e quantificare in modo affidabile i diversi glucosinolati presenti nelle foglie brassicacee, nei semi e nelle radici o, per gli studi ecologici, nei loro parenti selvatici. Qui, presentiamo un metodo ben convalidato, mirato e robusto per analizzare i profili dei glucosinolati in un'ampia gamma di specie vegetali e organi vegetali. I glucosinolati intatti vengono estratti da materiali vegetali macinati con una miscela di metanolo e acqua ad alte temperature per disabilitare l'attività della mirosinasi. Successivamente, l'estratto risultante viene portato su una colonna a scambio ionico per la purificazione. Dopo il trattamento con solfatasi, i desolfoglucosinolati vengono eluiti con acqua e l'eluato viene liofilizzato. Il residuo viene assorbito in un volume esatto di acqua, che viene analizzato mediante cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) con un rivelatore a matrice di fotodiodi (PDA) o ultravioletto (UV). Il rilevamento e la quantificazione si ottengono effettuando confronti tra i tempi di ritenzione e gli spettri UV degli standard di riferimento commerciali. Le concentrazioni sono calcolate sulla base di una curva di riferimento della sinigrina e di fattori di risposta ben stabiliti. I vantaggi e gli svantaggi di questo metodo semplice, rispetto a metodi più veloci e tecnologicamente avanzati, sono discussi qui.

Questo metodo consente la rilevazione e la separazione di desulfoglucosinolates trovano comunemente in tutte le classi strutturali (Figura 3). Il dannosa 2-hydroxyglucosinolate progoitrina arriva relativamente presto nel cromatogramma ed è chiaramente separato dal glucorafanina glucosinolati benefica, l&#39;unica methylsulfinylglucosinolate in questo esempio. Sinigrina, gluconapin e glucobrassicanapin formano una serie eluotropica di glucosinolati alchenilici con lunghezza crescente catena laterale (C3, C4, C5 e, rispettivamente). Una serie logica simile è visibile per i due glucosinolati methylthioalkenyl, glucoiberverin (C3) e glucoerucin (C4). I picchi del tre glucosinolati indolici, glucobrassicin e suoi derivati ​​4-idrossi-1 e methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), sono chiaramente separati. Va notato che i picchi di neoglucobrassicin e glucoerucin, nonché gluconasturtiina, l&#39;unica gluco aromaticasinolate in questo esempio, sono particolarmente elevati in questo estratto Brassica dovuto all&#39;aggiunta di estratti di radice alla miscela 9. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig3.jpg" /> Figura 3: Cromatogramma di un estratto di glucosinolati. Dettaglio (1-32 min) di un cromatogramma HPLC risultante dall&#39;analisi di campioni combinati radice e sparare da Brassica nigra, B. rapa, e B. oleracea. Le etichette di punta indicano il tempo di ritenzione e le abbreviazioni per desulfoglucosinolates identificati (GSL). PRO = progoitrina (2-OH-3-butenil GSL); Raph = glucorafanina (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrina (2-propenil GSL), GNA = gluconapin (3-butenil GSL); 4OH = 4 hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin (3-methylthiopropyl GSL); GBN = glucobrassicanapin (4-pentenil GSL); ERU = glucoerucin (4-methylthiobutyl GSL); GBC = glucobrassicin (indolo-3-ylmethyl GSL); NAS = gluconasturtiina (2-phenylethyl GSL); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Più lunghe catene di glucosinolati metilsulfinil, che si trovano comunemente nella pianta modello Arabidopsis, mostrano anche una serie eluotropica, come si è visto in un estratto di radice di Rorippa austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8), e glucoarabin (C9) appaiono a intervalli regolari sul cromatogramma (Figura 4). Insieme con gli spettri UV dei picchi, tale serie logica eluotropica può essere utilizzato per classificare, e provvisoriamente identificare, glucosinolati sconosciuti. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55425/55425fig4.jpg" /> Figura 4: Cromatogramma (telaio 9-30 min) Dei desulfoglucosinolates in un estratto di radice austriaca Rorippa. Le etichette di punta indicano il tempo di ritenzione e le abbreviazioni per desulfoglucosinolates identificati (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (indolo-3-ylmethyl GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin (1-MeOH-glucobrassicin). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55425/55425fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome comune </td><td> Struttura della catena laterale </td><td> Rt (min) * </td><td> 229 nm </td><td> riferimento# </td></tr><tr><td> aliphatic glucosinolati </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucocapparin </td><td> metile </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> sinigrina </td><td> 2-propenile </td><td> 5.5 </td><td> 1 </td><td> Brown, CE </td></tr><tr><td> Gluconapin </td><td> 3-butenile </td><td> 9.5 </td><td> 1.11 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucobrassicanapin </td><td> 4-pentenil </td><td> 13.5 </td><td> 1.15 </td><td> CE </td></tr><tr><td> Glucoiberverin </td><td> 3-methylthiopropyl </td><td> 10.9 </td><td> 0.8 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> Glucoerucin </td><td> 4-methylthiobutyl </td><td> 14.0 </td><td> 0.9 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> Glucoiberin </td><td> 3-methylsulfinylpropyl </td><td> 3.7 </td><td> 1.2 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> glucorafanina </td><td> 4-methylsulfinylbutyl </td><td> 4.9 </td><td> 0.9 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> Glucoalyssin </td><td> 5-methylsulfinylpentyl </td><td> 7.6 </td><td> 0.9 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> Glucohesperin </td><td> 6-methylsulfinylhexyl </td><td> 10.5 </td><td> 1 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> Glucosiberin </td><td> 7-methylsulfinylheptyl </td><td> 13.5 </td><td> 1 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> Glucohirsutin </td><td> 8-methylsulfinyloctyl </td><td> 16.8 </td><td> 1.1 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> Glucoarabin </td><td> 9-methylsulfinylnonyl </td><td> 20.5 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> Glucocheirolin </td><td> 3-methylsulfonylpropyl </td><td> 4.2 </td><td> 0.9 </td><td> Marrone </td></tr><tr><td> progoitrina </td><td> 2 (R) -OH-3-butenile </td><td> 4.5 </td><td> 1.09 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Gluconapoleiferin </td><td> 2-OH-5-pentenile </td><td> 8.3 </td><td> 1 </td><td> CE </td&gt; </tr><tr><td> glucosinolati indolo </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4-hydroxyglucobrassicin </td><td> 4-hydroxyindol-3-ilmetil </td><td> 11.2 </td><td> 0,28 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucobrassicin </td><td> indol-3-ilmetil </td><td> 15.3 </td><td> 0,29 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> 4-Methoxyglucobrassicin </td><td> 4-methoxyindol-3-ilmetil </td><td> 18.2 </td><td> 0.25 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> Neoglucobrassicin </td><td> 1-methoxyindol-3-ilmetil </td><td> 22.5 </td><td> 0.2 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> glucosinolati aromatiche </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> sinalbina </td><td> 4-idrossibenzil </td><td> 8.1 </td><td> 0.5 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucosibarin </td><td> 2 (R) -OH-2-feniletil </td><td> 12.1 </td><td&gt; 0,95 </td><td> vedi il prossimo </td></tr><tr><td> Glucobarbarin </td><td> 2 (S) -OH-2-feniletil </td><td> 12,7 </td><td> 0.95 </td><td> Buchner </td></tr><tr><td> Glucotropaeolin </td><td> benzilico </td><td> 13.8 </td><td> 0.95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> gluconasturtiina </td><td> 2-feniletile </td><td> 18,0 </td><td> 0.95 </td><td> Buchner, CE </td></tr><tr><td> sconosciuto - alifatici / aromatici come spettro UV </td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> CE </td></tr><tr><td> sconosciuto - indolo come spettro </td><td></td><td></td><td> 0.25 </td><td> CE </td></tr><tr><td colspan="5"> * Tempo di ritenzione approssimativo (Rt) arrotondato a 0,1 min (± 0,3 min seconda colonna, eluente qualità). I tempi di ritenzione sono determinati su piattaforme ThermoFisher / Dionex ultimo HPLC equipaggiati con una colonna C 18 (150 x 4.6 mm 3 micrometro dimensioni delle particelle) più C 18 </sub&gt; precolonna (10 x 4.6 mm 5 micrometri granulometria) con un programma gradiente come in Tabella 1. </td></tr><tr><td colspan="5"> # Riferimenti per i fattori di risposta: Buchner, R. in glucosinolati a colza (a cura di JP Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. &amp; Gershenzon, J. Variazione di accumulo di glucosinolati tra i diversi organi e fasi di sviluppo di Arabidopsis thaliana. Fitochimica. 62 (3), 471-481, doi: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00.549-6, (2003); CE. Semi - Determinazione dei glucosinolati liquida ad alte prestazioni cromatografia. Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. L 170/28. Allegato VIII 03.07.27-34 (1990). </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Fattori di risposta del più comunemente desulfo-glucosinolati in estratti di piante e dei loro tempi di ritenzione approssimativi sulla C 18 colonne. Eluenti, gradient, temperatura della colonna, e portata come in Tabella 1.

Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo consolidato e robusto per l'estrazione di glucosinolati da materiali vegetali macinati. Dopo un trattamento con solfatasi in colonna degli estratti, i desulfoglucosinolati vengono eluiti e analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione.

Un metodo semplice per glucosinolati estrazione e l&#39;analisi con alta pressione cromatografia liquida (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è eseguire un'analisi semplice e diretta delle glucosinolati in piante e altri campioni biologici. Questo metodo, per l'estrazione e l'analisi delle glucosinolati, può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nell'ecologia pianta-insetto, nella patologia vegetale, nell'allevamento delle piante e nelle scienze alimentari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è ben convalidata e ampiamente applicabile a un'ampia gamma di campioni biologici.Sebbene questo metodo venga utilizzato principalmente per quantificare le glucosinolati nei materiali vegetali, può essere applicato anche ai suoli o agli alimenti preparati. Questa procedura di estrazione può essere eseguita in quasi ogni laboratorio poiché si utilizza principalmente attrezzatura di laboratorio standard. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo otterranno risultati migliori nelle analisi e nelle ispezioni se leggeranno e osserveranno il filmato almeno una volta.Per iniziare la procedura, mescolare 10 grammi di gel di destrina incrociata G-25 con 125 millilitri di acqua ultrapura. Conservare la miscela in un flacone chiuso a 4 gradi Celsius. Successivamente, sciogliere 10.000 unità di arilsolfatasi di tipo H-1 in 30 millilitri di acqua ultrapura.Aggiungere 30 millilitri di etanolo assoluto e mescolare bene la miscela. Centrifugare la miscela a 2.650 ×g per 20 minuti a temperatura ambiente. Combinare il surnatante con 90 millilitri di etanolo assoluto in un becher.Mescolare e versare in nuovi tubi da centrifuga. Centrifugare la miscela a 1.030 ×g per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare il soprannatante.Sciogliere e combinare i pellet in un volume totale di 25 millilitri di acqua ultra-pura. Vortexare accuratamente la miscela, quindi trasferirla in provette da 1 millilitro. Conservare i campioni di sulfatato a 20 gradi Celsius per un periodo massimo di un anno.Successivamente, pesare circa 90 milligrammi di sinogramma e registrare il peso con un'accuratezza di 1 microgrammo. Quindi, sciogliere il monoidrato di sinogramma in 10 millilitri di acqua ultrapura. Preparare da questa soluzione madre di sinogramma cinque soluzioni di riferimento con concentrazioni comprese tra 50 e 750 micromolari.Conservare le soluzioni di riferimento in provette da 1,5 millilitro a 20 gradi Celsius. Successivamente, etichettare una provetta da microcentrifuga da 2 millilitri in una posizione della rack a colonne per ogni campione e riferimento. Forare il tappo di ciascuna provetta da microcentrifuga con un ago da dissezione per la successiva liofilizzazione.Posizionare i tubi etichettati in un blocco nella stessa configurazione e spaziatura delle colonne etichettate. Per preparare le colonne di pipetta di vetro, utilizzare una bacchetta di legno o di vetro per premere delicatamente un pezzo di ovatta di vetro di 1 centimetro per 1 centimetro all'interno della pipetta. Compattare l'ovatta di vetro nella zona di transizione tra il corpo della pipetta e il gambo.Posizionare una colonna pipetta in ciascuna posizione etichettata sulla staffa. Posizionare la staffa sopra un vassoio per rifiuti. Tagliare l'estremità di una punta pipetta di plastica da 1 millilitro.Agitare bene il gel di destrina preparato. Quindi utilizzare la punta allargata della pipetta per caricare 0,5 millilitri di gel di destrina preparato in ogni colonna. Verificare la presenza di fuoriuscite di gel di destrina nelle colonne e sostituire eventuali colonne che perdono.Dopo aver caricato tutte le colonne con gel di destrina, lavare ciascuna colonna con 1 millilitro di acqua ultrapura. Pesare tra 50 e 100 milligrammi di materiale vegetale finemente macinato, libero da interferenti, in un tubo da reazione da 2 millilitri con tappo di sicurezza, e registrare il peso con un’accuratezza di 0,1 milligrammi. Inserire due sfere metalliche del diametro di 3 millimetri in ciascun tubo.Aggiungere a ogni provetta 1 millilitro di metanolo al 70% in acqua ultrapura e vortexare brevemente ogni miscela. Chiudere le provette con tappi di sicurezza aggiuntivi e posizionarle immediatamente in un bagno d'acqua a 90-92 gradi Celsius. Riscaldare le provette fino a quando il campione inizia a bollire.Trasferire i tubi in un bagno ad ultrasuoni e sottoporre i campioni ad sonicazione termica per 15 minuti. Durante l'ultrasonificazione, iniziare lo scongelamento del campione di sulfatato e dei riferimenti di sinogramma. Al termine dell'ultrasonificazione, centrifugare i campioni a 2.700 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente.Caricare i soprannatanti e i riferimenti di sinogramma scongelati nelle colonne corrispondenti, avendo cura di non aspirare materiale vegetale nella pipetta. Aggiungere 1 millilitro di metanolo al 70% in ogni provetta. Vortexare le miscele.Riscaldare le miscele mediante ultrasuoni per 15 minuti. Centrifugare nuovamente i tubi nelle stesse condizioni di prima. Caricare i soprannatanti sulle colonne corrispondenti.Aggiungere due aliquote di 1 millilitro di metanolo al 70% a ciascuna colonna, lasciando asciugare completamente la colonna tra un'aggiunta e l'altra. Rimuovere il metanolo residuo da ciascuna colonna con 1 millilitro di acqua ultrapura. Successivamente, lavare ogni colonna con due aliquote di 1 millilitro di tampone di acetato di sodio 20 millimolare, pH 5,5.Una volta che le ultime porzioni di tampone di acetato di sodio sono drenate nel vassoio dei rifiuti, rimuovere il vassoio dal contenitore dei rifiuti e asciugare i piedi del vassoio con un fazzoletto di carta. Posizionare il vassoio sopra il blocco di provette microcentrifughe etichettate, in modo che le punte delle colonne siano allineate con le provette corrispondenti. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di sulfatato su ciascuna colonna, assicurandosi che la soluzione raggiunga la superficie del materiale della colonna.Eluisci la soluzione di sulfatato nel materiale della colonna con 50 microlitri di tampone di acetato di sodio. È molto importante che il sulfatato venga lavato all'interno della colonna. L'enzima deve trovarsi sulla colonna per reagire con i glucosinolati integri legati alla colonna.Dopo aver lavato la soluzione di sulfato su ciascuna colonna, coprire le colonne con carta d'alluminio. Lasciare le colonne in riposo per tutta la notte. Successivamente, eluire i desolfo-glucosinolati da ciascuna colonna con due porzioni da 0,75 millilitri di acqua ultrapura.Una volta che le colonne si sono completamente svuotate, rimuovere il supporto per colonne e chiudere ogni provetta con un tappo. Congelare le provette in azoto liquido o a 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Eseguire la liofilizzazione dei campioni per 12-24 ore.Sciogliere ogni residuo in 1 millilitro di acqua ultrapura. Successivamente, trasferire ogni campione e riferimento in vial per HPLC etichettati. Separare gli estratti su una colonna CAT in fase inversa.Utilizzare una lunghezza d'onda di rilevamento di 229 nanometri. Dopo essere stati separati mediante HPLC, i glucosinolati possono essere identificati confrontando i tempi di ritenzione e gli spettri UV con standard noti di glucosinolati. Le concentrazioni di glucosinolati nel campione vengono calcolate a partire da una curva di calibrazione ottenuta da un sinogramma e dai valori presenti in letteratura per i fattori di risposta.Da questo, è possibile determinare le concentrazioni di glucosinolati nel campione vegetale originale. Nelle condizioni di HPLC utilizzate, il progoitrina dannoso eluisce piuttosto precocemente e viene separato dal glucorafanina biologicamente benefico. Anche i glucosinolati endogeni sono ben separati.Le serie liotrope vengono osservate con l'aumentare dei legami della catena laterale per alconolo, metilfol-alconolo e metil-solfinil-glucosinolati a catena più lunga. I glucosinolati sconosciuti possono quindi essere classificati in via preliminare sulla base di queste serie liotrope in combinazione con gli spettri UV. Con un'adeguata preparazione, una persona può estrarre da 150 a 200 campioni in un giorno lavorativo.Sarà necessario un altro giorno per fare riferimento alle colonne, liofilizzare i campioni e prepararli per la HPLC. Seguendo questo procedimento, altri metodi, come la LCMS, possono essere applicati per identificare desulfo-glucosinolati sconosciuti nel cromatogramma. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come estrarre i glucosinolati dai propri campioni biologici e analizzarli mediante HPLC.Non dimenticare che lavorare con il metanolo può essere estremamente pericoloso e deve essere sempre eseguito sotto cappa aspirante.

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