Clonazione funzionale utilizzando un

L'obiettivo generale di questo procedimento è dimostrare un sistema di oociti di Xenopus, un cap annulare animale, adatto all'identificazione di prodotti genici in grado di indurre una risposta nell'ectoderma competente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio quali geni siano necessari per indurre una risposta induttiva. Il principale vantaggio di questa tecnica risiede nell'utilizzo dell'oocita di Xenopus come sistema di espressione, al fine di produrre e identificare induttori che agiscono su un tessuto bersaglio, o persino geni che agiscono a monte degli induttori.

La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente utile, poiché i passaggi di dissezione e ricombinazione dipendono fortemente dallo stadio e richiedono una tecnica accurata. Dopo aver prelevato il tessuto ovarico da rane femmine anestetizzate, strappare il tessuto in piccoli pezzi, ciascuno contenente approssimativamente da 10 a 20 oociti. Trasferire quindi questi frammenti prima in una soluzione OR2 fresca e successivamente in OR2 contenente 2,0 milligrammi per millilitro di collagenasi A. Proseguire agitando delicatamente la miscela contenente il tessuto su un agitatore per un'ora.

Quindi trasferire i frammenti in una soluzione fresca di collagenasi e agitare per un'ora aggiuntiva. Alla fine di questo trattamento, ci si aspetta di osservare ovociti deflocculati. Procedere quindi a lavare gli ovociti 10 volte in OR2 completo e successivamente due volte nel mezzo di coltura per ovociti, abbreviato come OCM.

Successivamente, posizionare gli oociti in OCM fresco ed esaminarli visivamente al microscopio stereoscopico. Isolare quelli allo stadio sei scartando gli oociti più piccoli e immaturi. Successivamente, posizionare gli oociti in una piastra di Petri rivestita con agarosio contenente OCM e mantenerli a una temperatura compresa tra 18 e 20 gradi Celsius fino all'iniezione.

Per prepararsi per la microiniezione, inserire il tubo capillare di vetro in un estrattore di aghi, tirarlo, quindi rompere le punte del vetro per ottenere aghi con un diametro di circa 20 micrometri. Al microscopio composto, misurare le punte degli aghi con un micrometro oculare calibrato. Successivamente, premere l'argilla in uno strato uniforme sul fondo di una piastra di Petri di 35 per 10 millimetri.

E quindi creare solchi paralleli in questo strato, utilizzando uno strumento simile a una sonda sottile. Riempire la capsula rivestita di argilla con circa 2 millilitri di Ficoll al 3% in soluzione salina di Barth modificata 1x, o MBS. Successivamente trasferire gli ovociti utilizzando una pipetta a largo foro.

Posizionare gli oociti nelle scanalature in modo che rimangano fermi durante la successiva microiniezione. Utilizzando un microinjector, riempire un ago con circa due microlitri di una soluzione preesistente di mRNA e regolare il bilanciamento per generare una leggera pressione positiva, che impedirà al citoplasma dell'oocita di essere aspirato all'interno dell'ago durante l'iniezione. Successivamente, iniettare 20 nanolitri di RNA in ciascun oocita nella regione equatoriale.

Successivamente, lasciare gli oociti nel Ficoll MBS per un'ora, quindi trasferirli delicatamente nel MBS 1x. Procedere all'incubazione degli oociti per otto-ventiquattro ore a 20 gradi Celsius. Per iniziare il saggio del cappuccio animale, preparare la soluzione NAM (medium anfibio normale) 3/4x, pinzette fini, un loop di capello, oociti precedentemente iniettati ed embrioni di Xenopus allo stadio 11-11,5.

Quindi, spezzare le lamelle di vetro in frammenti di dimensioni approssimativamente di un millimetro per due millimetri e far passare questi pezzi attraverso una fiamma fino a quando i bordi diventano lisci e arrotondati. Successivamente, premere l'argilla in un singolo strato all'interno di una piastra, come descritto in precedenza, e utilizzare una sonda sottile per creare singole impronte a forma di coppa in questo strato.

Procedere a riempire la piastra con circa due millilitri di NAM 3/4x. Trasferire quindi gli oociti iniettati, posizionandone diversi in modo che ciascuno sia immobilizzato in una singola ammaccatura. Per preparare gli embrioni, trasferirli in una piastra contenente soluzione di NAM 3/4x.

Selezionare un sottoinsieme di gastrule da utilizzare come controlli di stadio per l'età dell'ectoderma e trasferirli in un altro piatto contenente la stessa soluzione. Mettere quindi da parte questa piastra. Per gli embrioni che verranno utilizzati nel saggio del cappuccio animale, rimuovere le membrane vitelline con due paia di pinzette fini.

Successivamente, trasferire la gastrula nella piastra rivestita di argilla insieme agli oociti. Per iniziare, tagliare le calotte animali dagli embrioni utilizzando due paia di pinzette fini, avendo cura di evitare il tessuto equatoriale. Per generare ricombinanti utilizzando il primo metodo, posizionare una calotta animale in modo che la sua superficie interna entri in contatto con l'emisfero animale di un oocita, già posizionato in una depressione.

Ripetere questo processo su diverse delle oociti iniettate. Per assicurare che questi ricombinanti rimangano uniti, posizionare un frammento curvo di coprivaso di vetro sopra ciascuno di essi ed esercitare una pressione verso il basso finché l'animale non si appiattisce e il coprivaso entra in contatto con l'argilla. Per generare ricombinanti utilizzando il secondo metodo, posizionare le calotte animali e le oociti insieme in singole depressioni vuote nell'argilla.

E assicurarsi che le superfici interne delle calotte animali siano rivolte verso l'ovocita. Quindi, fissare i due tessuti insieme utilizzando piccole estensioni di argilla. Una volta generate più ricombinanti con entrambi i metodi, coltivare questi campioni e gli embrioni di controllo messi da parte a 20 gradi celsius.

Quando gli embrioni di controllo raggiungono lo stadio desiderato, rimuovere le lamelle dai ricombinanti e isolare l'ectoderma del cap animale utilizzando pinzette e un anello di capello. Procedere quindi a fissare sia i frammenti ectodermici che gli embrioni di controllo in MEMFA per un'ora. Trasferire quindi i campioni in etanolo e conservare il tessuto a meno 20 gradi Celsius.

Qui, gruppi di oociti sono stati iniettati con pool di mRNA corrispondenti a numeri progressivamente minori di cloni o colonie, quindi coltivati con capsuli animali. Successivamente, è stato determinato il numero di capsuli animali in ciascun gruppo che esprimevano foxe3, un marcatore normalmente osservato nell'ectoderma pre-lentiforme dalle fasi della placca neurale iniziale fino alla formazione delle vescicole, utilizzato in questo contesto per valutare la capacità induttrice della lente. Questo metodo ha identificato il gene ldb1, che codifica per un fattore nucleare, in grado di produrre una risposta induttrice della lente in 50 su 179, ovvero il 28% dei capsuli animali analizzati.

Qui mostrate, le nostre immagini di ibridazione in situ, che raffigurano il segnale di foxe3, indicato dalle teste di freccia, in capsuli animali coltivati con ovociti iniettati con ldb1 da circa lo stadio 11 fino allo stadio 23. Nessuna espressione di foxe3 è osservata nei corrispondenti capsuli animali di controllo posti su ovociti non iniettati. Quando sono state ottenute sezioni da questi capsuli animali, l'espressione di foxe3 è stata osservata sia nei livelli ectodermici interni che esterni.

L'espressione nello strato interno è caratteristica di una risposta del cristallino. Oppure, se segnalata in entrambi gli strati, è indicativa di altre strutture come la placca olfattiva. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti metodi come l'immunohistochimica, ibridazione in situ o il rilevamento diretto di un gene reporter fluorescente, al fine di valutare una risposta induttiva nell'ectoderma del cappuccio animale.