Name: Clonazione funzionale utilizzando un Xenopus Ovociti Expression System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Impara la clonazione funzionale in biologia dello sviluppo utilizzando ovociti di Xenopus e sistema animal cap. Questo metodo permette di identificare geni induttori nell'ectoderma competente e analizzare le loro funzioni.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per lo sviluppo professionale a C.Z.P. dalla Shepherd University Foundation. Gli autori desiderano ringraziare Brett Zirkle e Malia Deshotel per le utili discussioni sui protocolli, e la dottoressa Carol Hurney per la generosa assistenza.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla University of Virginia Istituzionale Animal Care and Use Committee. Nota: la figura 1 mostra una panoramica schematica delle procedure sperimentali. 1. Preparazione di ovociti <ol><li> Pre-prime X. laevis femmine con 150 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) circa una settimana di anticipo di isolamento degli ovociti. Iniettare 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale linfa sac con 1 cc siringa sterile con 29 ago G. </li><li> Preparare le soluzioni per l&#39;iniezione degli ovociti e degli ovociti animale cap test. <ol><li> Preparare Ca ++ / Mg ++-free OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mm Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2. </li><li> Preparare OR2: OR2- più 1 mM CaCl 2 e 1 mm MgCl 2. </li><li> Preparare OCM: il 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml di BSA, 100 mg / ml Gentamicina, pH 7,8. </li><li> Prepare MBS 1x: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mm CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7.8), 2.5 NaHCO mm 3. </li><li> Preparare 3% Ficoll in 1x MBS. </li><li> Preparare NAM 1x: 110 mM NaCl, KCl 2 mM, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7.4. </li></ol></li><li> Anestetizzare la femmina in una soluzione 0,03% di Ethyl sale metansolfonato 3-amminobenzoato (MS222) in 0.1x MBS (prima sciogliere 0,3 g MS222 in 10 ml di etanolo 95%, poi diluite in 1 L 0.1x MBS) ponendo rana in soluzione per 10-15 minuti o fino a quando non risponde. <ol><li> Verificare che l&#39;anestesia è completa ruotando rana anestetizzato sulla schiena per assicurarsi che non risponde (non completamente rane anestetizzati muovere gli arti o girare corpo sopra). </li></ol></li><li> Chirurgicamente isolare frammenti ovarici facendo un&#39;incisione addominale attraverso la pelle e la parete del corpo con bisturi, isolando tessuto ovarico con una pinzae forbici. Mettere i frammenti ovarici in OR2-. Chiudere la parete del corpo con una sutura di seta 3-0 su un ago curvo 24 mm e chiudere la pelle separatamente con gli stessi punti di sutura. Permettere il recupero della femmina in 1 g / L salata serbatoio in acqua. </li><li> Utilizzando una pinza sottile, il tessuto ovarico lacrima in piccole (10 - 20 ovociti) pezzi e trasferimento OR2- fresco. </li><li> Frammenti ovarici Defolliculate a 2,0 mg / ml di collagenasi A OR2- agitando delicatamente su agitatore per 1 ora, il trasferimento di collagenasi fresco e agitazione per un&#39;ora supplementare. </li><li> Lavare ovociti 10 volte in OR2 [contenenti Ca ++ / Mg ++], scartando ovociti più piccoli. </li><li> Lavare gli ovociti in OCM due volte e trasferimento a fresco OCM. Isolare ovociti Fase VI per dimensione su ispezione visiva e scartare immaturi (più piccoli) ovociti: ovociti Fase VI sono più grandi di ovociti immaturi anche con pigmentazione nell&#39;emisfero animale e sono circa 1,2-1,4 mm di diametro. </li><li> Mantenere ovociti a 18 - 20 ° C in OCM prima dell&#39;iniezione. Nota: capsule di Petri Agarosio-rivestiti possono essere utilizzati per ridurre al minimo incollaggio di ovociti a servire. </li></ol> 2. Iniezione di Biblioteca Trascrizioni <ol><li> Preparare una libreria di cDNA direzionale 15 utilizzando RNA estratto in una fase adeguato di sviluppo (per esempio, lo stadio piastra neurale 14 10). Acquistare una libreria di cDNA o costruirne uno utilizzando un kit commerciale per la panoramica nelle quattro fasi che seguono. <ol><li> Isolare circa 5 mg di mRNA utilizzando un prodotto per arricchire di poli (A) + RNA (vedi Tabella dei Materiali) e seguendo le istruzioni del produttore. Nota: Le trascrizioni da utilizzare per produrre la libreria di cDNA può essere limitata ad un tessuto induzione (come la piastra neurale, dopo microdissezione del tessuto desiderato), o possono essere da embrioni interi in una fase particolare. </li><li> Produrre cDNA con un kit commerciale, seguendo le indicazioni del produttore. </li><li> Legare circa 20 ng cDNA in un vectoR incluso con il kit commerciale o di un altro vettore adatto. Un appropriato vettore plasmidico comprende sequenze di mRNA stabilità come 5 &#39;β-globina e 3 poly (A) + sequenze (pCS2, pTnT, pCS105). </li><li> Trasforma legatura in cellule batteriche competenti mediante protocollo raccomandato del fornitore per la trasformazione shock termico. Nota: In alternativa, una raccolta di cornice di lettura aperta (ORFeome) cloni è disponibile in commercio e può essere utilizzato per generare trascrizioni per iniezione. </li></ol></li><li> Preparare 10 piscine di plasmidi di 10 3 al 10 4 complessità (10 4 al 10 5 complessità totale). Questo rappresenta 10 tavole con 1.000 - 10.000 colonie ciascuno. <ol><li> Biblioteca piastra di coltura su 10 piatti da 15 cm LB-ampicillina, crescere 12-18 ore a 37 ° C, e raccogliere le colonie da ogni da una leggera pressione con una spatola di vetro a 7 ml LB. </li><li> Preparare un stock di glicerolo da 0,5 ml (aggiungere 0,2 ml glicerolo sterile e conservare a -20 &amp;# 730; C), e utilizzare i restanti 6,5 ml per preparare il DNA con uno standard disponibile in commercio kit miniprep DNA seguendo le indicazioni del produttore. </li></ol></li><li> Linearizzare pool DNA plasmide (1,0-2,0 mg) con adeguate enzima di restrizione digerire 16 a 37 ° C: 1 - 1,5 ore. Isolare il DNA linearizzato con estrazione con fenolo / cloroformio seguita dalla precipitazione con etanolo e risospensione in acqua secondo le specifiche del kit RNA polimerasi utilizzata. Sintetizzare RNA con un kit RNA polimerasi commerciale seguendo le indicazioni del produttore. </li><li> Preparare aghi per microiniezione (usando un estrattore ago con tubi capillari di vetro) di circa 20 micron di diametro; misurare punte degli aghi su un microscopio composto con un micrometro oculare calibrata. Nota: le impostazioni estrattore ago deve essere empiricamente determinato a produrre un ago con punta fine in modo tale che in caso di rottura con una pinza sottile produce il formato di punta desiderata. </li><li> Preparare (spingere argilla instrato uniforme sul fondo del piatto) argilla alberati 35 x 10 mm piatti di Petri con scanalature parallele di tenere ovociti in atto durante la microiniezione; produrre scanalature con una sonda centro commerciale o pipetta Pasteur fuso alla punta di fiamma. In alternativa argilla, preparare piatti agarosio rendendo rientranze con uno stampo elastomero 17. Ovociti di trasferimento con una pipetta ampio tunnel al 3% Ficoll a 1X MBS (circa 2 ml) in file nei piatti di creta-allineati. </li><li> Utilizzando microinjector, riempire ago con 1 ng / RNA nl e regolare l&#39;equilibrio di produrre una leggera pressione positiva (per evitare stesura di ovociti citoplasma). </li><li> Iniettare ovociti con circa 20 RNA nl nella regione equatoriale. Lasciare 1 ora per ovociti iniettati di rimanere in Ficoll-MBS, quindi trasferire delicatamente per 1x MBS. Incubare per 8-24 ore a 20 ° C prima dell&#39;analisi protezione animale. </li></ol> 3. Animal Cap Assay <ol><li> Preparare 3 / 4x NAM e ottenere una pinza sottile, ciclo dei capelli, frammenti coprioggetto curve, dis argilla alberatihes con rientranze a forma di coppa per tenere ovociti. Fai frammenti coprioggetto curve da sbriciolarsi vetrini in piccoli frammenti (circa 1-2 mm x 2-4 mm) e passando attraverso la fiamma fino a quando i bordi polacco e languore, la produzione di un pezzo curvo. </li><li> Fertilizzare X. laevis uova 18 attraverso in vitro o l&#39;accoppiamento naturale e la cultura di gastrula fasi (10 - 11 ore dopo la fecondazione a RT) a 0.1x MBS prima l&#39;ordinamento per fase; raccogliere metà gastrula (fase 11-11,5) 10 embrioni. </li><li> Trasferimento degli embrioni a una capsula di Petri circa mezzo pieno con 3 / 4x NAM. Utilizzando due coppie di una pinza sottile, rimuovere la fecondazione (vitellina) membrana dal gastrulae. </li><li> Trasferimento ovociti a 3 / 4x NAM (circa 2 ml) in piatti di terracotta alberati e immobilizzare in singole impressioni in argilla, producendo impressioni per accogliere singoli embrioni solchi sono stati descritti sopra. </li><li> Trasferimento degli embrioni ai piatti d&#39;argilla alberati e tagliato le protezioni animali fuori gastrulae utilizzando due coppie di pinza sottile. Fare attenzione a isolare animale tappo ectoderma e non tessuti equatoriali 18. </li><li> Inserire un tappo animale nell&#39;emisfero animali di ciascun ovocita con la superficie interna del tappo animale contattando l&#39;ovocita. Tenere ricombinanti insieme applicando frammento coprioggetto vetro curvo e applicando pressione verso il basso sul vetro, appiattimento ectoderma come i contatti coprioggetto l&#39;argilla (tappi animale può rimanere aperto con lo strato interno esposta alla superficie del ovocita per 6 - 8 ore o più ). Nota: In alternativa, inserire la protezione animale in una rientranza di argilla con la sua superficie interna rivolta verso l&#39;alto e inserire un ovocita sul tappo; fissare il ricombinante con piccole estensioni di argilla. </li><li> Cultura a 20 ° C fino a quando gli embrioni di controllo portata desiderata palco per il dosaggio. </li><li> Ricombinante separata rimuovendo vetrino / argilla ed isolando ectoderma con una pinza e un ciclo di capelli. </li><li> Fissare frammenti ectodermica per 1 ora a MEMFA (3,8%formaldeide in MEM [0,1 M pH 7,4 MOPS, 2 mM EGTA, e 1 mM MgSO 4]). </li><li> Frammenti di trasferimento (ed embrioni di controllo) da MEMFA in etanolo e conservare a -20 ° C. </li></ol> 4. Analisi di risposta in Ectoderma l&#39;ibridazione in situ (ISH) <ol><li> Preparare soluzioni per ISH. <ol><li> Preparare 1x PBS: 0,01 M tampone fosfato, NaCl 0,138 M, pH 7,4 </li><li> Preparare PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% di Tween-20 </li><li> Preparare la soluzione di 100x Denhart: 2% di BSA, 2% Polivinilpirrolidone, 2% Ficoll </li><li> Preparare Hybridization Buffer: 50% formammide, 5x SSC, 1 mg / ml torula RNA, 1 mg / ml di eparina, soluzione 1x Denhart, 0.1% Tween-20, 0,1% CHAPS, EDTA 10 mM, DEPC-H 2 O </li><li> Preparare maleico Acid Buffer (MAB): 100 mM acido maleico, NaCl 150 mM, pH 7,5 </li><li> Preparare MAB + blocco: MAB, 2% reagente bloccante (calore a 60 ° C per sciogliere) </li><li> Preparare della fosfatasi alcalina (AP) Buffer: Tris mm 100pH 9.5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> Preparare la sonda RNA. <ol><li> Utilizzando un kit di RNA polimerasi commerciale e scavare-NTP mix, aggiungere in una provetta da 1,5 ml (50 reazione microlitri): 25,5 ml DEPC-H 2 O, 10 microlitri 5X Transcription Buffer, 2,5 microlitri 10x scavo-NTP mix, 5 ml 100 mM DTT, 2 microlitri RNasin, 2 ml DNA stampo linearizzato (~ 1 mg / mL), 3 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 90 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di RNA polimerasi e incubare 37 ° C per 60 min. </li><li> Controllare 2 ml di reazione su 1% gel. </li><li> Aggiungere 1 ml RQ1 RNase-Free DNase e incubare 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Precipitare il probe aggiungendo 50 microlitri DEPC-H 2 O, 25 microlitri 10 M ammonio acetato e 313 ml di etanolo. Conservare a -20 ° C durante la notte (O / N) poi recuperare RNA per centrifugazione a 13.800 xg per 20 min. Lavare con 500 ml 75% di etanolo, girare brevemente, rimuovereetanolo e lasciare asciugare all&#39;aria pellet. Aggiungere 50 ml DEPC-H 2 O. </li><li> Aggiungi Tampone di ibridazione a una concentrazione finale di ~ 0.5 mg / mL. </li></ol></li><li> Preparare dei tessuti per l&#39;ibridazione. Se non diversamente specificato, riempire fiale in cima ad ogni cambio di soluzioni descritte (circa 4 ml). <ol><li> Rimuovere l&#39;etanolo da fiale e trasferimento di embrioni in 75% di etanolo / PTW, quindi il 50% di etanolo / PTW per 10 minuti ciascuna, orizzontalmente sulla sedia a dondolo. </li><li> Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo. </li><li> Trasferimento a 10 mg / mL trattamento Proteinase K in PTW; Tubi di roccia verticale 15 min. </li><li> Sciacquare due volte 10 minuti ciascuno a 0,1 M Triethanolamine pH 7,8 - tubi di roccia verticale. </li><li> Aggiungere 12,5 ml di anidride acetica ai tubi e roccia verticale 5 min. Ripetere con l&#39;aggiunta di 12,5 ml di anidride acetica per 5 min. </li><li> Lavare in PTW 5 minuti verticalmente sulla sedia a dondolo. </li><li> REFIX in 4% paraformaldeide 20 min a bilanciere. Calore Tampone di Ibridazionea 60 ° C. </li><li> Lavare tre volte in PTW per 5 minuti ciascuno su sedia a dondolo. </li><li> Rimuovere tutti ma ~ 1 ml di PTW da ciascuna provetta e aggiungere 250 microlitri Hyb Buffer; agitare delicatamente i tubi per mescolare. Tubi di roccia verticale 5 min. </li><li> Sostituire con 60 ° C Hyb Buffer (0,5 ml) e agitare delicatamente a 60 ° C 10 min. Sostituire con fresco Hyb tampone e agitare a 60 ° C per 4 ore due. </li><li> Sonda termica (1 ml a 0,5 mg / mL in Hyb tampone) a 60 ° C (3 min). Rimuovere Hyb Buffer e aggiungere la sonda ai tubi. Agitare delicatamente O / N a 60 ° C. </li></ol></li><li> Preparare dei tessuti per l&#39;anticorpo. <ol><li> Caldo Hyb Buffer e 2x SSC + 0,1% Tween-20 soluzioni a 60 ° C. </li><li> Sostituire soluzione della sonda con Hyb Buffer (salvare le sonde a -20 C per 2 - 3x riutilizzo). Lavare a 60 ° C per 10 min. </li><li> Lavare tre volte a 60 ° C in 2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione). </li><li> Lavare tre volte a 60 ° C a 0.2x SSC-Tween (20 minuti ciascuno con agitazione). </li><li> Lavare due volte in MAB (RT) per 15 min per riga sull&#39;attuatore. </li><li> Aggiungere 1 ml MAB + blocco. Lavare 2 ore in verticale sulla sedia a dondolo. </li><li> Trasferimento a 1 ml MAB + blocco contenente un anti-digossigenina-AP 1 / 2.000. Roccia verticale a 4 Co / N. </li></ol></li><li> Preparare dei tessuti per reagente colore. <ol><li> Sostituire soluzione di anticorpi con MAB; lavare tre volte in MAB 5 min per riga sull&#39;attuatore. </li><li> Lavare tre volte in MAB 1 ora ciascuno orizzontalmente sull&#39;attuatore. </li><li> Lavare due volte in AP Buffer 10 minuti ogni orizzontalmente sulla sedia a dondolo. </li><li> Trasferimento tessuto multi-pozzo vassoio di plastica, rimuovere AP tampone e aggiungere BM viola reagente (~ 1 ml). Lasciare reazione di procedere nel buio 5 minuti a O / N. </li><li> Al raggiungimento del caso colorazione, trasferire il tessuto di fiale di PTW. Lavare due volte 10 min ciascuno in PTW sulla sedia a dondolo. </li><li> Fissare in soluzione di Bouin a 4 CO / N sulla sedia a dondolo. </li><li> Lavare Bouin con tre il 70% di etanolo / 30% lavaggi PTW a temperatura ambiente. Procedere to l&#39;acquisizione di immagini con epi-illuminazione e una videocamera a microscopio, candeggio, se necessario 18. </li></ol></li></ol> 5. Sib Selezione e clonazione <ol><li> Selezionare piscina con la più alta attività (grande risposta nel tessuto ectodermica). </li><li> Titolare (diluire con LB alla densità del caso) la stock di glicerolo per la piscina con la più alta attività e piastra fuori dieci nuovi piatti con circa un decimo delle colonie dal passo precedente (utilizzando la sezione 2 del protocollo sopra). </li><li> Ridurre le dimensioni della piscina fino a quando l&#39;attività viene fatta risalire ad un&#39;unica colonia. </li><li> Ottenere sequenza di DNA con primer standard, nel vettore. </li></ol>

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<li>Amin, N., Tandon, P., Osborne, N. E., Conlon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+in+the+tetraploid+Xenopus.laevis.+enables+genome-wide+insight+in+a+classic+developmental+biology+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-seq in the tetraploid Xenopus.laevis. enables genome-wide insight in a classic developmental biology model organism.</a> Methods. 66, 398-409 (2014).</li>
<li>Gilchrist, M., Zorn, A., Voigt, J., Smith, J., Papalopulu, N., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+large+set+of+full-length+clones+from+a+Xenopus+tropicalis+EST+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining a large set of full-length clones from a Xenopus tropicalis EST project.</a> Developmental Biology. 271, 498-516 (2004).</li>
<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il metodo descritto qui per il clonaggio funzionale di geni capaci di indurre una risposta in ectoderma competente può essere utilizzato per identificare una vasta gamma di prodotti genici. Questo metodo si espande sul lavoro passato, combinando analisi dei tessuti che inducono con tecniche di clonazione espressione. Utilizziamo le vie metaboliche della oocita Xenopus come fonte di produzione di indurre fattori, direttamente o indirettamente, dopo l&#39;iniezione di RNA. Questo, in combinazione con l&#39;uso di...

Gli approcci genetici avanzati per identificare i geni di interesse attraverso la loro funzione o perdita di funzione1,2 sono parte integrante della comprensione di eventi di patterning complessi nello sviluppo. Accoppiato con potenti tecniche di genetica inversa disponibili per una gamma sempre più ampia di sistemi e ricercatori3-5, è ora possibile identificare i geni con un ruolo funzionale chiave in un percorso e quindi chiarire tale funzione a livello cellulare e in interazione con altri prodotti genici. Un approccio per identificare funzionalmente i geni di interesse che ha prodotto molte scoperte chiave in passato è il clonaggio di espressione6,7.
Il nostro recente obiettivo8 è stato quello di identificare i fattori precoci che inducono il cristallino, poiché è stato dimostrato che i primi passi nel processo induttivo del cristallino dei vertebrati si verificano già negli stadi di gastrula. A tal fine, abbiamo utilizzato l'ectoderma a9 cappucci animali (stadio 11-11,510) transitoriamente competente per le lenti degli embrioni di Xenopus come tessuto di risposta per l'induzione e l'ovocita di Xenopus allo stadio VI come fonte di produzione per i fattori induttori.
Il seguente protocollo si basa sui protocolli di clonazione delle espressioni e selezione dei sib di Smith e Harland6,7, utilizzati con successo anche da altri11-13. Nel nostro sistema di espressione degli ovociti (utilizzato per la prima volta per la produzione di fattori induttori da Lustig e Kirschner14), vengono selezionati e identificati pool di trascritti iniettati in grado di indurre direttamente o indirettamente gli ovociti a produrre fattori che suscitano una risposta induttiva del cristallino nell'ectoderma del cappuccio animale. Poiché il sistema è utile per esprimere direttamente molecole che inducono secrete (l'mRNA di INHBB iniettato negli ovociti provoca l'induzione del mesoderma nell'ectoderma8 del cappuccio animale competente per il mesoderma), inizialmente ci aspettavamo che la procedura di screening fosse utile principalmente per l'identificazione di fattori paracrini. Tuttavia, poiché abbiamo identificato un fattore nucleare nel nostro screening (ldb18), è chiaro che il sistema può essere utilizzato per identificare un'ampia varietà di molecole come fattori regolatori trascrizionali o traduzionali, miRNA, cofattori o fattori juxtacrini.

<table><tbody><tr><td>12/101 Studi sullo sviluppo degli anticorpi</td><td>Banca degli ibridomi</td><td>12/101</td><td>Anticorpo monoclonale per la rilevazione del tessuto muscolare</td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Anidride acetica</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Aurum Plasmid Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Purificazione del DNA plasmidico</td></tr><tr><td>Reagente bloccante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>per forno di</td></tr><tr><td>ibridazione ISH Boekel</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>per OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Collagenasi A</td><td></td><td>Roche 10103578001</td><td>Defollicolazione degli ovociti</td></tr><tr><td>Cisteina</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>embrioni Dejelly</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Dig-RNA Labeling Mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>per sonde ISH</td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5</td> World <td>Precision Instruments</td><td>500233</td><td>per busta Vitelline rimozione</td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 anestetico</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>per mezzi di iniezione</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Gentamicina solfato</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>per OCM</td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3,5" lungo, I, D, 0,530 mm</td></tr><tr><td>Fiale per campioni di vetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Capelli apposti in pipetta pasteur per manipolazione tissutale</td></tr><tr><td>Eparina sale sodico</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Injector Nanoliter 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010</td><td>Microiniettore controllato da microprocessore</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Aquarium Salt per il recupero della rana</td></tr><tr><td>IRBG XGC Xenopus verificato full-length cam cDNA</td><td>Fonte Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>libreria di cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre LB Agar con 100 &micro; g/ml Ampicillina</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>Piastre LB-Amp pre-versate da 150 mm per la selezione dei sib</td></tr><tr><td>LB Luria Brodo</td><td>Teknova</td><td>L8650</td><td>LB per la raccolta di colonie nella selezione dei sib da piastre e la diluizione delle colture</td></tr><tr><td>Kit di isolamento magnetico dell'mRNA</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>per l'isolamento dell'RNA arricchito di poli (A)</td></tr><tr><td>Acido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Micromanipolatore manuale Microfil World</td><td>Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>Micromanipolatore manuale</td></tr><tr><td>Miscelatore nutante</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>Rocker per ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco SB33495M</td><td></td><td>Clay per iniezione e dissezione</td></tr> Phosphate <tr><td>Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>per stimolare lo sviluppo degli ovociti</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>per estrattore</td></tr><tr><td>programmabile</td> ISH <td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Estrattore per aghi per micropipette</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>pTnT Vector</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>costruzione di librerie di cDNA</td></tr><tr>Sistema<td>di combinazione Riboprobe</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro Kit</td></tr> di <tr><td>costruzione di librerie di cDNA a lunghezza intera in apice</td><td>Kit</td><td>di 18248013</td><td>Life Technologies per la costruzione di librerie di cDNA</td></tr><tr><td>Suture, seta 3-0</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Filo e ago per sutura per la rimozione post-ovocita</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Trietanolammina</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>per ISH</td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>kit alternativo per la costruzione di librerie di cDNA</td></tr><tr><td>Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td><td>Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue Ultracompetent Cells</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>cellule per la trasformazione del cDNA biblioteca</td></tr></tbody></table>

clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; xenopus</em&gt; ovociti expression system

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

L'identificazione dei geni responsabili dell'induzione embrionale pone una serie di sfide; per citarne alcune, le molecole secrete di interesse possono essere poco abbondanti, possono non essere secrete ma legate alle cellule di segnalazione, o possono richiedere la presenza di partner leganti o molecole regolatrici a monte. Pertanto, nella ricerca di prodotti genici in grado di suscitare una risposta precoce induttiva del lente, in un ectoderma competente, abbiamo utilizzato un sistema di clonaggio di espressione che consentisse l'identificazione di fattori paracrini o juxtacrin, nonché di proteine trascrizionali o di altre proteine regolatorie. Pool di mRNA sono stati iniettati negli ovociti di Xenopus e il tessuto rispondente è stato posizionato direttamente sugli ovociti e co-coltivato. A seguito del clonaggio funzionale di ldb1 da una libreria di cDNA allo stadio di placca neurale basata sulla sua capacità di suscitare l'espressione del marcatore precoce del placode del cristallino foxe3 in un ectoderma animale con cappuccio competente per il cristallino, abbiamo caratterizzato il pattern di espressione dell'mRNA e analizzato la progressione dello sviluppo in seguito a sovraespressione o knockdown di ldb1. Questo sistema è adatto in una varietà molto ampia di contesti in cui l'identificazione di un induttore o delle sue molecole regolatorie a monte è ricercata utilizzando una risposta funzionale in un tessuto competente.

In risposta alla espressione di mRNA iniettato in oociti, rispondendo tessuto protezione animale è stato analizzato per l&#39;espressione di Otx2 mediante ibridazione in situ (Figura 2 e Tabella 1); Otx2 si esprime nella ectoderma lente presuntivo (PLE) da chiusura del tubo neurale attraverso la lente placode ispessimento 19. Tuttavia, poiché Otx2 si esprime anche nella ectoderma neurale anteriore, così come non-neurale ecto...

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è dimostrare un sistema di oociti di Xenopus, un cap annulare animale, adatto all'identificazione di prodotti genici in grado di indurre una risposta nell'ectoderma competente. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio quali geni siano necessari per indurre una risposta induttiva. Il principale vantaggio di questa tecnica risiede nell'utilizzo dell'oocita di Xenopus come sistema di espressione, al fine di produrre e identificare induttori che agiscono su un tessuto bersaglio, o persino geni che agiscono a monte degli induttori.La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente utile, poiché i passaggi di dissezione e ricombinazione dipendono fortemente dallo stadio e richiedono una tecnica accurata. Dopo aver prelevato il tessuto ovarico da rane femmine anestetizzate, strappare il tessuto in piccoli pezzi, ciascuno contenente approssimativamente da 10 a 20 oociti. Trasferire quindi questi frammenti prima in una soluzione OR2 fresca e successivamente in OR2 contenente 2,0 milligrammi per millilitro di collagenasi A. Proseguire agitando delicatamente la miscela contenente il tessuto su un agitatore per un'ora.Quindi trasferire i frammenti in una soluzione fresca di collagenasi e agitare per un'ora aggiuntiva. Alla fine di questo trattamento, ci si aspetta di osservare ovociti deflocculati. Procedere quindi a lavare gli ovociti 10 volte in OR2 completo e successivamente due volte nel mezzo di coltura per ovociti, abbreviato come OCM.Successivamente, posizionare gli oociti in OCM fresco ed esaminarli visivamente al microscopio stereoscopico. Isolare quelli allo stadio sei scartando gli oociti più piccoli e immaturi. Successivamente, posizionare gli oociti in una piastra di Petri rivestita con agarosio contenente OCM e mantenerli a una temperatura compresa tra 18 e 20 gradi Celsius fino all'iniezione.Per prepararsi per la microiniezione, inserire il tubo capillare di vetro in un estrattore di aghi, tirarlo, quindi rompere le punte del vetro per ottenere aghi con un diametro di circa 20 micrometri. Al microscopio composto, misurare le punte degli aghi con un micrometro oculare calibrato. Successivamente, premere l'argilla in uno strato uniforme sul fondo di una piastra di Petri di 35 per 10 millimetri.E quindi creare solchi paralleli in questo strato, utilizzando uno strumento simile a una sonda sottile. Riempire la capsula rivestita di argilla con circa 2 millilitri di Ficoll al 3% in soluzione salina di Barth modificata 1x, o MBS. Successivamente trasferire gli ovociti utilizzando una pipetta a largo foro.Posizionare gli oociti nelle scanalature in modo che rimangano fermi durante la successiva microiniezione. Utilizzando un microinjector, riempire un ago con circa due microlitri di una soluzione preesistente di mRNA e regolare il bilanciamento per generare una leggera pressione positiva, che impedirà al citoplasma dell'oocita di essere aspirato all'interno dell'ago durante l'iniezione. Successivamente, iniettare 20 nanolitri di RNA in ciascun oocita nella regione equatoriale.Successivamente, lasciare gli oociti nel Ficoll MBS per un'ora, quindi trasferirli delicatamente nel MBS 1x. Procedere all'incubazione degli oociti per otto-ventiquattro ore a 20 gradi Celsius. Per iniziare il saggio del cappuccio animale, preparare la soluzione NAM (medium anfibio normale) 3/4x, pinzette fini, un loop di capello, oociti precedentemente iniettati ed embrioni di Xenopus allo stadio 11-11,5.Quindi, spezzare le lamelle di vetro in frammenti di dimensioni approssimativamente di un millimetro per due millimetri e far passare questi pezzi attraverso una fiamma fino a quando i bordi diventano lisci e arrotondati. Successivamente, premere l'argilla in un singolo strato all'interno di una piastra, come descritto in precedenza, e utilizzare una sonda sottile per creare singole impronte a forma di coppa in questo strato.Procedere a riempire la piastra con circa due millilitri di NAM 3/4x. Trasferire quindi gli oociti iniettati, posizionandone diversi in modo che ciascuno sia immobilizzato in una singola ammaccatura. Per preparare gli embrioni, trasferirli in una piastra contenente soluzione di NAM 3/4x.Selezionare un sottoinsieme di gastrule da utilizzare come controlli di stadio per l'età dell'ectoderma e trasferirli in un altro piatto contenente la stessa soluzione. Mettere quindi da parte questa piastra. Per gli embrioni che verranno utilizzati nel saggio del cappuccio animale, rimuovere le membrane vitelline con due paia di pinzette fini.Successivamente, trasferire la gastrula nella piastra rivestita di argilla insieme agli oociti. Per iniziare, tagliare le calotte animali dagli embrioni utilizzando due paia di pinzette fini, avendo cura di evitare il tessuto equatoriale. Per generare ricombinanti utilizzando il primo metodo, posizionare una calotta animale in modo che la sua superficie interna entri in contatto con l'emisfero animale di un oocita, già posizionato in una depressione.Ripetere questo processo su diverse delle oociti iniettate. Per assicurare che questi ricombinanti rimangano uniti, posizionare un frammento curvo di coprivaso di vetro sopra ciascuno di essi ed esercitare una pressione verso il basso finché l'animale non si appiattisce e il coprivaso entra in contatto con l'argilla. Per generare ricombinanti utilizzando il secondo metodo, posizionare le calotte animali e le oociti insieme in singole depressioni vuote nell'argilla.E assicurarsi che le superfici interne delle calotte animali siano rivolte verso l'ovocita. Quindi, fissare i due tessuti insieme utilizzando piccole estensioni di argilla. Una volta generate più ricombinanti con entrambi i metodi, coltivare questi campioni e gli embrioni di controllo messi da parte a 20 gradi celsius.Quando gli embrioni di controllo raggiungono lo stadio desiderato, rimuovere le lamelle dai ricombinanti e isolare l'ectoderma del cap animale utilizzando pinzette e un anello di capello. Procedere quindi a fissare sia i frammenti ectodermici che gli embrioni di controllo in MEMFA per un'ora. Trasferire quindi i campioni in etanolo e conservare il tessuto a meno 20 gradi Celsius.Qui, gruppi di oociti sono stati iniettati con pool di mRNA corrispondenti a numeri progressivamente minori di cloni o colonie, quindi coltivati con capsuli animali. Successivamente, è stato determinato il numero di capsuli animali in ciascun gruppo che esprimevano foxe3, un marcatore normalmente osservato nell'ectoderma pre-lentiforme dalle fasi della placca neurale iniziale fino alla formazione delle vescicole, utilizzato in questo contesto per valutare la capacità induttrice della lente. Questo metodo ha identificato il gene ldb1, che codifica per un fattore nucleare, in grado di produrre una risposta induttrice della lente in 50 su 179, ovvero il 28% dei capsuli animali analizzati.Qui mostrate, le nostre immagini di ibridazione in situ, che raffigurano il segnale di foxe3, indicato dalle teste di freccia, in capsuli animali coltivati con ovociti iniettati con ldb1 da circa lo stadio 11 fino allo stadio 23. Nessuna espressione di foxe3 è osservata nei corrispondenti capsuli animali di controllo posti su ovociti non iniettati. Quando sono state ottenute sezioni da questi capsuli animali, l'espressione di foxe3 è stata osservata sia nei livelli ectodermici interni che esterni.L'espressione nello strato interno è caratteristica di una risposta del cristallino. Oppure, se segnalata in entrambi gli strati, è indicativa di altre strutture come la placca olfattiva. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti metodi come l'immunohistochimica, ibridazione in situ o il rilevamento diretto di un gene reporter fluorescente, al fine di valutare una risposta induttiva nell'ectoderma del cappuccio animale.

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