Clonazione funzionale utilizzando un Xenopus Ovociti Expression System

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare l'esistenza di un ovocita di Xenopus, un sistema di cap animale, adatto all'identificazione di prodotti genici in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, come ad esempio quali geni sono necessari per indurre una risposta induttiva. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'utilizzo dell'ovocita Xenopus, come sistema di espressione, per produrre e identificare induttori che agiscono su un tessuto bersaglio, o anche geni che agiscono a monte degli induttori.

La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente utile, poiché le fasi di dissezione e ricombinazione dipendono fortemente dallo stadio e richiedono una tecnica raffinata. Dopo aver raccolto il tessuto ovarico da rane femmine anestetizzate, strappare il tessuto in piccoli pezzi, ciascuno contenente circa 10-20 ovociti. E trasferire questi frammenti, prima in una soluzione fresca di OR2 e poi in una soluzione contenente OR2 con 2,0 milligrammi per millilitro di collagenasi A.Continuare agitando delicatamente la miscela contenente tessuto su uno shaker per un'ora.

Quindi trasferire i frammenti in una soluzione di collagenasi fresca e agitare per un'altra ora. Aspettatevi di osservare ovociti deflocculati alla fine di questo trattamento. Procedere al lavaggio degli ovociti 10 volte in OR2 completo e poi due volte in terreno di coltura ovocitaria, abbreviato in OCM.

Successivamente, posizionare gli ovociti in OCM freschi e ispezionarli visivamente al microscopio da dissezione. Isolare quelli allo stadio sei scartando gli ovociti più piccoli e immaturi. Successivamente, metti gli ovociti in una capsula di Petri rivestita di agarosio contenente OCM e mantienili a 18-20 gradi Celsius fino all'iniezione.

Per prepararsi alla microiniezione, posizionare il tubo capillare di vetro in un estrattore di aghi, tirarlo e quindi rompere le punte dal vetro per generare aghi di circa 20 micrometri di diametro. Su un microscopio composto, misurare le punte dell'ago con un micrometro oculare calibrato. Quindi, spingere l'argilla in uno strato uniforme sul fondo di una piastra di Petri di 35 x 10 millimetri.

E poi crea solchi paralleli in questo strato, usando uno strumento simile a una sonda per centri commerciali. Riempi il piatto foderato di argilla con circa 2 millilitri di Ficoll al 3% in 1x soluzione salina di Barth modificata, o MBS. E poi trasferire gli ovociti su di esso, utilizzando una pipetta a foro largo.

Posizionare gli ovociti nei boschetti in modo che vengano mantenuti in posizione durante la successiva microiniezione. Utilizzando un microiniettore, riempire un ago con circa due microlitri di un pool di mRNA precedentemente generato e regolare l'equilibrio per produrre una leggera pressione positiva, che impedirà al citoplasma degli ovociti di essere aspirato nell'ago durante l'iniezione. Quindi, iniettare ogni ovocita con 20 nanolitri di RNA nella regione equatoriale.

Successivamente, lasciare gli ovociti nel Ficoll MBS per un'ora, quindi trasferirli delicatamente in 1x MBS. Procedere all'incubazione degli ovociti per otto-24 ore a 20 gradi Celsius. Per iniziare il test del cappuccio animale, raccogliere 3/4 volte il terreno di anfibio normale, abbreviato in soluzione NAM, una pinza fine, un hairloop, ovociti precedentemente iniettati ed embrioni di xenopus allo stadio da 11 a 11,5.

Quindi, rompere i vetrini di copertura in frammenti di circa un millimetro per due millimetri e passare questi pezzi attraverso una fiamma fino a quando i loro bordi non si lucidano e si disegnano. Quindi, premere l'argilla in un unico strato in un piatto, come descritto in precedenza. E usa una sonda per centri commerciali per creare impronte individuali a forma di tazza in questo rivestimento.

Procedete a riempire il piatto con circa due millilitri di 3/4x NAM. E ad esso, trasferisci gli ovociti iniettati, posizionandone diversi in modo che ciascuno sia immobilizzato in un'unica rientranza. Per preparare gli embrioni, trasferirli in una capsula contenente 3/4x di soluzione NAM.

Selezionare un sottoinsieme di gastrula da utilizzare come controlli di stadiazione per l'età dell'ectoderma e trasferirli in un'altra piastra contenente la stessa soluzione. E mettete da parte questo piatto. Per gli embrioni che verranno utilizzati nell'assia del cappuccio animale, rimuovere le loro membrane vitelline con due paia di pinze sottili.

Successivamente, trasferire la gastrula nel piatto foderato di argilla con gli ovociti. Per iniziare, taglia i cappucci degli animali dagli embrioni usando due paia di prugne fini, facendo attenzione a evitare il tessuto equatoriale. Per generare ricombinanti utilizzando il primo metodo, posizionare i cappucci di un animale in modo che la superficie interna entri in contatto con l'emisfero animale di un ovocita, già posizionato in una rientranza.

E ripeti questo processo per molti degli ovociti iniettati. Per assicurarsi che questi ricombinanti siano tenuti insieme, posizionare un frammento di vetrino coprioggetti curvo sopra ciascuno di essi e applicare una pressione verso il basso fino a quando l'animale non è appiattito e il vetrino coprioggetti entra in contatto con l'argilla. Per generare ricombinanti utilizzando il secondo metodo, posizionare i cappucci e gli ovociti degli animali insieme in rientranze individuali vuote nell'argilla.

E assicurati che le superfici interne dei cappucci degli animali siano rivolte verso l'ovocita. Quindi, fissa i due tessuti insieme usando piccole estensioni di argilla. Una volta che più ricombinanti sono stati generati utilizzando uno dei due metodi, la coltura e il set-aside controllano gli embrioni a 20 gradi Celsius.

Quando gli embrioni di controllo raggiungono lo stadio desiderato, rimuovere i vetrini coprioggetti dai ricombinanti e isolare l'ectoderma del cappuccio dell'animale usando una pinza e un anello per capelli. Procedere al fissaggio di entrambi i frammenti ectodermici e agli embrioni di controllo in MEMFA per un'ora. E trasferiscili in etanolo e conserva questo tessuto a 20 gradi Celsius negativi.

Qui, set di ovociti sono stati iniettati con pool di mRNA corrispondenti a un numero progressivamente più piccolo di cloni o colonie, e poi, coltivati con cappucci animali. Successivamente, è stato determinato il numero di cappucci animali in ciascun set che esprimono foxe3, un marcatore normalmente osservato nel presunto ectoderma del cristallino dai primi stadi della placca neurale alla formazione delle vescicole, e utilizzato qui, per valutare la capacità di indurre il cristallino. Questo metodo è stato identificato nel gene codificante il fattore nucleare, ldb1, che può produrre una risposta che induce il cristallino in 50 su 179, ovvero il 28% dei cappucci animali valutati.

Mostrate qui, le nostre immagini di ibridazione in situ, raffiguranti il segnale foxe3, indicato da punte di freccia, in cappucci animali coltivati con ovociti iniettati con ldb1 all'incirca dallo stadio 11 allo stadio 23. Non è stata osservata alcuna espressione di foxe3 nei corrispondenti cappucci di controllo degli animali posizionati su ovociti non iniettati. Quando le sezioni sono state generate da questi cappucci animali, l'espressione di foxe3 è stata osservata sia negli strati ectodermici interni che esterni.

L'espressione nello strato interno è caratteristica di una risposta della lente. Oppure, come segnalato in entrambi gli strati, è indicativo di altre strutture come il placode olfattivo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi come l'immunoistochimica, l'ibridazione in situ o la rilevazione diretta di un gene reporter fluorescente per valutare una risposta induttiva nell'ectoderma del cappuccio animale.