Name: Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nellamigdala mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Scopri come combinare optogenetica e immunomarcatura su repliche di freeze-fracture per analizzare la densità dei recettori glutammatergici nelle sinapsi dell'amigdala del topo. Questo metodo consente l'analisi correlata struttura-funzione dei microcircuiti neuronali.

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Il finanziamento è stato fornito dalla sovvenzione FWF del Fondo austriaco per la scienza n. P-22969-B11 a F. Ferraguti, e dalla Charitable Hertie Foundation e dal Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience e dal DFG (CIN-Exc. 307) a I. Ehrlich.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

microscopia elettronica freeze-frattura è stata una tecnica importante nella ricerca ultrastrutturali per oltre 40 anni. Tuttavia, la mancanza di mezzi efficaci per studiare la composizione molecolare delle membrane ha prodotto un calo significativo nel suo utilizzo. Recentemente, vi è stata una notevole ripresa della microscopia elettronica freeze-frattura a causa dello sviluppo di mezzi efficaci per rivelare proteine ​​integrali di membrana mediante etichettatura immunogold 1, 2, cioè la tecnica FRIL. La tecnica FRIL possiede diversi vantaggi rispetto ad altri metodi ultrastrutturali immunogold. In primo luogo, le proteine ​​sono facilmente accessibili agli anticorpi aumentando la sensibilità. In secondo luogo, l&#39;esposizione di gran parte delle specializzazioni di membrana plasmatica, come la membrana postsinaptica, sulla superficie bidimensionale della replica permette l&#39;ispezione della distribuzione spaziale e contiguità fisica di molecole di interesse senza ricostruzione laborioso e richiede tempo di serisezioni al ultrasottili. In terzo luogo, la disponibilità di entrambe le metà della membrana plasmatica aumenta il numero di proteine ​​che possono essere identificate per ogni singola struttura, forniti anticorpi adatti sono disponibili. Su fratturazione, la faccia idrofoba della membrana scissione è rivestito con carbonio-platino che consolida domini proteici rimanenti sulla superficie fratturata. Questo impedisce l&#39;accesso di anticorpi diretti contro antigeni in questi domini. Per esempio sulla P-faccia di una replica soli epitopi di fronte allo spazio protoplasmatica possono essere rilevati da anticorpi, mentre sul E-faccia solo epitopi fronte spazio exoplasmic può essere vincolato da anticorpi (vedere Figura 2). D&#39;altra parte, la tecnica FRIL soffre anche di alcune limitazioni 2. Come fratture si verificano in modo casuale, potrebbe essere difficile per colpire le cellule o strutture specifiche. Questo può anche portare ad una distorsione di campionamento, ad esempio, in raccolta sinapsi, data la diversa probabilità di fracturing lungo la membrana di strutture con diversa curvatura (ad esempio spine contro alberi). Inoltre, l&#39;assegnazione di proteine ​​di membrana ad una delle due facce è imprevedibile. Pertanto, la distribuzione di una proteina per la P-faccia o E-face, in particolare per studi quantitativi, deve essere attentamente esaminata utilizzando anticorpi reattivi ai domini intracellulari ed extracellulari. Infine, l&#39;identificazione nella replica di alcune strutture, quali terminali assoni presinaptici, può essere difficile quando basata solo sulle caratteristiche morfologiche. Tuttavia, l&#39;uso di anticorpi specifici per proteine ​​marker o la trasduzione di proteine ​​integrali di membrana categoria o canali utilizzando vettori virali offre ulteriori strumenti per facilitare l&#39;identificazione delle membrane fratturati. Ad esempio, questo studio ha approfittato della trasduzione del ChR2-YFP nei neuroni del talamo per identificare i loro efferenze assonale nella amigdala e l&#39;etichettatura per i recettori μ-oppioidi per rivelare me postsinapticombranes di neuroni ITC. Al fine di eseguire la tecnica FRIL con successo, particolare attenzione dovrebbe essere presa per quanto riguarda la fissazione dei tessuti. Strong fissaggio del tessuto (&gt; 2% paraformaldeide) può causare un alto tasso di cross-fratture e una diminuzione della sensibilità etichettatura. D&#39;altra parte, fissazioni deboli rendono la manipolazione dei tessuti e preparazione (ad esempio, il taglio di sezioni) difficile. E &#39;anche importante controllare che lo spessore dei blocchi rifilati corrisponde allo spessore del nastro biadesivo. Se lo spessore del provino è inferiore a quella del nastro, la superficie del tessuto non potrebbero attaccarsi alla superficie dei due vettori di metallo, di conseguenza il campione congelato non si rompe. Se il tessuto è più spessa, verrà compresso con distorsioni strutturali inevitabili quando è fatto il panino dei due vettori di rame. La temperatura alla quale il campione è fratturato (in questo protocollo, -115 ° C) gioca un ruolo importantesulla struttura della replica. Temperature elevate possono produrre un più alto tasso di manufatti quali condensa del vapore acqueo sulla superficie del tessuto prima o durante l&#39;evaporazione. Temperature più basse (&lt;-125 ° C) può aumentare il rischio di scissione di materiale durante la fratturazione. Questo materiale può cadere sulla superficie del campione o rimanere in contatto con esso. Questi fiocchi di materiale sono anche rivestito e contrastato producendo macchie scure sull&#39;immagine. Frattura a temperature più basse può anche influenzare la frequenza di cross-fratture in particolare per le piccole strutture pregiati come spine dendritiche. Un ulteriore passo critico nella preparazione di repliche è detergente-digestione. Se la digestione è incompleta, il tessuto non digerito appare come macchie scure sulla replica, confondere l&#39;analisi della struttura al TEM. Inoltre, il tessuto non digerito può non specificamente-trap o legare gli anticorpi, aumentando l&#39;etichettatura di sfondo. D&#39;altra parte, l&#39;uso di detersivos per la digestione tessuto può denaturare le molecole associate replica alterarne le strutture secondarie e terziarie. Pertanto, per alcuni antigeni potrebbe essere necessario diluire gradualmente la concentrazione di SDS con fasi di lavaggio aggiuntivi. Per immunomarcatura, la disponibilità di diverse dimensioni di particelle d&#39;oro coniugata ad anticorpi secondari permette di rilevare contemporaneamente, ma solo qualitativamente, più proteine, anche in microdomini specifici della membrana plasmatica, come la specializzazione postsinaptico. Tuttavia, a causa dell&#39;impedimento sterico, studi quantitativi sono generalmente limitati alla rilevazione di una sola molecola. La dimensione della particella oro può anche influenzare l&#39;efficacia etichettatura. Per l&#39;interpretazione del etichettatura FRIL, va tenuto presente che la particella immunogold può essere posizionato ovunque all&#39;interno di una semisfera con raggio di 20-25 nm dalla dell&#39;antigene causa della forma complessa flessibilecati da l&#39;anticorpo primario e secondario 26. Per ulteriori informazioni sulla teoria e la pratica della FRIL e tecniche correlate, rimandiamo il lettore anche ad altri articoli metodologici 27, 28. La tecnica FRIL è stata utilizzata di recente per alta risoluzione analisi quantitative della localizzazione dei recettori del glutammato in diverse popolazioni sinapsi 29, 30. Inoltre, la sensibilità di rilevazione della tecnica FRIL per AMPA-R è stato stimato alto come una particella immunogold per uno AMPA funzionale -R canale 29. Quindi, questo approccio è nel complesso molto utile per quantificare e analizzare il pattern di espressione post-sinaptica di AMPA-R e NMDA-R a sinapsi centrali. Qui, abbiamo dimostrato la sua applicabilità a livello delle sinapsi PIN / MGN-ITC, un sito molto probabilmente importante per la trasmissione di informazioni degli Stati Uniti durante il condizionamento alla paura. Utilizzando un anticorpo sollevata contro i residui amminoacidici extracellulari altamente conservati delle subunità del recettore AMPA GluA1-GluA4, abbiamo trovato una distribuzione uniforme delle particelle d&#39;oro all&#39;interno di cluster IMP corrispondenti alle specializzazioni membrana post-sinaptica. La densità di AMPA-R in spine ITC era significativamente più alta rispetto a sinapsi albero mirati da PIN / MGN afferenze del talamo. Ad entrambe le sinapsi della colonna vertebrale e degli alberi, è stata rilevata una correlazione positiva tra l&#39;etichettatura per AMPA-R e l&#39;area post-sinaptici, una caratteristica comune ad altre sinapsi glutammatergica 25. La varianza bassa densità di AMPA-R in sinapsi PIN / MGN-ITC indica una distribuzione omogenea simile ad altre sinapsi formate da efferenze talamo 7, ma diverso da sinapsi corticali 25. Al contrario, la densità di NMDA-R è stato più variabile e non differiva tra la colonna vertebrale e dell&#39;albero sinapsi che suggeriscono un regolamento diverso da quello AMPA-R. In futuro, l&#39;alta riproducibilità della tecnica FRIL non solo permetterà di valutare la composizione molecolare basale di sinapsi centrali, ma può facilitare il rilevamento di cHANGES nel numero dei recettori ionotropici del glutammato e distribuzione subsinaptico dopo aver appreso la paura, che completano le registrazioni ex-vivo di proprietà pre e post-sinaptici di questi ingressi. In conclusione, questo approccio potrebbe essere utilizzato da altri ricercatori per ottenere informazioni in rapporti struttura-funzione delle sinapsi eccitatorie specifico ingresso in molti altri circuiti neurali in cui districare l&#39;origine degli ingressi e la natura e la composizione di elementi postsinaptici è cruciale ma problematico .

La definizione dell&#39;architettura funzionale di biomembrane a scala nanometrica è stata contestata negli ultimi anni dallo sviluppo di una serie di tecniche immunomarcatura adatti per la microscopia elettronica a trasmissione. Tuttavia, queste tecniche, ad esempio, pre e post-embedding immunogold, hanno un certo numero di importanti limitazioni, che includono scarsa rilevazione di antigeni e / o valutazione quantitativa limitata di proteine ​​di membrana. Queste limitazioni diventano particolarmente critico nelle indagini della struttura fine del sistema nervoso, caratterizzato da un elevato grado di diversità delle cellule e sinapsi eterogeneità. Questa eterogeneità risultati di diversità sia strutturale e funzionale dettata dagli elementi pre-e post-sinaptici e con l&#39;espressione differenziale, arricchimento, o interazione di proteine ​​di segnalazione, come ad esempio i recettori, i trasportatori e le molecole effettrici. Un nuovo approccio per immunolabe direttaling di proteine ​​di membrana integrali o reticolate in repliche freeze-frattura detergente-solubilizzato (FRIL) è stata originariamente introdotta da Fujimoto due decenni fa 1. Questo metodo originale aveva, tuttavia, alcune limitazioni, per esempio, una grave frammentazione delle repliche, che hanno ostacolato le correlazioni significative di molecole marcate con celle mappate individualmente in tessuti complessi come il cervello. Circa 10 anni fa, e Shigemoto Fukazawa progressivamente migliorato la tecnica 2. Questo è stato di pari passo con gli sforzi di un altro gruppo di scienziati presso i laboratori Boulder della Colorado State University, che ha anche migliorato in modo significativo la tecnica, in particolare per lo studio delle giunzioni 3. Il miglioramento protocolli freeze-fratturazione e macchine, nonché l&#39;introduzione di congelamento rapido (ad alta pressione), consente ora investigatori di produrre repliche ininterrotta di esemplari di dimensioni relativamente grandi e hiimmagini di qualità gh della maggior parte dei componenti cellulari, senza le limitazioni ed i manufatti prodotti dai forti fissazioni chimici. La tecnica FRIL offre il grande vantaggio di una elevata quantitativa nell&#39;identificazione situ di uno o più proteine ​​(simultaneamente) in istologicamente mappati e cellule citologicamente individuati all&#39;interno dei tessuti complessi come il cervello, con il vantaggio aggiuntivo di una vista in pianta di pre- e postsinaptico elementi in una singola replica. Pertanto, la tecnica FRIL, nonostante i suoi molti ostacoli tecnici, mantiene la promessa per un numero di molto significative scoperte scientifiche, in particolare per la correlazione delle proprietà strutturali e funzionali di singole sinapsi. Durante gli ultimi decenni, una grande quantità di informazioni sono state ottenute sulla struttura, molecolare compongono, e la funzione fisiologica di sinapsi; eppure sinapsi sono morfologicamente e molecolarmente molto diversi a seconda della pa pre e post-sinapticaaffitto neuroni 4. Solo per una manciata di tipi di sinapsi sono stati studi struttura-funzione realizzato finora 5-7. Ciò è dovuto principalmente al vincoli tecnici che impedivano una precisa identificazione della natura degli elementi pre- e postsinaptici. Analisi ultrastrutturale ha fornito spunti critici nella variabilità delle specializzazioni post-sinaptici di membrana attraverso contatti sinaptici distinti, sia in termini di dimensioni sinaptica e contenuti in recettori per i neurotrasmettitori 6, che ha un grande impatto sulla forza e la plasticità della trasmissione sinaptica. Inoltre, un grande corpo di ricerca indica che il numero di recettori del glutammato ionotropici espressi a diversi tipi di sinapsi è regolata in modo afferent- e bersaglio-dipendenti 7-10. Qui, un metodo viene descritto che permette l&#39;analisi della composizione struttura e recettori di membrana specializzazioni postsinaptici Con definireelementi presinaptici d e funzione. Questo approccio sfrutta espressione presinaptica di recente sviluppo proteine ​​algali sensibili alla luce, come Channelrhodopsin2 (ChR2), e della tecnica FRIL per analizzare il pattern di espressione postsinaptico di α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic L&#39;acido (AMPA-R) e N-metil-D-aspartato (NMDA-R) recettori del glutammato. Questo è dimostrato a livello delle sinapsi formate da assoni provenienti dai nuclei posteriori genicolati talamo-mediali (PIN / MGN) sui neuroni delle masse di cellule intercalate dell&#39;amigdala (ITC). Neuroni ITC sono piccole celle GABAergici spinosi organizzate in cluster che circondano il complesso basolaterale amigdaloideo (BLA) 11, 12. Neuroni ITC sono noti per ricevere input eccitatori da BLA neuroni principali e di indirizzare il nucleo centrale (CEA), fungendo così da un cancello inibitorio per il flusso di informazioni tra il BLA e CEA 12-15. Recentemente, abbiamo dimostrato che l&#39;ITNeuroni C situati nel cluster medio-dorsale tra il BLA e CEA ricevono anche gli ingressi eccitatori diretti e convergenti da sensoriali regioni corticali del talamo e temporali, che sono modificati sulla paura di apprendimento durante pavloviano paura condizionata uditivo 16. La paura condizionata è una delle forme più comprensibili di apprendimento associativo in termini di meccanismi cerebrali. Nel condizionamento alla paura, un inizialmente neutrale stimolo condizionato (CS, ad esempio, un tono) è accoppiato con uno stimolo avversivo incondizionato (Stati Uniti, ad esempio, una scossa piede dolce) con un conseguente associazione CS-US e condizionato risposta di paura 17, 18. Excitatory ingressi da entrambe le aree talamiche e neocorticale, che trasportano le informazioni che rappresentano il CS e gli stati Uniti, rispettivamente, erano noti per convergere su neuroni piramidali del nucleo laterale dell&#39;amigdala (lA) e a subire la plasticità 19. Il nostro lavoro precedente ha rivelato che le informazioni di input sensoriale è anche in parallelo trasmesso ai neuroni ITC <sup&gt; 16. Come primo passo verso una analisi molecolare meccanicistica di input sensoriali singole sinapsi sui neuroni ITC, abbiamo utilizzato un virus adeno-associato (AAV) per esprimere ChR2 etichettato con la proteina fluorescente gialla (YFP). Il AAV è stata iniettata PIN / MGN ei terminali assoni sono stati identificati dal loro espressione di ChR2-YFP. Abbiamo utilizzato entrambe le facce generati dalla tecnica FRIL per valutare la densità di post-sinaptici AMPA-R e NMDA-R a livello delle sinapsi formate con ITC neuroni di terminali degli assoni PIN / MGN.

<table><tbody><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>può essere sostituito da un altro stereotassico frame per topi</td></tr><tr><td>Stereotactic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Maschera per anestesia gassosa per topi</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>non più disponibile, sostituito dall'articolo n. 51609M</td></tr><tr><td>Dispositivo di iniezione a pressione, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>è possibile utilizzare altri dispositivi di iniezione a pressione (ad es. Picospritzer)</td></tr><tr><td>Capillari in vetro Kwik Fill</td><td>World Precision Instruments, Germania</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germania</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura CC e termoforo</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore orizzontale per micropipette Modello P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore per strumenti chirurgici, sterilizzatore 75</td><td>Melag, Germania</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (sierotipo 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>verde veloce</td><td>Roth, Germania</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Anestetico isoflurano, isofurano CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antisettico, Betadine (providone-iodio)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>può essere sostituito da altri disinfettanti</td></tr><tr><td>Analgesico, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germania</td><td></td><td>può essere sostituito da altri analgesici</td></tr><tr><td>Bepanthen unguento oculare</td><td>Bayer, Germania</td><td>0191</td><td>può essere sostituito da altri unguenti oculari</td></tr><tr><td>Trapano NM3000 (SNKG1341 e SNIH1681)</td><td>Nouvag, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura di seta intrecciata</td><td>Fine Science Tools, Germania</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti</td></tr><tr><td>Preparazione tissutale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide EM grade Agar</td><td>Scientific Ltd., Regno Unito</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido picrico saturo</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H20</td><td>Merck Millipore, Germania</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-2H2O&nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germania</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germania</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germania</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Tiopentale</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5.133</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acqua ultrapura GenPure</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td></td>50131235</tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>ISMATEC, Germania</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germania</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi oftalmico</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>può essere sostituito da altri bisturi oftalmici</td></tr><tr><td>Cannula per perfusione</td><td>Vieweg, Germania</td><td>F560088-1</td><td>può essere sostituito da articoli simili di altre aziende</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>High-pressure&nbsp; Congelamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supporti in rame</td><td>Ufficio tecnico M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germania</td><td></td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Pelle di camoscio</td><td>Negozio</td><td></td><td></td>di articoli per la casa</tr><tr><td>Perforatore, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Etanolo denaturato</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>può essere sostituito con lo stesso prodotto di altre aziende</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germania</td><td>9372.5</td><td>ATTENZIONE!</td></tr><tr><td>Macchina per il congelamento ad alta pressione HPM 010</td><td>BalTec, CH; ora Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>non più prodotta, sostituita da LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus, Giappone</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td> liquido <td>ATTENZIONE!</td></tr><tr><td>Cryo-fiale</td><td>Roth, Germania</td><td>E309.1</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Recipiente di stoccaggio di azoto liquido</td><td>Cryopal, Francia</td><td>GT38</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Detersivo non ionico (Lavocid)</td><td>Werner & Mertz Professional, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>Congelamento-frattura e replicazione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sabbiatrice, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten & Kettenbaum, Germania</td><td>SANDURET 2-K</td><td>può essere sostituito con lo stesso prodotto di altre aziende</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, granulometria 25 - 21&micro;</td><td>SCHERZO Joisten & Kettenbaum, Germania</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Sistema per fratture da congelamento BAF 060</td><td>BalTec, CH; ora Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Piastra ceramica a 12 pozzetti</td><td>Gr&ouml; pel, Austria</td><td>14511</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Trizma cloridrato</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Merck, Germany</td><td>1.064.041.000</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>SDS, Sodio lauril solfato</td><td>Roth, Germania</td><td>5136.1</td><td>ATTENZIONE! ; &nbsp; può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germania</td><td>1.076.871.000</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germania</td><td>5429.3</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven Binder</td><td>, Germany</td><td>7001-0050</td><td>può essere sostituito con lo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Immunolabelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>può essere sostituito dallo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Sonde molecolari</td><td>anticorpi anti-GFP</td>, USA <td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td><td>Frontier Institute, Giappone</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NMDAR1, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Germania</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM capra anti-cavia, 5 nm; anticorpo secondario</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM. GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM capra anti-coniglio, 15 nm; anticorpo secondario</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM. GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio, 10nm, anticorpo secondario</td><td>AURION, Paesi Bassi</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Griglie di rame, 100 barre parallele</td><td> Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>può essere sostituito dallo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&nbsp; Agar scientific, Regno Unito</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Roth, Germania</td><td>3313.1</td><td>ATTENZIONE! ; &nbsp; può essere sostituito dallo stesso articolo di altre aziende</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Numero di catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte</td></tr><tr><td>><forte>Analisi EM</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, software di imaging</td><td>Soft Imaging Systems, Germania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinato optogenetic e freeze-frattura replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

microscopia elettronica freeze-frattura è stata una tecnica importante nella ricerca ultrastrutturali per oltre 40 anni. Tuttavia, la mancanza di mezzi efficaci per studiare la composizione molecolare delle membrane ha prodotto un calo significativo nel suo utilizzo. Recentemente, c&#39;è stata una grande rinascita in freeze-frattura di microscopia elettronica grazie allo sviluppo di modi efficaci per rivelare proteine ​​integrali di membrana mediante l&#39;etichettatura immunogold. Uno di questi metodi è noto come detergente-solubilizzato Fermo-frattura Replica immunomarcatura (FRIL). La combinazione della tecnica FRIL con optogenetics consente un&#39;analisi correlata delle proprietà strutturali e funzionali delle sinapsi centrali. Usando questo approccio, è possibile identificare e caratterizzare neuroni sia pre-e post-sinaptici dai rispettivi espressione di un channelrhodopsin etichettato e marcatori molecolari specifici. L&#39;aspetto distintivo della specializzazione membrana post-sinaptica di GlutamatErgic sinapsi consente inoltre, su etichettatura dei recettori del glutammato ionotropi, per quantificare e analizzare la distribuzione intrasynaptic di questi recettori. Qui, diamo una descrizione step-by-step delle procedure richieste per la preparazione repliche associato e come immunolabel loro. Discuteremo anche gli avvertimenti e le limitazioni della tecnica FRIL, in particolare quelli associati con potenziali errori di campionamento. L&#39;elevata riproducibilità e la versatilità della tecnica FRIL, quando combinato con optogenetics, offre un approccio molto potente per la caratterizzazione dei diversi aspetti della trasmissione sinaptica a microcircuiti neuronali identificate nel cervello. Qui, forniamo un esempio di come questo approccio è stato utilizzato per acquisire conoscenze in relazioni struttura-funzione delle sinapsi eccitatorie in neuroni delle masse di cellule intercalate dell&#39;amigdala mouse. In particolare, abbiamo studiato l&#39;espressione dei recettori del glutammato ionotropici agli ingressi identificate oiginated dal intralaminare posteriore del talamo e nuclei genicolati mediale. Queste sinapsi sono stati mostrati per trasmettere informazioni sensoriali rilevanti per l&#39;apprendimento e la paura di subire cambiamenti plastici sulla paura condizionata.

La tecnica FRIL, quando combinato con l&#39;espressione di attuatori optogenetic di origine microbica 21, vale a dire, i canali integrati nella membrana plasmatica ed efficace trasportati anterogradely lungo gli assoni, permette di esaminare quantitativamente l&#39;espressione post-sinaptica di AMPA-R e NMDA-R in un sottogruppo definito delle sinapsi. Questo è mostrato qui per gli assoni provenienti da nuclei del talamo distinti (ad esempio, PIN / MGN) sui neuroni ITC nell&#39;amigdala. Questo approccio consente una analisi molecolare di singole sinapsi di input sensoriali sui neuroni ITC, un gruppo di cellule che sono stati refrattari ad una caratterizzazione anatomica e molecolare dettagliato finora. Quattro settimane dopo l&#39;iniezione stereotassica del rAAV-ChR2-YFP nella PIN / MGN, assoni ChR2-YFP-positivi densamente innervati il ​​LA, l&#39;area amygdalostriatal di transizione (Astria) e il paracapsular I mediale<html> TC cluster nel amigdala, un modello pienamente coerente con tracciamento studi precedenti 16, 22. Abbiamo anche rilevato intenso oro immunomarcatura per il ChR2-YFP sul P-faccia degli assoni e terminali in freeze-frattura replica da rAAV-ChR2-YFP- topi iniettati (Figura 5A), ma non in repliche di topi non iniettati. La specializzazione membrana post-sinaptica di sinapsi glutammatergica in una replica può essere osservata come un gruppo di particelle intramembrane (PIM) sulla E-faccia della membrana plasmatica 2, 23, ed è spesso accompagnata dalla P-faccia della sua membrana plasmatica presinaptica 7 (Figura 5B-C). Queste caratteristiche hanno permesso di identificare la specializzazione postsinaptica delle sinapsi glutammatergica formate da terminali degli assoni PIN / mgN (figura 5 e 6). Abbiamo etichettato AMPA-R con un anticorpo che riconosce tutti i quattro subunità (GluA1-4), mentre NMDA-R sono state rilevate utilizzando un anticorpo contro l&#39;essenziale subunità NR1. S copi &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; A causa della mancanza di strumenti per rilevare sulla stessa replica se queste sinapsi sono stati realizzati con spine dendritiche o alberi di neuroni ITC, abbiamo identificato il volto replica corrispondente per μ recettori oppioidi, come neuroni esprimono ITC postsinaptica elevati livelli di questi recettori 24. Questo necessari all&#39;identificazione degli stessi profili postsinaptici nei due repliche (Figura 5C-F e Figura 6A-D) utilizzando una strategia che impiega punti di riferimento (Figura 4E) . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> Figura 5. Individuazione di ChR2-YFP e ionotropi glutammato recettori sulla replica da Immunogold particelle. (A) un terminale cross-fratturato assone (azzurro) e piccole porzioni del suo P-faccia marcato con particelle d&#39;oro 15 nm rilevazione ChR2-YFP. All&#39;interno del terminale, la membrana of numerose vescicole sinaptiche possono essere osservati (sv). Nota la specificità del immunomarcatura in gran parte ristretta alla membrana plasmatica. Etichettatura per ChR2 identifica il terminale come proveniente da PIN / MGN. Il terminale forma un sinapsi asimmetrica con una spina dorsale. La specializzazione membrana post-sinaptica (PSD) sulla E-viso mostra un cluster caratteristica di particelle intramembrane ed è identificata con particelle d&#39;oro 5 nm rivelano AMPA-R. (B) Il P-volto di un assone ChR2 che esprimono (marcato con 15 particelle d&#39;oro nm) viene mostrato al confine con due dendriti, uno di loro possiede due PSD marcati con particelle d&#39;oro 5 nm rivelano NMDA-R. (CD) facce opposte delle membrane pre e post-sinaptici di una sinapsi PIN / MGN-ITC. (C) Il P-faccia del terminale esprime ChR2 (marcato con particelle d&#39;oro 15 nm) e si estende per l&#39;E-volto di due alberi dendritiche, uno dei quali contiene due PSD etichettati per AMPA-R (5 particelle nm oro). ( <strong&gt; D) La corrispondente P-face dei due dendriti è etichettato per i recettori μ-oppioidi (10 particelle nm oro). (EF) viste ingrandite delle zone indicate dalle linee tratteggiate. Barre di scala:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Immunoparticelle per AMPA-R nelle sinapsi PIN / MGN-ITC sono stati trovati in tutto il cluster IMP, suggerendo una distribuzione omogenea all&#39;interno della specializzazione post-sinaptica (Figura 5E). A significativamente più alta (spaiato t-test p &lt;0.018) Densità di etichettatura AMPA-R è stata osservata in PIN / MGN sinapsi su spine ITC (715 ± 38 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 32) rispetto alle sinapsi Onto dendriti ITC (590 ± 44 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 32). Nel complesso, la densità di AMPA-R in PIN sinapsi / MGN-ITC ha mostrato un relativamente bassovarianza (Coefficiente di variazione, CV = 0,37) conformemente ad una distribuzione omogenea. Immunoparticelle per NMDA-R nelle sinapsi PIN / MGN-ITC sono stati spesso osservato equamente distribuiti all&#39;interno di cluster IMP post-sinaptici (Figura 5B). La densità di etichettatura NMDA-R è stata simile (spaiato t-test p = 0.39) tra il PIN / MGN sinapsi su spine ITC (1070 ± 153 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 8) e dendriti ITC (812 ± 183 particelle d&#39;oro / micron 2, n = 9). A differenza di quanto osservato per AMPA-R, la densità di NMDA-R in PIN sinapsi / MGN-ITC era molto variabile (CV = 0,54). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> Figura 6. AMPA-R e NMDA-Rs immunomarcatura a identificati PIN / MGN-ITC sinapsi. (AB) facce opposte delle membrane pre e post-sinaptici di un PIN / MGN-ITCsinapsi fatta su una spina dendritica in cui il P-faccia del terminale esprime ChR2 (etichettato con 15 particelle d&#39;oro nm) e la PSD su una spina dendritica è etichettato per AMPA-R (5 particelle nm oro). (CD) viste ingrandite delle aree contornate dalla linea tratteggiata. Queste zone sono stati ruotati di circa 45 ° in senso antiorario per permettere una migliore visione del PSD. (E) a dispersione del numero di particelle AMPA-R contro zona sinaptica in spine ITC e dendriti. In entrambe le strutture, una correlazione positiva è stata osservata. (F) a dispersione del numero di particelle NMDA-R contro zona sinaptica in spine ITC e dendriti. Una significativa correlazione positiva è stata rilevata solo in spine dendritiche. Barre di scala:. 500 nm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Perchéil P-faccia della membrana plasmatica presinaptica spesso sovrapposto nella parte del cluster PIM post-sinaptica, potremmo stimare l&#39;area sinaptica di solo il 30% delle sinapsi (spine: significano zona 0,032 micron 2, gamma: 0,007-0,063 um 2, n = 8; dendriti: 0,047 micron 2, gamma: 0.024 a 0,166 micron 2, n = 11). Questi erano in una gamma simile come precedentemente analizzato glutamatergica telencefalico sinapsi 25. In entrambe le spine e dendriti, il numero di immunoparticelle oro per AMPA-R in singole sinapsi era correlata positivamente con l&#39;area sinaptica (Spearman, spine: r = 0.88, dendriti: r = 0.60, p &lt;0,0001) (Figura 6E). Viceversa, il numero di immunoparticelle oro per NMDA-Rs è risultata correlare con la zona sinaptica spine (Spearman, spine: r = 0,90, p &lt;0.002) ma non in dendriti (r = 0,21, p = 0,29) (Figura 6F ).

Questo articolo illustra come l'espressione dei recettori dei neurotrasmettitori possa essere quantificata e il pattern analizzato nelle sinapsi con elementi pre e postsinaptici identificati utilizzando una combinazione di trasduzione virale di strumenti optogenetici e la tecnica di immunomarcatura della replica della frattura da congelamento.

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell&#39;amigdala mouse

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Lo scopo di questa procedura, che combina l'optogenetica con la tecnica di immunomarcatura su replica di congelamento-frattura, è analizzare la densità dei recettori ionotropici del glutammato a livello delle sinapsi nell'amigdala del topo, con elementi pre- e post-sinaptici identificati. L'elevata riproducibilità e versatilità della tecnica di immunomarcatura su replica di congelamento-frattura, quando combinata con l'optogenetica, offre un approccio estremamente potente per l'analisi correlata delle proprietà strutturali e funzionali delle sinapsi. I principali vantaggi di questa procedura sono: la vista planare degli elementi pre- e post-sinaptici e l'analisi quantitativa delle proteine in questi microdomini specializzati.È possibile adattare diverse tecniche a una varietà di tessuti differenti per studiare la distribuzione e l'organizzazione delle proteine integrali di membrana. In generale, questo approccio combinato di FRIL optogenetico rappresenta una sfida per i principianti a causa della vasta gamma di apparecchiature e macchinari necessari. È fondamentale iniziare la modulazione con un metodo diverso, poiché alcuni passaggi successivi risultano difficili da apprendere.Come la fratturazione e la replica di campioni congelati. Per iniziare questa procedura, incollare un blocco coronale di cervello di topo sul supporto del vibrotagliente. Orientare il blocco di tessuto in modo che la neocorteccia sia rivolta verso la lama vibrante. Successivamente, tagliare sezioni corona­li contenenti l'amigdala con uno spessore di 140 micrometri in PBS 0,1 M freddo di ghiaccio. E raccoglierle in una piastra a sei pozzetti contenente lo stesso tampone.Sotto un microscopio stereoscopico, ritagliare la regione di interesse dalle sezioni in una piastra di Petri rivestita con elastomero di silicone e riempita con tampone fosfato 0,1 M. Successivamente, trasferire il blocco ritagliato nella soluzione crioprotettiva e lasciarlo in overnight a 6 °C. In questo passaggio, preparare i portatori di rame per l'uso nelle successive fasi della procedura FRIL, lucidandoli con un foglio di pelle di daino come rimozione della patina. Sotto il microscopio, applicare un anello di nastro adesivo doppia faccia sul portatore di rame, che fungerà da pozzetto di contenimento per il blocco ritagliato.Quindi, posizionare il blocco tagliato nel foro del nastro bifacciale utilizzando un anello di platino. Rimuovere la soluzione crioprotettiva in eccesso con una carta da filtro o un pennello. Successivamente, coprire il portapreparati con un altro portapreparati.In modo che il blocco di tessuto sia inserito tra i due supporti. Per congelare il campione, inserire il sandwich di supporti nel portacampione. Successivamente, inserire il portacampione nell'unità di congelamento ad alta pressione.Avviare il ciclo di congelamento premendo il pulsante jet-auto, rimuovere immediatamente il portacampioni e immergere la punta in un contenitore isolato contenente azoto liquido. Successivamente, rimuovere con attenzione il sandwich portante dal portacampioni e posizionarlo in una cryovial pre-raffreddata. Conservare le cryovial contenenti i portanti in un criotubo fino alla replicazione.Prima di inserire la pistola del fascio elettronico, rimuovere lo schermo con la piastra deflettente. Inserire il calibro di regolazione, per la centratura del filamento, nel mandrino attraverso il coperchio catodico inferiore. Successivamente, far scorrere il nuovo filamento sul calibro, fino a quando le lamelle di pressione non bloccano le estremità del filamento.Quindi, rimuovere il calibro di regolazione e inserire l'asta di carbonio. Fissarla serrando il mandrino portautensile del supporto dell'asta dell'evaporatore, assicurandosi che l'altezza dell'estremità dell'asta corrisponda al centro della seconda spirale a partire dal basso.In seguito, sostituire la piastra deflettore e inserire la pistola a fascio di elettroni nell'unità di criofrattura. In questa procedura, regolare la corrente e la tensione per l'evaporazione. Successivamente, inserire il sandwich con il portatore congelato nella tavola per doppia replica in azoto liquido.Quindi, trasferire la tavola a doppia replica nel recipiente Dewar e fissarla al supporto del campione con un angolo di 45 gradi. Prelevare la tavola a doppia replica mediante un manipolatore per tavole. Inserirla nell'unità di criofrattura sullo stadio freddo e attendere circa 20 minuti per consentire alla temperatura della tavola a doppia replica di stabilizzarsi a meno 115 gradi Celsius.In seguito, frantumare il tessuto ruotando manualmente la ruota in senso antiorario, che è collegata alla copertura sopra il tavolo a doppia replica. Quando la copertura ruota, forza l'apertura del tavolo a doppia replica, causando la frattura del tessuto. Uno strato di carbonio applicato ad angolo di 90 gradi viene depositato sulle superfici fratturate.Successivamente, rimuovere i campioni replicati dal tavolo a doppia replica e trasferirli in una piastra ceramica a 12 pozzetti riempita con TBS. Utilizzando un'asticella di platino a filo ad anello, rimuovere il tessuto replicato dal portacampione. Per la digestione con SDS, trasferire una replica in un vial di vetro da quattro millilitri contenente un millilitro di buffer per la digestione con SDS.Lasciare digerire per 18 ore a 80 gradi Celsius con agitazione. Per l'immunomarcatura, lavare la replica per 10 minuti in tampone di digestione SDS fresco. Successivamente, incubarla con anticorpi primari e secondari, diluiti in BSA-TBS al 2%, in una camera umida a 15 gradi Celsius per 24-72 ore.In seguito, montare la replica su una griglia parallela da 100 linee rivestita con film di Far. Acquisire l'immagine della replica mediante microscopio elettronico a trasmissione a 80 o 100 chilovolt. Quindi, acquisire le immagini digitali attraverso una telecamera CCD.Quando è offline, individuare le regioni corrispondenti sull'immagine della replica, utilizzando diversi punti di riferimento. Quattro settimane dopo l'iniezione di AAV, per esprimere la Channelrhodopsin-2 nel gruppo nucleare talamico posteriore, la Channelrhodopsin-2 viene trasportata in modo efficace in senso anterogrado lungo gli assoni talamici fino a raggiungere le masse cellulari intercalate dell'amigdala. La specializzazione post-sinaptica delle sinapsi glutammatergiche può essere riconosciuta in una replica come un aggregato di particelle intramembranose sulla faccia E della membrana plasmatica, ed è spesso accompagnata dalla faccia P dell'elemento pre-sinaptico corrispondente.Qui, la channelrodopsina-2 e i recettori per il glutammato sono stati visualizzati utilizzando particelle d'oro di dimensioni diverse coniugate agli anticorpi secondari. A causa della mancanza di strumenti strutturali o molecolari per rilevare sulla stessa replica se la membrana postsinaptica apparteneva ai neuroni intercalati, la replica corrispondente è stata marcata per i recettori mu-opioidi, un marcatore specifico per questi neuroni.Come esempio dell'analisi quantitativa della densità dei recettori del glutammato in queste sinapsi, qui sono riportati i grafici a dispersione del numero di particelle d'oro per i recettori AMPA in funzione dell'area sinaptica su spine e dendriti, che mostrano una correlazione positiva in entrambe le strutture. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che i singoli passaggi sono fortemente interdipendenti.Pertanto, un errore in una delle fasi può compromettere l'intera procedura. La visualizzazione di ampie porzioni di specializzazioni della membrana plasmatica sulla superficie bidimensionale della replica permette l'analisi della distribuzione spaziale e della continuità fisica delle molecole di interesse, senza la laboriosa e lunga ricostruzione di sezioni seriali di artrophin. Questo approccio può essere utilizzato da altri ricercatori per ottenere informazioni sulle relazioni struttura-funzione di sinapsi specifiche nei circuiti neurali.Laddove è fondamentale, ma problematico, chiarire l'origine degli input e la natura degli elementi postsinaptici.

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Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nellamigdala mouse (Video) | JoVE Journal

Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell'amigdala mouse

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