Combinato optogenetic e Freeze-frattura Replica immunomarcatura per esaminare specifica disposizione-Input di glutammato recettori nell'amigdala mouse

L'obiettivo di questa procedura, che combina l'optogenetica con la tecnica di immunomarcatura della replica della criofrattura, è analizzare la densità dei recettori ionotropici del glutammato nelle sinapsi dell'amigdala di topo con elementi pre e post sinaptici identificati. L'elevata riproducibilità e versatilità di questa tecnica di immunomarcatura della replica della frattura da congelamento, se combinata con l'optogenetica, offre un approccio molto potente per l'analisi correlata delle proprietà strutturali e funzionali delle sinapsi. I principali vantaggi di questa procedura sono: la visione planare degli elementi pre e post sinaptici e l'analisi quantitativa delle proteine in questi micro-domini specializzati.

Diverse tecniche possono essere adattate a una varietà di tessuti diversi per studiare la distribuzione e l'organizzazione delle proteine integrali di membrana. In generale, questo approccio FRIL optogenetico combinato è impegnativo per i principianti a causa dell'ampia gamma di diversi apparecchi e macchine richieste. Iniziare la modulazione con un metodo diverso è fondamentale poiché alcuni altri passaggi sono difficili da imparare.

Come la fratturazione e la replicazione di campioni congelati Per iniziare questa procedura, incollare un blocco coronale di cervello di topo sul supporto del vibro-affettatore. Orientare il blocco di tessuto in modo che la neocorteccia sia rivolta verso la lama vibrante. Successivamente, tagliare le sezioni coronali contenenti l'amigdala a uno spessore di 140 micrometri in PB ghiacciato virgola uno molare. E raccoglili in un piatto a sei pozzetti nello stesso tampone.

Sotto uno stereomicroscopio, ritagliare la regione di interesse dalle fette, in una capsula di Petri rivestita di elastomero siliconico e riempita con PB a punto zero. Quindi, trasferire il blocco tagliato nella soluzione di crioprotezione e mantenerlo per una notte a sei gradi Celsius. In questa fase, preparare i supporti in rame per l'uso nelle fasi successive della procedura FRIL, lucidandoli con un foglio di pelle scamosciata come solvente per l'ossidazione. Al microscopio, attacca un anello di nastro biadesivo al supporto di rame, che fungerà da pozzetto di tenuta per il blocco tagliato.

Quindi, posiziona il blocco rifilato nel foro del nastro biadesivo utilizzando un anello di filo di platino. Rimuovere la soluzione crioprotettiva in eccesso utilizzando una carta da filtro o un pennello. Successivamente, coprire il supporto con un altro supporto.

In modo che il blocco di tessuto sia inserito tra i due vettori. Per congelare il campione, inserire il sandwich di supporto nel supporto del campione. Successivamente, inserire il portacampioni nell'unità di congelamento ad alta pressione.

Avviare il ciclo di congelamento premendo il pulsante jet-auto, rimuovere immediatamente il portacampioni e immergere il puntale in una scatola isolata con azoto liquido. Quindi, rimuovere con cautela il sandwich portante dal supporto del campione e metterlo in un crioviale pre-raffreddato. Conservare i crioviali contenenti i supporti in un crioserbatoio fino alla replica.

Prima di inserire la pistola a fascio di elettroni, rimuovere lo schermo con la piastra deflettore. Posizionare il calibro di regolazione, per centrare il filamento, nella pinza di serraggio attraverso il coperchio del catodo inferiore. Quindi, fai scorrere il nuovo filamento sul manometro, fino a quando le lamine di pressione bloccano le estremità del filamento.

Quindi, rimuovere il calibro di regolazione e inserire l'asta di carbonio. Fissarlo, serrando il mandrino della pinza del supporto dell'asta dell'evaporatore. Assicurarsi che l'altezza dell'estremità dell'asta sia al centro della seconda bobina dal basso.

Successivamente, sostituire la piastra deflettore e inserire la pistola a fascio di elettroni nell'unità di congelamento-frattura. In questa procedura, regolare la corrente e la tensione per l'evaporazione. Quindi, inserire il sandwich vettore congelato nel tavolo a doppia replica in azoto liquido.

Quindi, trasferire il tavolo a doppia replica sul recipiente Dewar e fissarlo al ricevitore dello stadio del campione con un angolo di 45 gradi. Raccogli il tavolo a doppia replica con un manipolatore da tavolo. Inserirlo nell'unità di congelamento-frattura sul tavolino freddo e attendere circa 20 minuti per consentire alla temperatura del tavolo a doppia replica di regolarsi a -115 gradi Celsius.

Successivamente, fratturare il tessuto ruotando manualmente la ruota in senso antiorario, che è collegata alla copertura sopra il tavolo a doppia replica. Quando la sindone gira, costringe il tavolo a doppia replica ad aprirsi, con conseguente frattura del tessuto. Uno strato di carbonio da un angolo di 90 gradi viene applicato alle facce fratturate.

Successivamente, rimuovere i campioni replicati dal tavolo a doppia replica e trasferirli su una piastra in ceramica a 12 pozzetti riempita con TBS. Utilizzando una barra di filo ad anello in platino, rimuovere il tessuto replicato dal portacampioni. Per la digestione SDS, trasferire una replica in una fiala di vetro da quattro millilitri riempita con un millilitro di tampone per la digestione SDS.

Lasciarlo digerire per 18 ore a 80 gradi Celsius agitandolo. Per l'immunomarcatura, lavare la replica per 10 minuti in un tampone di digestione SDS fresco. Quindi, incubarlo con anticorpi primari e secondari, diluiti in 2%BSA-TBS, in una camera umida a 15 gradi Celsius per 24-72 ore.

Successivamente, montare la replica su una griglia a barre parallele a 100 linee rivestita in forma. Immagina la replica con un microscopio elettronico a trasmissione a 80 o 100 kilovolt. Quindi, acquisisci le immagini digitali attraverso una telecamera CCD.

Quando è offline, trova le regioni corrispondenti sull'immagine dalla replica, utilizzando diversi punti di riferimento. Quattro settimane dopo l'iniezione di AAV, per esprimere la Channelrhodopsin-2 nel gruppo nucleare talamico posteriore, la Channelrhodopsin-2 viene efficacemente trasportata anterogradamente lungo gli assoni talamici per raggiungere le masse cellulari intercalate dell'amigdala. La specializzazione post-sinaptica delle sinapsi glutammatergiche può essere riconosciuta in una replica come un ammasso di particelle intramembrana sulla faccia E della membrana plasmatica, ed è spesso accompagnata dalla faccia P del suo elemento presinaptico.

Qui, i recettori della canalrodopsina-2 e del glutammato sono stati visualizzati utilizzando particelle d'oro di diverse dimensioni coniugate agli anticorpi secondari. A causa della mancanza di strumenti strutturali o molecolari per rilevare sulla stessa replica se la membrana postsinaptica appartenesse ai neuroni intercalati. La replica corrispondente è stata etichettata per i recettori oppioidi mu, un marcatore per questi neuroni.

Come esempio dell'analisi quantitativa della densità del recettore del glutammato in queste sinapsi, ecco i grafici a dispersione del numero di particelle d'oro per i recettori ampa rispetto all'area sinaptica su spine e dendriti. Che rivelano una correlazione positiva in entrambe le strutture. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i singoli passaggi sono altamente interdipendenti.

Pertanto, un errore in uno dei passaggi può compromettere l'intera procedura. La visualizzazione di un'ampia porzione di specializzazioni della membrana plasmatica su una superficie bidimensionale della replica, consente l'ispezione della distribuzione spaziale e della continuità fisica delle molecole di interesse senza la laboriosa e dispendiosa ricostruzione di sezioni seriali di artrofinia. Questo approccio può essere utilizzato da altri ricercatori per ottenere informazioni sulle relazioni struttura-funzione di sinapsi specifiche nei circuiti neurali.

Dove si sta districando l'origine degli input e la natura degli elementi postsinaptici. È cruciale, ma problematico.