A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

L'obiettivo generale di questo metodo è quantificare rapidamente e a costi contenuti diversi biomarcatori nel liquido cerebrospinale, o CSF, al fine di valutarne l'utilizzo per la diagnosi e il monitoraggio del trattamento. Si tratta di un nuovo saggio che ci consente di misurare biomarcatori che in precedenza non era possibile dosare. Riteniamo che questo approccio possa essere impiegato a scopi diagnostici, nonché per differenziare tra diverse malattie neurodegenerative e potenzialmente fornire anche informazioni prognostiche.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che è stata progettata per essere rapida, semplice nella preparazione del campione, altamente specifica ed economicamente vantaggiosa per l'applicazione in laboratori clinici. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia o la diagnosi, poiché questo test ad alto rendimento può essere utilizzato in futuri studi clinici per nuove terapie nella neurodegenerazione. Questa metodologia può inoltre essere applicata ad altre malattie e tessuti, come l'urina per i disturbi renali, il plasma per la cardiomiopatia e le cellule per la pluripotenza.

Per iniziare questa procedura, risospendere i peptidi sintetici desiderati a una concentrazione stock di un milligrammo per millilitro, seguendo le istruzioni del produttore. Preparare diluizioni 1:10 del peptido a partire dalla concentrazione stock e raccogliere 1.000 picomoli di ciascun peptido in un tubo microcentrifuga a bassa adesività. Essiccare il campione di peptidi miscelato in un concentratore SpeedVac.

Al termine, conservare il campione a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, aliquotare 100 microlitri di LCR in provette microcentrifuga a basso legame. Liofilizzare i campioni di LCR.

Risospendere un'aliquote del campione peptidico combinato nel buffer di digestione per ottenere concentrazioni di 10 e un picomole per microlitro. Successivamente, aggiungere il campione peptidico combinato nei campioni di LCR (liquor cefalorachidiano) liofilizzati da 100 microlitri a concentrazioni pari a zero, uno, due, cinque, 10 e 15 picomolari. Quindi, aggiungere 20 nanogrammi di una proteina integra non correlata per fungere da standard interno e controllo dell'efficienza di digestione della tripsina.

Aggiungere tampone di digestione agli aliquote di liquido cefalorachidiano fino a un volume finale di 20 microlitri e vortexare i campioni. Successivamente, digerire i campioni seguendo il protocollo standard aggiungendo 1,5 microlitri di dithiotreitolo e agitando a temperatura ambiente per un'ora. Dopo di ciò, aggiungere tre microlitri di iodacetamide ai campioni e agitare a temperatura ambiente per 45 minuti al buio.

Quindi, aggiungere 165 microlitri di acqua bidistillata. Aggiungere 10 microlitri di una soluzione di tripsina modificata di grado per sequenziamento a 0,1 microgrammi per microlitro, risospesa in tampone di bicarbonato di ammonio 50 millimolare, ai campioni. Incubare i campioni in bagno termostatato a 37 gradi Celsius per tutta la notte.

Quindi, arrestare la digestione congelando i campioni. Dopo aver scongelato i digesti del LCR su ghiaccio, centrifugare a 16.000 × g per 10 minuti. Al termine, trasferire 60 microlitri di ciascun digesto in un vial in vetro da 300 microlitri.

Utilizzando un sistema LC-MS dotato di una colonna UPLC C18, iniettare la concentrazione più elevata del punto della curva standard mediante un gradiente lineare di acetonitrile da 1 a 40% della durata di 10 minuti. Al termine della corsa, aprire il cromatogramma risultante nel software e annotare il tempo di ritenzione e le due transizioni più intense per ciascun peptide. Sulla base di queste informazioni, aggiornare un metodo di monitoraggio di reazione multipla (MRM) precedentemente creato, aggiungendo canali temporizzati per la misurazione dei peptide.

Per mantenere la sensibilità, mantenere ogni canale con un numero di punti per picco superiore a otto e un tempo di permanenza superiore a 0,01 secondi per almeno una transizione per ciascun peptide. Includere ritardi del solvente nel metodo MRM selezionando i ritardi del solvente negli eventi del metodo all'interno del file del metodo MS. È fondamentale abbinare correttamente il picco giusto in un metodo HPLC breve.

Questo può essere eseguito utilizzando i peptidi aggiunti in modo controllato nella matrice, che vengono impiegati per la curva standard, osservando le transizioni multiple durante lo sviluppo del metodo. Infine, esaminare manualmente l'annotazione dei dati per garantirne l'accuratezza. Analizzare ciascun peptide e il relativo rapporto rispetto a uno standard interno marcatore con isotopi stabili adeguato.

Qui è mostrato un cromatogramma dei marcatori peptidici significativi ottenuti dal saggio ad alto rendimento del liquido cerebrospinale (CSF). I dati forniscono rapporti standardizzati rispetto allo standard interno etichettato con isotopo stabile, che possono essere utilizzati per determinare le concentrazioni assolute del CSF e analizzati statisticamente per rilevare variazioni nei campioni clinici. La quantificazione dei 74 peptidi inclusi in questo saggio del CSF ha rivelato che 25 erano significativamente alterati nel CSF dei pazienti con demenza, e qui vengono mostrati i risultati relativi ai marcatori della demenza pro-orexina e proteina simile alla chitinasi-3 YKL.

ApoE4 è un fattore di rischio noto per la malattia di Alzheimer, e il rilevamento degli isoformi di ApoE si basa sul rilevamento dei peptidi corrispondenti alle variazioni degli amminoacidi negli isoformi E2 ed E4. Il profilo di picchi previsto per ciascuna combinazione di isoformi è mostrato qui. Una volta impostato il metodo, il saggio può essere eseguito in un giorno, se effettuato correttamente. Dopo lo sviluppo di questo metodo, è stato possibile misurare un nuovo insieme di biomarcatori con elevata sensibilità e specificità analitica, consentendo ai ricercatori di valutare le malattie neurodegenerative in un modo del tutto nuovo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e ottimizzare un saggio MRM per sensibilità e specificità. Non dimenticare che lavorare con DTE, termiti, acido formico e tessuto umano può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'uso di guanti, devono essere adottate durante questa procedura.