A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di quantificare in modo rapido ed economico più biomarcatori nel liquido cerebrospinale, o CSF, per valutarne l'uso per la diagnosi e il monitoraggio del trattamento. Si tratta di un nuovo test che ci consente di misurare biomarcatori che prima non era possibile misurare. E pensiamo che questo possa essere utilizzato per scopi diagnostici e anche per differenziare tra diverse malattie neurodegenerative e potenzialmente anche fornire informazioni prognostiche.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è progettata per essere rapida, semplice nella preparazione dei campioni, altamente specifica ed economica per la traduzione nel laboratorio clinico. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi, poiché questo test ad alto rendimento può essere utilizzato in futuri studi clinici per nuove terapie nella neurodegenerazione. Questa metodologia può essere applicata anche ad altre malattie e tessuti, come le urine per i disturbi renali, il plasma per la cardiomiopatia e le cellule per la pluripotenza.

Per iniziare questa procedura, risospendere i peptidi sintetici desiderati a una concentrazione di un milligrammo per millilitro, secondo le istruzioni del produttore. Preparare una diluizione su 10 del peptide dalla concentrazione madre e raggruppare 1.000 picomoli di ciascun peptide in una provetta per microcentrifuga a basso legante. Essiccare il campione di peptidi raggruppato in un concentratore SpeedVac.

Al termine, conservare il campione a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, aliquotare 100 microlitri di liquido cerebrospinale in provette per microcentrifuga a basso legame. Liofilizzare i campioni di liquido cerebrospinale.

Risospendere un'aliquota del campione peptidico aggregato nel tampone di digestione per ottenere concentrazioni di 10 e un picomolo per microlitro. Ora, aggiungi il campione di peptide raggruppato nelle aliquote liofilizzate da 100 microlitri di CSF, a zero, uno, due, cinque, 10 e 15 concentrazioni picomolari. Quindi, aggiungere 20 nanogrammi di proteina intatta non correlata per fungere da standard interno e controllare l'efficienza digestiva della tripsina.

Aggiungere il tampone digest alle aliquote del liquido cerebrospinale fino a un volume finale di 20 microlitri e agitare i campioni. Successivamente, digerire i campioni secondo il protocollo standard aggiungendo 1,5 microlitri di ditiotreitolo e agitando a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, aggiungere tre microlitri di iodoacetamide ai campioni e agitare a temperatura ambiente per 45 minuti al buio.

Quindi, aggiungere 165 microlitri di acqua bidistillata. Aggiungere ai campioni 10 microlitri di una soluzione di tripsina modificata di grado sequenziamento da 0,1 microgrammi per microlitro, risospesa in tampone di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari. Incubare i campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius durante la notte.

Quindi, interrompere la digestione congelando i campioni. Dopo aver scongelato i digriti del liquido cerebrospinale con ghiaccio, centrifugare a 16.000 volte g per 10 minuti. Al termine, trasferire 60 microlitri di ogni digestato in un inserto di vetro da 300 microlitri vile.

Utilizzando un sistema LC-MS, dotato di una colonna UPLC C18, iniettare la massima concentrazione dal punto di curva standard utilizzando un gradiente lineare di acetonitrile da 10 minuti a 40%. Una volta completata la corsa, aprire il cromatogramma risultante nel software e annotare il tempo di ritenzione e le prime due transizioni più intense per peptide. Sulla base di queste informazioni, aggiornare un metodo di monitoraggio a reazione multipla creato in precedenza o MRM con canali temporizzati per misurare i peptidi.

Per mantenere la sensibilità, mantenere ogni canale con punti per picco superiori a otto e tempo di permanenza superiore a 0,01 secondi per almeno una transizione per ciascun peptide. Includere i ritardi del solvente nel metodo MRM selezionando i ritardi del solvente negli eventi del metodo nel file del metodo MS. È fondamentale abbinare correttamente il picco corretto in un metodo HPLC corto.

Questo può essere fatto utilizzando i peptidi spiked nella matrice che vengono utilizzati per una curva standard e osservando le transizioni multiple durante lo sviluppo del metodo. Infine, rivedi manualmente l'annotazione dei dati per garantire l'accuratezza. Analizza ogni peptide e il rapporto con uno standard interno appropriato marcato con isotopi stabili.

Di seguito è mostrato un cromatogramma dei marcatori peptidici significativi del test CSF ad alto rendimento. I dati forniscono rapporti standardizzati con lo standard interno marcato con isotopi stabili pertinente, che può essere utilizzato per determinare le concentrazioni assolute di CSF e analizzato statisticamente per i cambiamenti nei campioni clinici. La quantificazione dei 74 peptidi inclusi in questo test del liquido cerebrospinale ha rivelato che 25 erano alterati in modo significativo nel liquido cerebrospinale dei pazienti con demenza, e i risultati dei marcatori di demenza pro-orexina e la proteina YKL chitinasi-3-simile sono mostrati qui.

L'ApoE4 è un noto fattore di rischio per la malattia di Alzheimer e la rilevazione delle isoforme di ApoE si basa sulla rilevazione dei peptidi corrispondenti per le variazioni degli aminoacidi per le isoforme E2 ed E4. Il modello di picco previsto per ciascuna combinazione di isoforme è mostrato qui. Una volta impostato il metodo, il test può essere eseguito in un giorno se viene eseguito correttamente. Dopo lo sviluppo di questo metodo, è stato possibile misurare una nuova serie di biomarcatori con un'elevata sensibilità analitica e specificità, e questo consentirà ai ricercatori di valutare le malattie neurodegenerative in un modo nuovo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e ottimizzare un test MRM per sensibilità e specificità. Non dimenticare che lavorare con DTE, termiti, acido formico e tessuti umani può essere estremamente pericoloso e durante questa procedura dovrebbero essere applicate precauzioni, come indossare guanti.