Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di riportare otticamente le variazioni di potenziale di membrana con un indicatore di tensione geneticamente codificato. Questo metodo descriverà i punti di forza e di debolezza dell'imaging con diverse sonde fluorescenti di voltaggio geneticamente codificate. Ad esempio, le sonde basate su FRET offriranno il vantaggio dell'imaging raziometrico ma forniranno un segnale più basso.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo visualizzare l'attività neurale in tempo reale. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché il rapporto segnale/rumore non è molto grande e ci sono diverse fonti di rumore e più passaggi che possono andare storti. I nuovi utenti sono spesso confusi e l'interferenza è considerata il vero segnale.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per accertare la validità delle sonde utilizzate e ciò che indica effettivamente. Per la configurazione, uno splitter di immagini è installato tra le telecamere CCD lente e veloci per l'imaging di GEVI basati su FRET. Prima dell'esperimento, inserire un cubo filtrante con uno specchio dicroico e due filtri di emissione nello splitter di immagini.

Rimuovere questo secondo cubo filtrante durante l'imaging di un GEVI con una singola proteina fluorescente. Per iniziare l'esperimento, individuare una cellula HEK293 sana che mostri una fluorescenza di membrana forte e localizzata rispetto alla fluorescenza interna ed evitare di applicare patch alle cellule circolari poiché si stanno dividendo o morendo. Quindi applicare un impulso di prova per verificare la risposta corrente.

Successivamente, abbassare la pipetta patch clamp proprio sopra la superficie della cellula. Quindi, abbassare lentamente la pipetta fino a toccare delicatamente la membrana cellulare. La resistenza della membrana dovrebbe aumentare a uno o due megaohm.

Successivamente, stabilire una tenuta gigaohm applicando delicatamente una pressione negativa attraverso la pipetta. Una volta ottenuta una tenuta gigaohm, impostare il potenziale della pipetta al potenziale di tenuta desiderato. Quindi, mettere a fuoco la telecamera CCD ad alta velocità sul corpo della cella.

Per la registrazione GEVI basata su FRET, regolare le dimensioni delle immagini divise in modo da ottenere una visione uniformemente distanziata per ciascuna lunghezza d'onda di emissione utilizzando le manopole sullo splitter di immagini. Quindi rompere la membrana cellulare applicando una pressione negativa per formare l'intera configurazione cellulare. Ora apri il software di imaging.

Quindi fare clic sul menu di acquisizione della telecamera SciMeasure per aprire la pagina di acquisizione CCD. Quindi, crea un nuovo file di dati per salvare la registrazione. Fare clic su uscita analogica e quindi leggere un ASCII per aprire un file di protocollo a impulsi al fine di eseguire l'imaging.

Quindi fare clic sulla media delle ripetizioni interne per calcolare la media del numero di prove. Quindi chiudere la pagina dell'uscita analogica. Impostare i parametri di acquisizione specifici nella pagina di acquisizione CCD.

Dopodiché inserisci i valori specifici per il numero di fotogrammi per l'acquisizione e il numero di prove. Quindi, fai clic sul pulsante Acquisisci ottica dati più BNC per avviare la registrazione. Durante l'imaging della tensione, monitorare l'oscilloscopio per garantire una configurazione stabile dell'intera cella durante la registrazione.

Per calcolare la modifica della fluorescenza frazionaria, fare clic su File e quindi su Leggi file di dati per aprire un file di dati registrato nel passaggio precedente. L'immagine della cellula nella sua intensità di luce a riposo dovrebbe essere vista sul lato destro. Quindi, fai clic su mostra BNC per mostrare i valori di tensione finale corrente.

Modificare la modalità pagina da RLI frame a frame subtraction per utilizzare la funzione di sottrazione frame per identificare i pixel con segnali ottici reattivi. Successivamente, selezionare due punti temporali per la sottrazione e identificare l'area cellulare che mostra i segnali in risposta al cambiamento di potenziale di membrana. Quindi, designare i pixel che devono essere analizzati trascinando o facendo clic su ciascun pixel.

La rappresentazione grafica dell'intensità media di fluorescenza dei pixel selezionati dovrebbe apparire sul lato sinistro della finestra del software. Dividi i pixel sottratti con l'intensità della luce a riposo facendo clic sul pulsante Dividi per RLI per acquisire i valori di variazione della fluorescenza frazionaria. Per esportare i dati, rimuovere i grafici della tensione finale corrente deselezionando Mostra menu BNC.

Vai all'output, salva le tracce come ASCII visualizzate per esportare la traccia di fluorescenza in un formato di file ASCII per l'analisi dell'adattamento della curva. In questa procedura, disegnare il grafico della variazione della fluorescenza rispetto alla tensione tracciando le variazioni di fluorescenza frazionaria in risposta alla tensione in un programma di analisi dei dati. Successivamente adattare la curva a una funzione di Boltzmann per determinare l'intervallo di tensione del segnale ottico facendo clic su analisi, adattamento, adattamento sigmoidale e quindi finestra di dialogo aperta.

Ritraccia le variazioni di fluorescenza frazionaria normalizzate in risposta alla tensione utilizzando il programma di analisi dei dati. Per calcolare la velocità della risposta ottica, aprire il file ASCII e tracciare la traccia della variazione di fluorescenza frazionaria rispetto al tempo. Quindi fare clic sul selettore dati nel software di analisi dei dati e selezionare un punto temporale corrispondente all'inizio di un impulso di tensione a gradini e un secondo punto temporale in cui il segnale ottico ha raggiunto lo stato stazionario.

Adatta questo intervallo a una funzione di decadimento esponenziale singolo e doppio facendo clic su analisi, adattamento, adattamento esponenziale, quindi apri finestra di dialogo e segnala l'adattamento migliore. Questa figura mostra la variazione di fluorescenza di una cellula HEK che esprime un singolo GEVI Bongwoori basato su FP. Si tratta di una tipica variazione di fluorescenza in risposta agli impulsi di tensione a gradini.

Qui una cella HEK293 è stata ripresa con una telecamera CCD ad alta velocità. Questa immagine mostra l'intensità della luce a riposo di una cellula che esprime Bongwoori. E questa è un'immagine di sottrazione di fotogrammi che indica i pixel in cui è stato osservato il cambiamento di fluorescenza.

Qui è mostrata la registrazione ottica dei potenziali d'azione indotti dai neuroni primari dell'ippocampo di topo che esprimono Bongwoori. I potenziali d'azione sono stati evocati in modalità di clamp delle correnti dell'intera cella. La traccia di variazione della fluorescenza frazionaria è stata selezionata dai pixel correlati al soma.

In questa figura, la variazione di fluorescenza di una cella HEK che esprime GEVI basata su FRET mostra le risposte agli impulsi di tensione a gradini in due lunghezze d'onda. Registrato a un kilohertz con una telecamera CCD ad alta velocità. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di testare livelli di fluorescenza variabili, poiché la sovraespressione della fluorescenza può influire sulla salute della cellula.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come le codifiche slicer, per rispondere a ulteriori domande che coinvolgono l'attività neuronale di vari circuiti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare il potenziale di membrana utilizzando diversi tipi di sonda.