Name: Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Impara a rilevare i cambiamenti del potenziale di membrana con indicatori di tensione geneticamente codificati. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale dell'attività neuronale, sebbene presenti sfide interpretative.

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Questo lavoro è stato supportato dal programma World Class Institute (WCI) della National Research Foundation of Korea finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia della Corea Grant WCI 2009-003 e dal Korea Institute of Science and Technology Institutional Program Project 2E24210. Sungmoo Lee è stata supportata dal Global Ph.D. Fellowship program (NRF-2013H1A2A1033344) della National Research Foundation (NRF) sotto il Ministero dell'Istruzione (MOE, Corea).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sistema nervoso utilizza tensione in diversi modi, inibizione provoca un leggero iperpolarizzazione, ingresso sinaptica provoca un leggero depolarizzazione e un&#39;azione potenziali risultati in un cambiamento relativamente grande tensione. La possibilità di misurare le variazioni del potenziale di membrana dalla Gevis offre il potenziale promettente di analizzare diversi componenti di circuiti neuronali contemporaneamente. In questo rapporto si dimostra un metodo fondamentale per le modifiche di imaging del potenzi...

Il principale obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l&#39;imaging ottico delle variazioni di potenziali di membrana in vitro utilizzando proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate. cambiamenti di imaging del potenziale di membrana offre l&#39;eccitante possibilità di studiare l&#39;attività dei circuiti neuronali. Quando i cambiamenti nella membrana risultato potenziale in un cambiamento intensità di fluorescenza, ogni pixel della telecamera diventa un elettrodo surrogata per misure non intrusivi di attività neuronale. Da oltre quarant&#39;anni, coloranti organici voltaggio-sensibile sono stati utili per osservare i cambiamenti nel potenziale di membrana 1-4. Tuttavia, questi coloranti mancano di specificità cellulare. Inoltre, alcuni tipi di cellule sono difficili da macchiare. indicatori di tensione geneticamente codificati (GeViS) superare queste limitazioni avendo le cellule da studiare specificamente esprimono la sonda fluorescente tensione-sensibili. Ci sono tre classi di Gevis. La prima classe di GEVI utilizza il vodominio della fosfatasi tensione-sensing ensione-sensing con una singola proteina fluorescente (FP) 5-9 o un paio 10-12 un Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). La seconda classe di sensori utilizza microbica rodopsina come indicatore fluorescente direttamente 13-15 o tramite FRET elettrocromico 16,17. La terza classe utilizza due componenti, il componente genetica essendo un FP membrana ancorata ed un secondo componente essendo una membrana vincolato tempra colorante 18-20. Mentre il secondo e terzo classi sono utili per esperimenti in vitro e fetta 19,20, solo la prima classe di sensori sono attualmente utile per analisi in vivo 6. In questo rapporto ci sarà dimostrare l&#39;imaging del potenziale di membrana utilizzando la prima classe di Gevis (figura 1) in vitro. Questa prima classe di sensori di tensione è il più facile da passare a imaging in vivo. Dal momento che Gevis utilizing un dominio di rilevamento della tensione fuso ad una FP sono circa 50 volte più luminoso classe rodopsina dei sensori, possono essere ripreso con illuminazione lampada ad arco anziché richiedere un laser estremamente potente. Un&#39;altra conseguenza della disparità di luminosità è che la prima classe di GeViS può facilmente superare l&#39;auto-fluorescenza del cervello. Le sonde rodopsina-based non può. La terza classe di sensore è altrettanto chiaro come la prima classe, ma richiede l&#39;aggiunta di un quencher chimico che è difficile da gestire in vivo. Noi, quindi, dimostrare l&#39;acquisizione di una sonda con un singolo FP (Bongwoori) 8 e una sonda costituita da una coppia FRET (Nabi 2) 12. Il FRET costruisce in questo rapporto sono versioni farfalla di VSFP-CR (proteine ​​fluorescenti voltaggio-sensibile - Clover-mRuby2) 11 costituito da un donatore fluorescente verde, trifoglio, e un accettore fluorescente rossa, mRuby2, chiamato Nabi 2.242 e 2.244 Nabi <sup&gt; 12. L&#39;introduzione di questi tipi di registrazioni dovrebbe dare ai ricercatori una migliore comprensione del tipo di Gevis di informazione in grado di fornire. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Figura 1. due tipi di indicatori geneticamente codificati tensione (Gevis) Divisori stampati in questo rapporto (A) Un FP mono basato GEVI avere un dominio di tensione-sensing trans-membrana e una proteina fluorescente. (B) Un GEVI basato FRET composto da un dominio di tensione-sensing trans-membrana, un donatore tasto e accettore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscopio Invertito</td><td>Obiettivo Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X (apertura numerica = 1,35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td><td>Per l'imaging di tensione della pHluorin super eclittica in Bongwoori</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Lampada ad arco allo xeno</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource</td><td>Illuminatore LED e laser sono anche sorgenti luminose efficaci</td></tr><tr><td>Telecamera CCD a bassa velocità</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per fotocamera a doppia porta</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD ad alta velocità</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Splitter di immagini</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>Per l'imaging della tensione di GEVI basato su coppie FRET composto da Clover e mRuby2)</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di isolamento dalle vibrazioni</td><td>Sistemi cinetici</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Camera di patching</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - vetrino coprioggetti in vetro diametro 10 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Agente di lipofezione</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Reagente fosfato di calcio</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore patch clamp</td> Amplificatore <td></td><td>USB HEKA</td><td>EPC 10</td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati multicanale</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione e analisi delle immagini</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Software applicativo per fogli di calcolo</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>di analisi datiOriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lente d'ingrandimento</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem Accoppiatore fotocamera standard 0,38x SC38 J clamp</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td></td></tr><tr><td>Reagente anti-sbiadimento</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Gli indicatori di tensione geneticamente codificati (GEVI) sono migliorati al punto che stanno iniziando ad essere utili per le registrazioni in vivo. Mentre l'obiettivo finale è quello di visualizzare l'attività neuronale in vivo, si deve essere in grado di visualizzare l'attività di una singola cellula per garantire il successo delle preparazioni in vivo. Questa procedura descriverà come visualizzare il potenziale di membrana in una singola cellula per fornire una base per l'imaging in vivo. Qui descriviamo i metodi per l'imaging di GEVI costituiti da un dominio di rilevamento del voltaggio fuso a una singola proteina fluorescente (FP) o a due proteine fluorescenti in grado di trasferire energia di risonanza di Förster (FRET) in vitro. L'utilizzo di uno splitter di immagini consente la proiezione simultanea di immagini create da due diverse lunghezze d'onda sulla stessa fotocamera CCD (Charge-Coupled Device). Lo splitter di immagini posiziona un secondo cubo filtro nel percorso della luce. Questo secondo cubo filtrante è costituito da un dicroico e due filtri di emissione per separare le lunghezze d'onda fluorescenti del donatore e dell'accettore a seconda degli FP del GEVI. Questa configurazione consente la registrazione simultanea dei partner fluorescenti accettori e donatori mentre il potenziale di membrana viene manipolato tramite la configurazione del patch clamp per l'intera cellula. Quando si utilizza un GEVI costituito da un singolo FP, il secondo cubo filtro può essere rimosso consentendo agli specchi nello splitter di immagini di proiettare una singola immagine sulla camera CCD.

Transitoriamente cellule transfettate possono presentare una significativa variazione di intensità di fluorescenza e il grado di espressione membrana plasmatica. Anche sullo stesso vetrino alcune cellule avranno diversi livelli di fluorescenza interna. Questo è probabilmente dovuto alla quantità di agente trasfezione assorbita dalla cella. Di tanto in tanto, troppo espressione fa sì che la cellula di sperimentare la risposta proteina spiegato con conseguente apoptosi 27 (lumin...

Viene descritto un metodo per l'imaging dei cambiamenti nel potenziale di membrana utilizzando indicatori di tensione geneticamente codificati.

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

L'obiettivo generale di questa procedura è segnalare otticamente le variazioni del potenziale di membrana mediante un indicatore genetico del voltaggio. Questo metodo descriverà i punti di forza e di debolezza dell'imaging con diversi sonde fluorescenti codificate geneticamente per il voltaggio. Ad esempio, le sonde basate su FRET offriranno il vantaggio dell'imaging raziometrico ma forniranno un segnale inferiore.Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo visualizzare l'attività neurale in tempo reale. In generale, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché il rapporto segnale-rumore non è molto elevato e vi sono diverse fonti di rumore e diversi passaggi che possono presentare problemi. Gli utenti alle prime armi spesso si confondono e interpretano le interferenze come segnali reali.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per accertare la validità delle sonde utilizzate e ciò che esse indicano effettivamente. Per l'allestimento, un divisore d'immagine viene installato tra le telecamere CCD lenta e veloce per l'acquisizione di immagini di GEVI basati sul FRET. Prima dell'esperimento, inserire un cubetto filtro con uno specchio dicot

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Campo elettrico esterno induce una tensione sulla membrana di una cellula, chiamata potenziale di membrana indotta (ΔΦ). Usando il potenziometrica tintura di-8-ANEPPS, è possibile misurare la ΔΦ modo non invasivo. Questo video mostra il protocollo per la misurazione ΔΦ utilizzo di-8-ANEPPS.

Misurare la tensione indotta a membrana con Di-8-ANEPPS

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull'espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.

Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Presentiamo la metodologia per l'isolamento dei miociti murini e come ottenere tracce di tensione o calcio contemporaneamente con tracce di accorciamento sarcomero utilizzando la fotometria a fluorescenza con misurazioni simultanee della geometria cellulare digitale.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

Per lo studio delle risposte delle cellule eccitabili in vitro, il protocollo descrive il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate, nonché i cambiamenti nella tensione transmembrana con estrazione automatizzata dei parametri rilevanti.

Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate

Impara a rilevare i cambiamenti del potenziale di membrana con indicatori di tensione geneticamente codificati. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale dell'attività neuronale, sebbene presenti sfide interpretative.

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

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