Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione
4 febbraio 2016
Viene descritto un metodo per l'imaging dei cambiamenti nel potenziale di membrana utilizzando indicatori di tensione geneticamente codificati.
L'obiettivo generale di questa procedura è segnalare otticamente le variazioni del potenziale di membrana mediante un indicatore genetico del voltaggio. Questo metodo descriverà i punti di forza e di debolezza dell'imaging con diversi sonde fluorescenti codificate geneticamente per il voltaggio. Ad esempio, le sonde basate su FRET offriranno il vantaggio dell'imaging raziometrico ma forniranno un segnale inferiore.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo visualizzare l'attività neurale in tempo reale. In generale, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché il rapporto segnale-rumore non è molto elevato e vi sono diverse fonti di rumore e diversi passaggi che possono presentare problemi. Gli utenti alle prime armi spesso si confondono e interpretano le interferenze come segnali reali.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per accertare la validità delle sonde utilizzate e ciò che esse indicano effettivamente. Per l'allestimento, un divisore d'immagine viene installato tra le telecamere CCD lenta e veloce per l'acquisizione di immagini di GEVI basati sul FRET. Prima dell'esperimento, inserire un cubetto filtro con uno specchio dicotroico e due filtri di emissione nel divisore d'immagine.
Rimuovere questo secondo cubo del filtro quando si esegue l'imaging di un GEVI con una singola proteina fluorescente. Per iniziare l'esperimento, individuare una cellula HEK293 sana che mostri una fluorescenza membranosa intensa e localizzata rispetto alla fluorescenza interna ed evitare di sigillare cellule circolari poiché sono in fase di divisione o morenti. Applicare quindi un impulso di prova per verificare la risposta in corrente.
Successivamente, abbassare la pipetta per il patch clamp appena sopra la superficie della cellula. Quindi, abbassare lentamente la pipetta fino a quando tocca delicatamente la membrana cellulare. La resistenza della membrana dovrebbe aumentare da uno a due megaohm.
Successivamente, stabilire un sigillo gigaohm applicando delicatamente una pressione negativa attraverso la pipetta. Una volta ottenuto un sigillo gigaohm, impostare il potenziale della pipetta a un potenziale di mantenimento desiderato. In seguito, mettere a fuoco la telecamera CCD ad alta velocità sul corpo cellulare.
Per la registrazione del GEVI basata su FRET, regolare le dimensioni delle immagini divise in modo da ottenere una visualizzazione uniformemente spaziata per ciascuna lunghezza d'onda di emissione, utilizzando le manopole dello splitter di immagine. Quindi, rompere la membrana cellulare applicando una pressione negativa per formare la configurazione in intera cellula. A questo punto, aprire il software di acquisizione immagini.
Quindi fare clic su acquisisci menu della telecamera SciMeasure per aprire la pagina di acquisizione CCD. Successivamente, creare un nuovo file di dati per salvare la registrazione. Fare clic su uscita analogica e quindi leggere un ASCII per aprire un file di protocollo di impulsi al fine di eseguire l'acquisizione di immagini.
Successivamente, fare clic su "average" per mediare le ripetizioni interne e il numero di prove. Chiudere quindi la pagina di uscita analogica. Impostare i parametri specifici di acquisizione nella pagina di acquisizione CCD.
Dopo aver inserito i valori specifici per il numero di fotogrammi per l'acquisizione e il numero di prove, fare clic sul pulsante take data optics plus BNC per iniziare la registrazione. Durante l'acquisizione dell'immagine di tensione, monitorare l'oscilloscopio per garantire una configurazione whole-cell stabile per tutta la durata della registrazione.
Per calcolare la variazione frazionaria della fluorescenza, fare clic su file e quindi su leggi file dati per aprire un file di dati registrato nel passaggio precedente. L'immagine della cellula con la sua intensità luminosa a riposo dovrebbe essere visibile sul lato destro. Successivamente, fare clic su mostra BNC per visualizzare i valori attuali di tensione finale.
Modificare la modalità di pagina da frame RLI a sottrazione tra frame per utilizzare la funzione di sottrazione tra frame e identificare i pixel con segnali ottici rispondenti. Successivamente, selezionare due punti temporali per la sottrazione e identificare l'area cellulare che mostra segnali in risposta al cambiamento del potenziale di membrana. Quindi, delimitare i pixel da analizzare trascinando il cursore o facendo clic su ciascun pixel.
La rappresentazione grafica dell'intensità media della fluorescenza proveniente dai pixel selezionati dovrebbe apparire sul lato sinistro della finestra del software. Dividere i pixel sottratti per l'intensità luminosa a riposo facendo clic sul pulsante dividi per RLI per ottenere i valori della variazione frazionaria della fluorescenza. Per esportare i dati, rimuovere i grafici della tensione finale corrente deselezionando il menu mostra BNC.
Vai all'output e salva le tracce come ASCII visualizzate per esportare la traccia di fluorescenza in un formato di file ASCII da utilizzare nell'analisi di adattamento della curva. In questa procedura, traccia il grafico della variazione di fluorescenza in funzione del voltaggio riportando le variazioni frazionarie di fluorescenza in risposta al voltaggio in un programma di analisi dati. Successivamente, adatta la curva a una funzione di Boltzmann per determinare l'intervallo di voltaggio del segnale ottico cliccando su analisi, adattamento, adattamento sigmoideo, quindi apri la finestra di dialogo.
Ripotare le variazioni normalizzate della fluorescenza frazionaria in risposta alla tensione utilizzando il programma di analisi dati. Per calcolare la velocità della risposta ottica, aprire il file ASCII e riportare in grafico la traccia della variazione di fluorescenza frazionaria rispetto al tempo. Quindi fare clic sul selettore dati nel software di analisi dati e selezionare un punto temporale corrispondente all'inizio di un impulso di tensione a gradino e un secondo punto temporale in cui il segnale ottico ha raggiunto lo stato stazionario.
Adattare questo intervallo sia a una funzione di decadimento esponenziale singola che doppia facendo clic su analisi, adattamento, adattamento esponenziale, quindi aprire la finestra di dialogo e riportare l'adattamento migliore. Questa figura mostra la variazione della fluorescenza di una cellula HEK che esprime un GEVI basato su un singolo FP, Bongwoori. Questa è una variazione tipica della fluorescenza in risposta a impulsi di tensione a gradino.
Qui una cellula HEK293 è stata acquisita con una telecamera CCD ad alta velocità. Questa immagine mostra l'intensità luminosa di riposo di una cellula che esprime Bongwoori. E questa è un'immagine ottenuta per sottrazione di fotogrammi che indica i pixel in cui è stato osservato un cambiamento di fluorescenza.
Qui viene mostrata la registrazione ottica dei potenziali d'azione indotti nei neuroni primari dell'ippocampo di topo esprimenti Bongwoori. I potenziali d'azione sono stati evocati in modalità di blocco della corrente in configurazione whole-cell. La traccia della variazione frazionaria della fluorescenza è stata selezionata dai pixel correlati al soma.
In questa figura, la variazione della fluorescenza di una cellula HEK che esprime un GEVI basato sul FRET mostra le risposte a impulsi di tensione a gradino in due lunghezze d'onda. Registrato a un chilohertz con una telecamera CCD ad alta velocità. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di verificare i livelli variabili di fluorescenza, poiché la sovraespressione della fluorescenza può influenzare la salute della cellula.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come le codifiche con slicer per rispondere a ulteriori domande relative all'attività neuronale di vari circuiti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come immaginare il potenziale di membrana utilizzando diversi tipi di sonde.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per l'acquisizione di immagini dei cambiamenti nel potenziale di membrana mediante indicatori genetamente codificati del voltaggio. La tecnica consente la visualizzazione in tempo reale dell'attività neuronale, sebbene presenti alcune difficoltà per i nuovi utenti a causa di problemi legati al rumore e all'interpretazione del segnale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Gli indicatori genetici di potenziale elettrico vengono utilizzati per monitorare i cambiamenti del potenziale di membrana.
- Diversi sonde fluorescenti presentano punti di forza e di debolezza differenti.
- Le sonde basate sul FRET permettono un'analisi ratiometrica ma possono produrre segnali più deboli.
- Comprendere il rapporto segnale-rumore è fondamentale per un'interpretazione accurata.
Scopo dello studio
- Per segnalare otticamente le variazioni del potenziale di membrana.
- Per valutare l'efficacia di diverse sonde fluorescenti codificate geneticamente.
- Per fornire informazioni sulla visualizzazione dell'attività neurale in tempo reale.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di indicatori genetici del voltaggio.
- Confronto tra diverse tecniche di imaging.
- Analisi dei rapporti segnale-rumore.
- Valutazione delle difficoltà degli utenti nell'interpretare i segnali.
Risultati principali
- È possibile la visualizzazione in tempo reale dell'attività neuronale.
- I sonde basate sul FRET offrono vantaggi nonostante segnali più deboli.
- I nuovi utenti incontrano difficoltà a causa dell'interferenza del rumore.
- Una formazione adeguata è essenziale per distinguere i segnali reali dal rumore.
Conclusioni
- Gli indicatori genetici del potenziale elettrico sono preziosi per la ricerca in neuroscienze.
- Comprendere i limiti dei diversi sonde è fondamentale.
- La formazione e l'esperienza possono migliorare l'interpretazione del segnale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'uso di indicatori genetici di potenziale di membrana (GEVIs) per l'acquisizione di immagini consente la visualizzazione in tempo reale dell'elettrofisiologia cellulare, supportando la validazione precoce del bersaglio nella scoperta di farmaci nel campo delle neuroscienze. Questo metodo fornisce letture quantitative e dinamiche dell'attività neuronale, contribuendo alla riduzione del rischio meccanicistico mediante l'associazione degli effetti dei composti a variazioni funzionali del potenziale di membrana. Tale capacità migliora la sicurezza predittiva nell'identificazione dei composti promettenti, offrendo una segnalazione ottica diretta dell'interazione con il bersaglio in cellule vive.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rilevazione ottica della dinamica del potenziale di membrana in risposta a modulazioni farmacologiche.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del bersaglio attraverso la misurazione diretta e in tempo reale delle variazioni di potenziale in cellule vive che esprimono GEVIs.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nell'interazione con il bersaglio fornendo letture di fluorescenza raziometriche o basate sull'intensità correlate agli spostamenti di potenziale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Facilita la preparazione di sistemi cellulari validati (ad esempio, HEK293) per lo screening di composti mediante espressione stabile di GEVI e integrazione della tecnica del patch clamp su cellula intera.
- Output quantitativo: Permette l'acquisizione ratiometrica con GEVI basati su FRET, migliorando l'affidabilità del segnale e riducendo gli artefatti dovuti alla variabilità di espressione o al fotoblesamento.
- Scalabilità: Compatibile con l'acquisizione ad alta velocità mediante CCD e protocolli di stimolazione automatizzati, supportando prove ripetute e analisi dose-risposta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile a modelli neuronali (ad esempio, neuroni primari dell'ippocampo) per valutare gli effetti dei composti in contesti elettrofisiologici rilevanti per le patologie.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro al potenziale in vivo, stabilendo la competenza nell'imaging a livello di singola cellula come prerequisito per studi su tessuti complessi.
- De-risking meccanicistico: Permette di discriminare gli effetti specifici del composto sul potenziale di membrana dal rumore non specifico mediante sottrazione di frame e normalizzazione alla baseline.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'analisi iniziale del bersaglio all'ottimizzazione del composto leader, in cui le letture funzionali della tensione guidano la selezione dei composti prima dei test di efficacia preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi correlando segnali ottici con stimoli in voltage-clamp per validare la risposta della sonda e lo stato di salute cellulare.
- Screening: Fornisce misurazioni pronte per saggi, riproducibili, grazie a una configurazione standardizzata di tipo whole-cell e alla normalizzazione della fluorescenza di base.
- Analisi: Offre l'analisi del cambiamento frazionario della fluorescenza e l'analisi cinetica (adattamento esponenziale) per quantificare l'ampiezza del segnale e la velocità di risposta.
- Ricerca traslazionale: Consente il passaggio da modelli di singola cellula HEK293 a neuroni primari, supportando la valutazione della rilevanza traslazionale.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per studi sulla modulazione dei canali ionici in diverse classi di bersagli e campagne di screening.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo un monitoraggio ottico diretto e in tempo reale delle variazioni del potenziale di membrana come biomarcatore funzionale dell'attività neuronale.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione attraverso protocolli definiti di patch clamp, calibrazione dello splitter di immagine e passaggi analitici standardizzati (sottrazione di frame, normalizzazione RLI).
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo la rilevazione precoce di effetti elettrofisiologici fuori bersaglio, riducendo il rischio di abbandono in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio quantificando gli spostamenti di tensione indotti dai composti mediante soglie definite per il proseguimento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia (patch clamp in configurazione whole-cell), microscopia a fluorescenza e manipolazione dei GEVI.
- È dipendente da telecamere CCD ad alta velocità, divisori d'immagine e cubetti filtro per la rilevazione FRET a doppia lunghezza d'onda.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro di imaging ed elettrofisiologia per un'acquisizione dati coerente.
- Le considerazioni per l'adattamento includono il tipo di GEVI (FP singolo rispetto a basato su FRET), i livelli di espressione e l'idoneità della linea cellulare (ad esempio, evitare cellule HEK293 in divisione o morenti).
- I limiti pratici comprendono un basso rapporto segnale-rumore, la suscettibilità ad artefatti da sovraespressione e l'interpretazione del segnale ottico rispetto al rumore, dipendente dall'utilizzatore.
