Name: Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Impara a rilevare i cambiamenti del potenziale di membrana con indicatori di tensione geneticamente codificati. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale dell'attività neuronale, sebbene presenti sfide interpretative.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal programma World Class Institute (WCI) della National Research Foundation of Korea finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia della Corea Grant WCI 2009-003 e dal Korea Institute of Science and Technology Institutional Program Project 2E24210. Sungmoo Lee è stata supportata dal Global Ph.D. Fellowship program (NRF-2013H1A2A1033344) della National Research Foundation (NRF) sotto il Ministero dell'Istruzione (MOE, Corea).

<ol><li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246, 508-509 (1973).</li>
<li>Cohen, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+axon+fluorescence+during+activity%3A+molecular+probes+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential.</a> J. Membrane Biol. 19, 1-36 (1974).</li>
<li>Tasaki, I., Warashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-membrane+interaction+and+its+changes+during+nerve+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Dye-membrane interaction and its changes during nerve excitation.</a> Photochem Photobiol. 24, 191-207 (1976).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 874-885 (2004).</li>
<li>Jin, L., Han, Z., Platisa, J., Wooltorton, J. R., Cohen, L. B., Pieribone, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75, 779-785 (2012).</li>
<li>Cao, G., Platisa, J., Pieribone, V. A., Raccuglia, D., Kunst, M., Nitabach, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154, 904-913 (2013).</li>
<li>St-Pierre, F., Marshall, J. D., Yang, Y., Gong, Y., Schnitzer, M. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nat Neurosci. 17, 884-889 (2014).</li>
<li>Piao, H. H., Rajakumar, D., Kang, B. E., Kim, E. H., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+mutagenesis+of+the+voltage-sensing+domain+enables+the+optical+resolution+of+action+potentials+firing+at+60+Hz+by+a+genetically+encoded+fluorescent+sensor+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combinatorial mutagenesis of the voltage-sensing domain enables the optical resolution of action potentials firing at 60 Hz by a genetically encoded fluorescent sensor of membrane potential.</a> J Neurosci. 35, 372-385 (2015).</li>
<li>Jung, A., Garcia, J. E., Kim, E., Yoon, B. J., Baker, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+length+and+fusion+site+composition+improve+the+optical+signal+of+genetically+encoded+fluorescent+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophoton%22%5BJournal%5D)">Linker length and fusion site composition improve the optical signal of genetically encoded fluorescent voltage sensors.</a> Neurophoton. 2, 021012(2015).</li>
<li>Dimitrov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+an+enhanced+fluorescent+protein+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of an enhanced fluorescent protein voltage sensor.</a> PLoS One. 2, e440(2007).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9, 1005-1012 (2012).</li>
<li>Sung, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+fast+fluorescent+protein+voltage+sensors+by+optimizing+FRET+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing fast fluorescent protein voltage sensors by optimizing FRET interactions.</a> PLoS One. 10, e0141585(2015).</li>
<li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., Maclaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nat Methods. 9, 90-95 (2012).</li>
<li>Flytzanis, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaerhodopsin+variants+with+enhanced+voltage-sensitive+fluorescence+in+mammalian+and+Caenorhabditis+elegans+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons.</a> Nat Commun. 5, 4894(2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nat Methods. 11, 825-833 (2014).</li>
<li>Gong, Y., Wagner, M. J., Zhong Li, J., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+spiking+in+brain+tissue+using+FRET-opsin+protein+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging neural spiking in brain tissue using FRET-opsin protein voltage sensors.</a> Nat Commun. 5, 3674(2014).</li>
<li>Zou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+fast+multicoloured+voltage+reporters+via+electrochromic+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bright and fast multicoloured voltage reporters via electrochromic FRET.</a> Nat Commun. 5, 4625(2014).</li>
<li>Chanda, B., Blunck, R., Faria, L. C., Schweizer, F. E., Mody, I., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+approach+to+measuring+electrical+activity+in+genetically+specified+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A hybrid approach to measuring electrical activity in genetically specified neurons.</a> Nat Neurosci. 8, 1619-1626 (2005).</li>
<li>Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+electrical+activity+from+neurons+in+hippocampal+slices+from+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice.</a> J Neurophysiol. 108, 3147-3160 (2012).</li>
<li>Weigel, S., Flisikowska, T., Schnieke, A., Luksch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+voltage+sensor+imaging+of+eGFP-F+expressing+neurons+in+chicken+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Hybrid voltage sensor imaging of eGFP-F expressing neurons in chicken midbrain slices.</a> J Neurosci Methods. 233, 28-33 (2014).</li>
<li>Waters, J. C. Live-Cell Fluorescence Imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaters%2C+JC+%22Methods+in+Cell+Biology+Volume+81%22">Methods in Cell Biology Volume 81</a>. Sluder, G., Wolf, D. E. , Academic Press. 115-140 (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat Protoc. 7, 1741-1754 (2012).</li>
<li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Ca2%2B-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat Protoc. 1, 695-700 (2006).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+clamping%3A+an+introductory+guide+to+patch+clamp+electrophysiology%22">Patch clamping: an introductory guide to patch clamp electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 101-102 (2003).</li>
<li>Osorio, N., Delmas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+from+enteric+neurons+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording from enteric neurons in situ.</a> Nat Protoc. 6, 15-27 (2010).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annu Rev Biochem. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Wilt, B. A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photon+shot+noise+limits+on+optical+detection+of+neuronal+spikes+and+estimation+of+spike+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Photon shot noise limits on optical detection of neuronal spikes and estimation of spike timing.</a> Biophys J. 104, 51-62 (2013).</li>
<li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3, e2514(2008).</li>
<li>Peterka, D. S., Takahashi, H., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage in neurons.</a> Neuron. 69, 9-21 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il sistema nervoso utilizza tensione in diversi modi, inibizione provoca un leggero iperpolarizzazione, ingresso sinaptica provoca un leggero depolarizzazione e un&#39;azione potenziali risultati in un cambiamento relativamente grande tensione. La possibilità di misurare le variazioni del potenziale di membrana dalla Gevis offre il potenziale promettente di analizzare diversi componenti di circuiti neuronali contemporaneamente. In questo rapporto si dimostra un metodo fondamentale per le modifiche di imaging del potenzi...

Il principale obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare l&#39;imaging ottico delle variazioni di potenziali di membrana in vitro utilizzando proteine ​​fluorescenti geneticamente codificate. cambiamenti di imaging del potenziale di membrana offre l&#39;eccitante possibilità di studiare l&#39;attività dei circuiti neuronali. Quando i cambiamenti nella membrana risultato potenziale in un cambiamento intensità di fluorescenza, ogni pixel della telecamera diventa un elettrodo surrogata per misure non intrusivi di attività neuronale. Da oltre quarant&#39;anni, coloranti organici voltaggio-sensibile sono stati utili per osservare i cambiamenti nel potenziale di membrana 1-4. Tuttavia, questi coloranti mancano di specificità cellulare. Inoltre, alcuni tipi di cellule sono difficili da macchiare. indicatori di tensione geneticamente codificati (GeViS) superare queste limitazioni avendo le cellule da studiare specificamente esprimono la sonda fluorescente tensione-sensibili. Ci sono tre classi di Gevis. La prima classe di GEVI utilizza il vodominio della fosfatasi tensione-sensing ensione-sensing con una singola proteina fluorescente (FP) 5-9 o un paio 10-12 un Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). La seconda classe di sensori utilizza microbica rodopsina come indicatore fluorescente direttamente 13-15 o tramite FRET elettrocromico 16,17. La terza classe utilizza due componenti, il componente genetica essendo un FP membrana ancorata ed un secondo componente essendo una membrana vincolato tempra colorante 18-20. Mentre il secondo e terzo classi sono utili per esperimenti in vitro e fetta 19,20, solo la prima classe di sensori sono attualmente utile per analisi in vivo 6. In questo rapporto ci sarà dimostrare l&#39;imaging del potenziale di membrana utilizzando la prima classe di Gevis (figura 1) in vitro. Questa prima classe di sensori di tensione è il più facile da passare a imaging in vivo. Dal momento che Gevis utilizing un dominio di rilevamento della tensione fuso ad una FP sono circa 50 volte più luminoso classe rodopsina dei sensori, possono essere ripreso con illuminazione lampada ad arco anziché richiedere un laser estremamente potente. Un&#39;altra conseguenza della disparità di luminosità è che la prima classe di GeViS può facilmente superare l&#39;auto-fluorescenza del cervello. Le sonde rodopsina-based non può. La terza classe di sensore è altrettanto chiaro come la prima classe, ma richiede l&#39;aggiunta di un quencher chimico che è difficile da gestire in vivo. Noi, quindi, dimostrare l&#39;acquisizione di una sonda con un singolo FP (Bongwoori) 8 e una sonda costituita da una coppia FRET (Nabi 2) 12. Il FRET costruisce in questo rapporto sono versioni farfalla di VSFP-CR (proteine ​​fluorescenti voltaggio-sensibile - Clover-mRuby2) 11 costituito da un donatore fluorescente verde, trifoglio, e un accettore fluorescente rossa, mRuby2, chiamato Nabi 2.242 e 2.244 Nabi <sup&gt; 12. L&#39;introduzione di questi tipi di registrazioni dovrebbe dare ai ricercatori una migliore comprensione del tipo di Gevis di informazione in grado di fornire. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Figura 1. due tipi di indicatori geneticamente codificati tensione (Gevis) Divisori stampati in questo rapporto (A) Un FP mono basato GEVI avere un dominio di tensione-sensing trans-membrana e una proteina fluorescente. (B) Un GEVI basato FRET composto da un dominio di tensione-sensing trans-membrana, un donatore tasto e accettore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscopio Invertito</td><td>Obiettivo Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X (apertura numerica = 1,35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td><td>Per l'imaging di tensione della pHluorin super eclittica in Bongwoori</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Lampada ad arco allo xeno</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource</td><td>Illuminatore LED e laser sono anche sorgenti luminose efficaci</td></tr><tr><td>Telecamera CCD a bassa velocità</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per fotocamera a doppia porta</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera CCD ad alta velocità</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Splitter di immagini</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>Per l'imaging della tensione di GEVI basato su coppie FRET composto da Clover e mRuby2)</td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di isolamento dalle vibrazioni</td><td>Sistemi cinetici</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Camera di patching</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Micro Coverglass (22 x 40 mm)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0,08 ~ 0,13 mm) - vetrino coprioggetti in vetro diametro 10 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Agente di lipofezione</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Reagente fosfato di calcio</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore patch clamp</td> Amplificatore <td></td><td>USB HEKA</td><td>EPC 10</td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati multicanale</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione e analisi delle immagini</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Software applicativo per fogli di calcolo</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>di analisi datiOriginLab</td><td>OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lente d'ingrandimento</td><td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem Accoppiatore fotocamera standard 0,38x SC38 J clamp</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td><td></td></tr><tr><td>Reagente anti-sbiadimento</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Gli indicatori di tensione geneticamente codificati (GEVI) sono migliorati al punto che stanno iniziando ad essere utili per le registrazioni in vivo. Mentre l'obiettivo finale è quello di visualizzare l'attività neuronale in vivo, si deve essere in grado di visualizzare l'attività di una singola cellula per garantire il successo delle preparazioni in vivo. Questa procedura descriverà come visualizzare il potenziale di membrana in una singola cellula per fornire una base per l'imaging in vivo. Qui descriviamo i metodi per l'imaging di GEVI costituiti da un dominio di rilevamento del voltaggio fuso a una singola proteina fluorescente (FP) o a due proteine fluorescenti in grado di trasferire energia di risonanza di Förster (FRET) in vitro. L'utilizzo di uno splitter di immagini consente la proiezione simultanea di immagini create da due diverse lunghezze d'onda sulla stessa fotocamera CCD (Charge-Coupled Device). Lo splitter di immagini posiziona un secondo cubo filtro nel percorso della luce. Questo secondo cubo filtrante è costituito da un dicroico e due filtri di emissione per separare le lunghezze d'onda fluorescenti del donatore e dell'accettore a seconda degli FP del GEVI. Questa configurazione consente la registrazione simultanea dei partner fluorescenti accettori e donatori mentre il potenziale di membrana viene manipolato tramite la configurazione del patch clamp per l'intera cellula. Quando si utilizza un GEVI costituito da un singolo FP, il secondo cubo filtro può essere rimosso consentendo agli specchi nello splitter di immagini di proiettare una singola immagine sulla camera CCD.

Transitoriamente cellule transfettate possono presentare una significativa variazione di intensità di fluorescenza e il grado di espressione membrana plasmatica. Anche sullo stesso vetrino alcune cellule avranno diversi livelli di fluorescenza interna. Questo è probabilmente dovuto alla quantità di agente trasfezione assorbita dalla cella. Di tanto in tanto, troppo espressione fa sì che la cellula di sperimentare la risposta proteina spiegato con conseguente apoptosi 27 (lumin...

Viene descritto un metodo per l'imaging dei cambiamenti nel potenziale di membrana utilizzando indicatori di tensione geneticamente codificati.

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

L'obiettivo generale di questa procedura è segnalare otticamente le variazioni del potenziale di membrana mediante un indicatore genetico del voltaggio. Questo metodo descriverà i punti di forza e di debolezza dell'imaging con diversi sonde fluorescenti codificate geneticamente per il voltaggio. Ad esempio, le sonde basate su FRET offriranno il vantaggio dell'imaging raziometrico ma forniranno un segnale inferiore.Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo visualizzare l'attività neurale in tempo reale. In generale, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché il rapporto segnale-rumore non è molto elevato e vi sono diverse fonti di rumore e diversi passaggi che possono presentare problemi. Gli utenti alle prime armi spesso si confondono e interpretano le interferenze come segnali reali.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per accertare la validità delle sonde utilizzate e ciò che esse indicano effettivamente. Per l'allestimento, un divisore d'immagine viene installato tra le telecamere CCD lenta e veloce per l'acquisizione di immagini di GEVI basati sul FRET. Prima dell'esperimento, inserire un cubetto filtro con uno specchio dicotroico e due filtri di emissione nel divisore d'immagine.Rimuovere questo secondo cubo del filtro quando si esegue l'imaging di un GEVI con una singola proteina fluorescente. Per iniziare l'esperimento, individuare una cellula HEK293 sana che mostri una fluorescenza membranosa intensa e localizzata rispetto alla fluorescenza interna ed evitare di sigillare cellule circolari poiché sono in fase di divisione o morenti. Applicare quindi un impulso di prova per verificare la risposta in corrente.Successivamente, abbassare la pipetta per il patch clamp appena sopra la superficie della cellula. Quindi, abbassare lentamente la pipetta fino a quando tocca delicatamente la membrana cellulare. La resistenza della membrana dovrebbe aumentare da uno a due megaohm.Successivamente, stabilire un sigillo gigaohm applicando delicatamente una pressione negativa attraverso la pipetta. Una volta ottenuto un sigillo gigaohm, impostare il potenziale della pipetta a un potenziale di mantenimento desiderato. In seguito, mettere a fuoco la telecamera CCD ad alta velocità sul corpo cellulare.Per la registrazione del GEVI basata su FRET, regolare le dimensioni delle immagini divise in modo da ottenere una visualizzazione uniformemente spaziata per ciascuna lunghezza d'onda di emissione, utilizzando le manopole dello splitter di immagine. Quindi, rompere la membrana cellulare applicando una pressione negativa per formare la configurazione in intera cellula. A questo punto, aprire il software di acquisizione immagini.Quindi fare clic su acquisisci menu della telecamera SciMeasure per aprire la pagina di acquisizione CCD. Successivamente, creare un nuovo file di dati per salvare la registrazione. Fare clic su uscita analogica e quindi leggere un ASCII per aprire un file di protocollo di impulsi al fine di eseguire l'acquisizione di immagini.Successivamente, fare clic su "average" per mediare le ripetizioni interne e il numero di prove. Chiudere quindi la pagina di uscita analogica. Impostare i parametri specifici di acquisizione nella pagina di acquisizione CCD.Dopo aver inserito i valori specifici per il numero di fotogrammi per l'acquisizione e il numero di prove, fare clic sul pulsante take data optics plus BNC per iniziare la registrazione. Durante l'acquisizione dell'immagine di tensione, monitorare l'oscilloscopio per garantire una configurazione whole-cell stabile per tutta la durata della registrazione.Per calcolare la variazione frazionaria della fluorescenza, fare clic su file e quindi su leggi file dati per aprire un file di dati registrato nel passaggio precedente. L'immagine della cellula con la sua intensità luminosa a riposo dovrebbe essere visibile sul lato destro. Successivamente, fare clic su mostra BNC per visualizzare i valori attuali di tensione finale.Modificare la modalità di pagina da frame RLI a sottrazione tra frame per utilizzare la funzione di sottrazione tra frame e identificare i pixel con segnali ottici rispondenti. Successivamente, selezionare due punti temporali per la sottrazione e identificare l'area cellulare che mostra segnali in risposta al cambiamento del potenziale di membrana. Quindi, delimitare i pixel da analizzare trascinando il cursore o facendo clic su ciascun pixel.La rappresentazione grafica dell'intensità media della fluorescenza proveniente dai pixel selezionati dovrebbe apparire sul lato sinistro della finestra del software. Dividere i pixel sottratti per l'intensità luminosa a riposo facendo clic sul pulsante dividi per RLI per ottenere i valori della variazione frazionaria della fluorescenza. Per esportare i dati, rimuovere i grafici della tensione finale corrente deselezionando il menu mostra BNC.Vai all'output e salva le tracce come ASCII visualizzate per esportare la traccia di fluorescenza in un formato di file ASCII da utilizzare nell'analisi di adattamento della curva. In questa procedura, traccia il grafico della variazione di fluorescenza in funzione del voltaggio riportando le variazioni frazionarie di fluorescenza in risposta al voltaggio in un programma di analisi dati. Successivamente, adatta la curva a una funzione di Boltzmann per determinare l'intervallo di voltaggio del segnale ottico cliccando su analisi, adattamento, adattamento sigmoideo, quindi apri la finestra di dialogo.Ripotare le variazioni normalizzate della fluorescenza frazionaria in risposta alla tensione utilizzando il programma di analisi dati. Per calcolare la velocità della risposta ottica, aprire il file ASCII e riportare in grafico la traccia della variazione di fluorescenza frazionaria rispetto al tempo. Quindi fare clic sul selettore dati nel software di analisi dati e selezionare un punto temporale corrispondente all'inizio di un impulso di tensione a gradino e un secondo punto temporale in cui il segnale ottico ha raggiunto lo stato stazionario.Adattare questo intervallo sia a una funzione di decadimento esponenziale singola che doppia facendo clic su analisi, adattamento, adattamento esponenziale, quindi aprire la finestra di dialogo e riportare l'adattamento migliore. Questa figura mostra la variazione della fluorescenza di una cellula HEK che esprime un GEVI basato su un singolo FP, Bongwoori. Questa è una variazione tipica della fluorescenza in risposta a impulsi di tensione a gradino.Qui una cellula HEK293 è stata acquisita con una telecamera CCD ad alta velocità. Questa immagine mostra l'intensità luminosa di riposo di una cellula che esprime Bongwoori. E questa è un'immagine ottenuta per sottrazione di fotogrammi che indica i pixel in cui è stato osservato un cambiamento di fluorescenza.Qui viene mostrata la registrazione ottica dei potenziali d'azione indotti nei neuroni primari dell'ippocampo di topo esprimenti Bongwoori. I potenziali d'azione sono stati evocati in modalità di blocco della corrente in configurazione whole-cell. La traccia della variazione frazionaria della fluorescenza è stata selezionata dai pixel correlati al soma.In questa figura, la variazione della fluorescenza di una cellula HEK che esprime un GEVI basato sul FRET mostra le risposte a impulsi di tensione a gradino in due lunghezze d'onda. Registrato a un chilohertz con una telecamera CCD ad alta velocità. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di verificare i livelli variabili di fluorescenza, poiché la sovraespressione della fluorescenza può influenzare la salute della cellula.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come le codifiche con slicer per rispondere a ulteriori domande relative all'attività neuronale di vari circuiti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come immaginare il potenziale di membrana utilizzando diversi tipi di sonde.

imaging-membrane-potential-with-two-types-genetically-encoded

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Campo elettrico esterno induce una tensione sulla membrana di una cellula, chiamata potenziale di membrana indotta (ΔΦ). Usando il potenziometrica tintura di-8-ANEPPS, è possibile misurare la ΔΦ modo non invasivo. Questo video mostra il protocollo per la misurazione ΔΦ utilizzo di-8-ANEPPS.

Misurare la tensione indotta a membrana con Di-8-ANEPPS

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

Qui presentiamo un metodo per immagine otticamente i potenziali di azione, in particolare in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ventricolare-come. Il metodo si basa sull'espressione di una proteina fluorescente tensione sensibile promotore-driven.

Registrazioni di potenziale di azione ottica sottotipo-specifici in essere umano indotto Cardiomyocytes ventricolari derivati da cellule staminali di Pluripotent

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Presentiamo la metodologia per l'isolamento dei miociti murini e come ottenere tracce di tensione o calcio contemporaneamente con tracce di accorciamento sarcomero utilizzando la fotometria a fluorescenza con misurazioni simultanee della geometria cellulare digitale.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Questo protocollo descrive un metodo per lo studio delle proteine di membrana elettrogeniche misurando le variazioni del potenziale di membrana. Questo test fornisce una piattaforma per la lettura funzionale di più canali ionici espressi endogenamente in linee cellulari epiteliali.

Un saggio basato sulla fluorescenza del potenziale di membrana per lo studio funzionale ad alta produttività di due canali ionici endogeni in due linee cellulari epiteliali

Per lo studio delle risposte delle cellule eccitabili in vitro, il protocollo descrive il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate, nonché i cambiamenti nella tensione transmembrana con estrazione automatizzata dei parametri rilevanti.

Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate

Impara a rilevare i cambiamenti del potenziale di membrana con indicatori di tensione geneticamente codificati. Questo metodo consente la visualizzazione in tempo reale dell'attività neuronale, sebbene presenti sfide interpretative.

Imaging potenziale di membrana con due tipi di geneticamente codificati fluorescenti di sensori di tensione

Esplora altri video