Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

L'obiettivo generale della tecnologia di conversione fotografica PSmOrange è quello di tracciare le cellule dell'animale vivente durante lo sviluppo embrionale e la malattia. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come scoprire l'origine delle cellule che si sviluppano in tessuti e organi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata in sfondi transgenici GFP.

Questo metodo può essere applicato anche in diversi campi di indagine come la rigenerazione, la progressione tumorale e l'invasione. Dopo aver generato e incorporato gli embrioni che esprimono PSmOrange e GFP secondo il protocollo di testo, posizionare l'embrione sotto il microscopio confocale e utilizzare l'obiettivo ad aria 20x e i laser a 488 e 561 nanometri per scansionare il campione per identificare un'area da fotoconvertire. Per rilevare la proteina PSmOrange prima della fotoconversione, utilizzare il laser a 561 nanometri a 0,74 milliwatt di potenza misurata sul piano di messa a fuoco sopra l'obiettivo e regolare la potenza del laser secondo necessità.

Regola i fattori di zoom per evidenziare l'area di interesse e ridurre il tempo di acquisizione delle immagini e la tossicità delle foto. Utilizzando i laser a 488 e 561 nanometri in modalità sequenziale e un passo Z compreso tra 1,0 e 2,0 micrometri, acquisire una pila Z che copre le strutture di interesse. Regola la media delle linee e la frequenza di scansione per ottimizzare la qualità dell'immagine.

Quindi scansiona il campione e seleziona la regione di interesse, o lo strumento ROI, per evidenziare l'area da fotoconvertire prima di fissare il ROI come area di stimolazione. Selezionare il modulo di sbiancamento per fotoattivazione, selezionare la casella per attivare il laser a 488 nanometri, quindi impostare il laser a 488 nanometri all'80% e la velocità di scansione a 0,5 secondi per fotogramma. Successivamente, apri l'utilità di fotoconversione e fai clic su Aggiungi'per specificare il protocollo di fotoconversione.

Nel menu di stimolazione dell'acquisizione, impostare la Fase Uno su acquisizione e nel menu dei loop, indicare il numero di immagini da acquisire prima della fotoconversione. Impostare Fase due su stimolazione e inserire il numero di eventi di stimolazione da eseguire. Regolare la Fase Tre come descritto per la Fase Uno.

Opzionalmente, inserire una Fase di Attesa dopo la Fase Due inserendo il tempo di attesa prima dell'ultimo ciclo di acquisizione dell'immagine. Una volta impostati i parametri, applicare l'impostazione di stimolazione ed eseguire la fotoconversione. Le impostazioni errate sono fondamentali per la fotoconversione PSmOrange.

Per garantire una fotoconversione di successo, l'embrione viene sottoposto a un'immagine subito dopo l'esperimento per rilevare la proteina PSmOrange fotoconvertita. Se la conversione non è andata a buon fine, la procedura viene ripetuta. Utilizzando i laser a 488, 561 e 640 nanometri e impostando il laser a 640 nanometri ad alta potenza, fino a 4,5 milliwatt, si acquisisce uno stack z finale con le impostazioni appena descritte.

Per smontare l'embrione, rimuovere la camera dal microscopio e utilizzare una pinza per rimuovere l'embrione dall'agarosio. Trasferire l'embrione in una nuova capsula di Petri di plastica sterilizzata o in una piastra sterilizzata a 6 pozzetti, contenente 0,2 millimolari di PTU in E3. Incubare l'embrione a 28 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato. Per analizzare il destino delle cellule che esprimono la proteina PSmOrange fotoconvertita, reinserire l'embrione secondo il protocollo di testo.

Sotto il miscroscopio confocale, scansionare il campione per identificare le cellule fotoconvertite nella struttura transgenica GFP di interesse. Usa i laser a 488, 561 e 640 nanometri per acquisire una pila z con una pila fissa da 1 a 2 micrometri in modalità sequenziale che copre le strutture. Utilizzando il software Image J Fiji, è possibile identificare le cellule che co-esprimono la GFP e la proteina fotoconvertita.

Duplica la pila originale, usa il plug-in Gaussian Blur e il calcolatore di immagini per sottrarre le pile morbide dall'originale. Applicare soglie specifiche ai canali verde e rosso lontano per evidenziare le celle fotoconvertite. Quindi utilizzare lo strumento Analizza particelle per rilevare le aree di soglia nel canale verde con un'impostazione appropriata.

Ripetere questo passaggio per il canale rosso lontano. Apri il plug-in del calcolatore di immagini per rilevare le celle in co-localizzazione. Visualizzate in giallo le ROI sovrapposte nel canale verde o rosso lontano utilizzando lo strumento Analizza particelle.

Utilizzando il software NIS-Elements, eseguire la valutazione della data 3D e visualizzare la pila in 3D utilizzando l'opzione Mostra vista volume. Quindi utilizzare l'interfaccia grafica per selezionare i canali verde, rosso e rosso lontano, regolare la luminosità e il contrasto e ritagliare lo stack 3D per evidenziare l'area fotoconvertita. Qui è mostrato un esempio del sistema di fotocoversione PSmOrange in embrioni GFP con testa galleggiante FOXD3 transgenica di pesce zebra

A 26 ore dalla fecondazione, due gruppi di cellule nella parte anteriore della pineale sono stati fotoconvertiti e immediatamente riprodotti. La proteina è stata rilevata con un laser rosso lontano a 640 nanometri, ma non con un laser a 561 nanometri. In queste cellule, l'espressione della GFP è stata inizialmente ridotta a causa del fotosbiancamento.

A 52 HPF, GFP e H2B PSmOrange sono stati rilevati nelle cellule che esprimono la proteina H2B PSmOrange fotoconvertita. Alcune di queste cellule formavano il parapineale sul lato sinistro del cervello. Questo risultato è coerente con i precedenti rapporti sull'origine delle cellule parapineali nella pineale anteriore e mostra l'applicabilità della tecnica PSmOrange nell'embrione vivente di vertebrato transgenico GFP.

Seguendo questa procedura, l'analisi di tracciamento cellulare può essere eseguita in embrioni geneticamente manipolati al fine di rispondere a ulteriori domande riguardanti le gerarchie molecolari alla base dello sviluppo della cellula.