Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange
5 febbraio 2016
Abbiamo stabilito il sistema fotoconvertibile PSmOrange come uno strumento potente, diretto e poco costoso per il tracciamento cellulare in vivo in sfondi transgenici GFP. Questo protocollo descrive la sua applicazione nel sistema modello di zebrafish.
L'obiettivo generale della tecnologia di conversione fotografica PSmOrange è quello di tracciare le cellule dell'animale vivente durante lo sviluppo embrionale e la malattia. Questo metodo può rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come scoprire l'origine delle cellule che si sviluppano in tessuti e organi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere applicata in sfondi transgenici GFP.
Questo metodo può essere applicato anche in diversi campi di indagine come la rigenerazione, la progressione tumorale e l'invasione. Dopo aver generato e incorporato gli embrioni che esprimono PSmOrange e GFP secondo il protocollo di testo, posizionare l'embrione sotto il microscopio confocale e utilizzare l'obiettivo ad aria 20x e i laser a 488 e 561 nanometri per scansionare il campione per identificare un'area da fotoconvertire. Per rilevare la proteina PSmOrange prima della fotoconversione, utilizzare il laser a 561 nanometri a 0,74 milliwatt di potenza misurata sul piano di messa a fuoco sopra l'obiettivo e regolare la potenza del laser secondo necessità.
Regola i fattori di zoom per evidenziare l'area di interesse e ridurre il tempo di acquisizione delle immagini e la tossicità delle foto. Utilizzando i laser a 488 e 561 nanometri in modalità sequenziale e un passo Z compreso tra 1,0 e 2,0 micrometri, acquisire una pila Z che copre le strutture di interesse. Regola la media delle linee e la frequenza di scansione per ottimizzare la qualità dell'immagine.
Quindi scansiona il campione e seleziona la regione di interesse, o lo strumento ROI, per evidenziare l'area da fotoconvertire prima di fissare il ROI come area di stimolazione. Selezionare il modulo di sbiancamento per fotoattivazione, selezionare la casella per attivare il laser a 488 nanometri, quindi impostare il laser a 488 nanometri all'80% e la velocità di scansione a 0,5 secondi per fotogramma. Successivamente, apri l'utilità di fotoconversione e fai clic su Aggiungi'per specificare il protocollo di fotoconversione.
Nel menu di stimolazione dell'acquisizione, impostare la Fase Uno su acquisizione e nel menu dei loop, indicare il numero di immagini da acquisire prima della fotoconversione. Impostare Fase due su stimolazione e inserire il numero di eventi di stimolazione da eseguire. Regolare la Fase Tre come descritto per la Fase Uno.
Opzionalmente, inserire una Fase di Attesa dopo la Fase Due inserendo il tempo di attesa prima dell'ultimo ciclo di acquisizione dell'immagine. Una volta impostati i parametri, applicare l'impostazione di stimolazione ed eseguire la fotoconversione. Le impostazioni errate sono fondamentali per la fotoconversione PSmOrange.
Per garantire una fotoconversione di successo, l'embrione viene sottoposto a un'immagine subito dopo l'esperimento per rilevare la proteina PSmOrange fotoconvertita. Se la conversione non è andata a buon fine, la procedura viene ripetuta. Utilizzando i laser a 488, 561 e 640 nanometri e impostando il laser a 640 nanometri ad alta potenza, fino a 4,5 milliwatt, si acquisisce uno stack z finale con le impostazioni appena descritte.
Per smontare l'embrione, rimuovere la camera dal microscopio e utilizzare una pinza per rimuovere l'embrione dall'agarosio. Trasferire l'embrione in una nuova capsula di Petri di plastica sterilizzata o in una piastra sterilizzata a 6 pozzetti, contenente 0,2 millimolari di PTU in E3. Incubare l'embrione a 28 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato. Per analizzare il destino delle cellule che esprimono la proteina PSmOrange fotoconvertita, reinserire l'embrione secondo il protocollo di testo.
Sotto il miscroscopio confocale, scansionare il campione per identificare le cellule fotoconvertite nella struttura transgenica GFP di interesse. Usa i laser a 488, 561 e 640 nanometri per acquisire una pila z con una pila fissa da 1 a 2 micrometri in modalità sequenziale che copre le strutture. Utilizzando il software Image J Fiji, è possibile identificare le cellule che co-esprimono la GFP e la proteina fotoconvertita.
Duplica la pila originale, usa il plug-in Gaussian Blur e il calcolatore di immagini per sottrarre le pile morbide dall'originale. Applicare soglie specifiche ai canali verde e rosso lontano per evidenziare le celle fotoconvertite. Quindi utilizzare lo strumento Analizza particelle per rilevare le aree di soglia nel canale verde con un'impostazione appropriata.
Ripetere questo passaggio per il canale rosso lontano. Apri il plug-in del calcolatore di immagini per rilevare le celle in co-localizzazione. Visualizzate in giallo le ROI sovrapposte nel canale verde o rosso lontano utilizzando lo strumento Analizza particelle.
Utilizzando il software NIS-Elements, eseguire la valutazione della data 3D e visualizzare la pila in 3D utilizzando l'opzione Mostra vista volume. Quindi utilizzare l'interfaccia grafica per selezionare i canali verde, rosso e rosso lontano, regolare la luminosità e il contrasto e ritagliare lo stack 3D per evidenziare l'area fotoconvertita. Qui è mostrato un esempio del sistema di fotocoversione PSmOrange in embrioni GFP con testa galleggiante FOXD3 transgenica di pesce zebra
.A 26 ore dalla fecondazione, due gruppi di cellule nella parte anteriore della pineale sono stati fotoconvertiti e immediatamente riprodotti. La proteina è stata rilevata con un laser rosso lontano a 640 nanometri, ma non con un laser a 561 nanometri. In queste cellule, l'espressione della GFP è stata inizialmente ridotta a causa del fotosbiancamento.
A 52 HPF, GFP e H2B PSmOrange sono stati rilevati nelle cellule che esprimono la proteina H2B PSmOrange fotoconvertita. Alcune di queste cellule formavano il parapineale sul lato sinistro del cervello. Questo risultato è coerente con i precedenti rapporti sull'origine delle cellule parapineali nella pineale anteriore e mostra l'applicabilità della tecnica PSmOrange nell'embrione vivente di vertebrato transgenico GFP.
Seguendo questa procedura, l'analisi di tracciamento cellulare può essere eseguita in embrioni geneticamente manipolati al fine di rispondere a ulteriori domande riguardanti le gerarchie molecolari alla base dello sviluppo della cellula.
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Panoramica
Il sistema PSmOrange è uno strumento economico per il tracciamento cellulare in vivo in contesti transgenici GFP, in particolare nei modelli di pesce zebra. Questo protocollo facilita lo studio delle origini cellulari durante lo sviluppo embrionale e nelle malattie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dello sviluppo
- Tracciamento cellulare
- Sviluppo embrionale
Sfondo
- La tecnologia di fotoconversione PSmOrange consente il tracciamento delle cellule in organismi viventi.
- Questo metodo è applicabile in diversi campi di ricerca, inclusi la rigenerazione e la progressione tumorale.
- Può essere utilizzato in contesti transgenici GFP, aumentandone la versatilità.
- La microscopia confocale viene impiegata per la visualizzazione e la fotoconversione delle cellule.
Scopo dello studio
- Per tracciare le cellule durante lo sviluppo embrionale e i processi patologici.
- Per identificare l'origine delle cellule che danno origine a tessuti e organi.
- Per fornire informazioni sui comportamenti cellulari in diversi contesti biologici.
Metodi Utilizzati
- Generazione di embrioni esprimenti PSmOrange e GFP.
- Inclusione degli embrioni per l'analisi mediante microscopia confocale.
- Utilizzo dei laser a 488 e 561 nm per l'acquisizione delle immagini.
- Fotoconversione della proteina PSmOrange ai fini del tracciamento.
Risultati principali
- Tracciamento con successo delle cellule in modelli di zebrafish mediante il sistema PSmOrange.
- Dimostrata capacità di visualizzare l'origine e il comportamento cellulare.
- Evidenziata l'applicabilità del metodo in diverse aree di ricerca biologica.
- Fornito un protocollo semplice da seguire per i ricercatori.
Conclusioni
- Il sistema PSmOrange è uno strumento efficace per il tracciamento cellulare in vivo.
- Offre vantaggi significativi nello studio della biologia dello sviluppo.
- Questo metodo può migliorare la comprensione dei processi biologici complessi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Il sistema proteico fotoconvertibile PSmOrange consente un tracciamento cellulare preciso in vivo in embrioni di pesce zebra transgenici per GFP, risolvendo una limitazione fondamentale nella ricerca in biologia dello sviluppo, dove le linee transgeniche esistenti non dispongono di reporter compatibili per il tracciamento della linea cellulare. Questa capacità supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi, permettendo la visualizzazione diretta delle origini cellulari e delle decisioni riguardo al destino cellulare in sistemi rilevanti per le malattie, in particolare per applicazioni in oncologia e medicina rigenerativa che coinvolgono progressione tumorale, invasione e rigenerazione dei tessuti. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici fornendo dati quantitativi, risolti spazialmente, sulla migrazione e differenziazione cellulare all'interno di organismi intatti e viventi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche monitorando popolazioni cellulari definite in contesti transgenici, per chiarire le origini cellulari di tessuti e organi.
- Valore operativo: Compatibile con linee transgeniche GFP esistenti, elimina la necessità di generare nuovi promotori e riduce i tempi di sviluppo del modello.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione dei rischi biologici attraverso l'osservazione diretta delle decisioni riguardo il destino cellulare, migliorando la fiducia nelle associazioni tra bersaglio e meccanismo della malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera dati spaziali e temporali quantificabili sulla migrazione delle cellule fotoconvertite, consentendo un confronto oggettivo di perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Valore operativo: Utilizza una microscopia confocale standard con eccitazione laser sequenziale (488, 561, 640 nm), senza richiedere attrezzature specializzate oltre a quelle tipicamente presenti nei centri di imaging.
- Scalabilità: Compatibile con l’imaging 3D ad alta risoluzione e con strumenti di post-elaborazione (ImageJ Fiji, NIS-Elements) per analisi di co-localizzazione riproducibili con GFP.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Applicabile direttamente allo studio dei modelli di invasione e metastatizzazione delle cellule tumorali in modelli di xenotrapianto o modelli transgenici di cancro nel zebrafish.
- Continuità traslazionale: Permette una transizione fluida dalla scoperta (tracciamento dell'origine cellulare) alla validazione preclinica, monitorando l'attecchimento, la migrazione e l'integrazione delle cellule fotoconvertite in vivo.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce endpoint visivi e quantitativi per decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo preclinico precoce, basate sul comportamento cellulare in contesti rilevanti per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema PSmOrange si inserisce nel continuum tra la fase iniziale di scoperta e quella preclinica, fungendo da strumento per lo screening fenotipico e la validazione meccanicistica che collega la manipolazione genetica con letture funzionali a livello cellulare in modelli vertebrati vivi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi consentendo il fate mapping di specifiche popolazioni cellulari in risposta a perturbazioni genetiche o ambientali in embrioni transgenici GFP.
- Screening: Genera output quantitativi standardizzati e riproducibili (percentuali di co-localizzazione, distanze di migrazione) adatti per screening di composti o di geni soppressori/potenziatori.
- Analisi: Produce dati di fluorescenza multicanale (GFP, PSmOrange arancione/rosso, PSmOrange fotoconvertito nel vicino infrarosso) che permettono analisi rigorose di co-localizzazione e di particelle per una fenotipizzazione oggettiva.
- Ricerca traslazionale: Si collega a studi preclinici monitorando il comportamento cellulare in modelli di rigenerazione e di progressione tumorale, contribuendo a valutare la validità meccanicistica dei bersagli.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità di piattaforma riutilizzabile; l'iniezione di mRNA consente un rapido impiego su diverse linee transgeniche senza dover generare nuove linee stabili.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio fornendo evidenze visive dirette della dinamica cellulare in organismi integri.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione tra laboratori mediante protocolli definiti di fotoconversione e impostazioni laser (488 nm all'80% di potenza, 0,5 sec/immagine; 640 nm fino a 4,5 mW per il rilevamento).
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale sfruttando le risorse transgeniche esistenti per GFP, evitando costose identificazioni ex novo di promotori e la generazione di nuove linee.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio fornendo precocemente dati funzionali in vivo sul comportamento cellulare, riducendo i fallimenti tardivi dovuti a complessità biologiche inattese.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale, tecniche di fotoconversione e separazione spettrale della fluorescenza.
- È subordinato all'accesso a sistemi confocali a scansione laser dotati di laser a 488, 561 e 640 nm e di set di filtri appropriati.
- Necessita della standardizzazione della selezione delle regioni di interesse (ROI), della potenza del laser, della velocità di scansione e dei parametri dello stack z tra diversi utenti per ottenere risultati riproducibili.
- L'adattamento a specie teleoste non appartenenti al pesce zebra potrebbe richiedere un'ottimizzazione della dose di mRNA e dell'efficienza di fotoconversione.
- Limite pratico: l'efficienza di fotoconversione dipende dai livelli di espressione proteica e dalla accessibilità delle cellule bersaglio alla penetrazione del laser in tessuti più spessi.
