Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

O objetivo geral deste experimento é quantificar a dinâmica da actina cortical por espectroscopia de correlação de imagem após a aquisição por reflexão interna total, microscopia de iluminação estruturada ou turf sim. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo biofísico, como qual o papel do fluxo de actina cortical na regulação das interações na sinapse imunológica. A principal vantagem da técnica é que ela combina resolução em escala nanométrica com compatibilidade com condições de vida, permitindo observar e analisar processos em escalas menores em comparação com técnicas convencionais de microscopia de campo claro.

Demonstrará esta técnica George Ashdown, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para uma amostra de teste, adicione cinco microlitros de uma solução estoque de microesferas fluorescentes subdifrativas com diâmetro de 100 nanômetros à superfície de um lamínula novo e não revestido. Em seguida, espalhe a solução de microesferas sobre o lamínula com a ponta de uma pipeta e deixe secar.

Adicione 200 microlitros de meio de montagem à lamínula de teste para preparar a aquisição de imagens; ligue o incubador para o aquecedor da platina do sistema turf SIM e encha o reservatório com água destilada para cobrir completamente a base do elemento aquecedor. Deixe a água atingir equilíbrio térmico a 37 graus Celsius. Conecte o colar aquecedor à lente objetiva e ajuste-o a 37 graus Celsius.

Em seguida, fixe o bloco gradiente compatível com o turf 4 88 no trajeto da luz do microscópio para garantir que o trajeto óptico correto seja acionado. Altere o modo de canal na base do laser para a posição única. Repita esta ação para o cabo de fibra na platina do microscópio.

Espera-se que apareça um erro na janela do software se essas etapas não forem realizadas. Após definir o modo, abaixe a objetiva até o plano Z mais baixo e coloque uma gota de óleo sobre ela. Coloque a lamínula com a amostra de teste contendo microesferas fluorescentes sobre a platina do microscópio.

Em seguida, selecione o sistema de foco perfeito ou a função PFS no corpo do microscópio. Mova o objetivo gradualmente para cima através do plano Z e pare quando o botão PFS deixar de piscar, o que indica que o plano de foco foi alcançado no software de controle. Alterne para a visualização em tempo real para imagens das microesferas na tela.

Realize ajustes finos no foco utilizando a roda do micromanipulador PFS. Observe uma iluminação uniforme, sem emissão fluorescente desfocada acima da onda de cheiro de 75 nanômetros. Por fim, confirme que a iluminação estruturada foi alcançada observando um padrão de iluminação flutuante na amostra de microesferas fluorescentes para estimulação de linfócitos T, abrangendo as câmaras de um oito.

Cubra bem a lamínula com 200 microlitros da mistura de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 e incube a lamínula por duas horas a 37 graus Celsius. Após lavar a lamínula conforme descrito no protocolo do texto, coloque-a sobre a platina do microscópio e localize então o plano focal da turfa. Em seguida, pipete gentilmente 200 microlitros de células T transfectadas em uma das cavidades da lamínula.

Utilize fluorescência epi para acompanhar as células transfectadas com actina GFP enquanto elas aderem à lamínula. Uma vez que as células tenham se acomodado, mude para o modo ao vivo usando o N SimPad e verifique se as células no monitor estão em foco. Para registrar um curso temporal, abra a janela de aquisição ND e selecione a aba de tempo.

Em seguida, clique em adicionar e defina o intervalo sem atraso. Defina a duração para 10 minutos. Por fim, inicie a gravação dos dados selecionando Executar agora na janela de aquisição ND.

Para reconstruir as imagens, abra primeiro o software de análise que contém o módulo de análise correto. Clique em aplicações e depois selecione a janela mostrar sim final. Defina o contraste de modulação de iluminação e a supressão de ruído de alta resolução como um e reconstrua o conjunto de dados turf SIM para produzir uma imagem SIM completa a partir da barra de status da imagem.

Confirme que o tamanho do pixel é de 30 nanômetros e, em seguida, exporte os dados como arquivos TIF para análise de bastonetes. Após baixar e extrair o pacote de software sticks do MATLAB, abra o script. Em seguida, defina os parâmetros de entrada conforme descrito no protocolo textual para o filtro de remoção de imóveis.

Na linha 23, defina o parâmetro de filtragem como média móvel e, na linha 24, utilize 21 como parâmetro da média móvel para gerar um mapa vetorial. Defina a sub-região temporal na linha 31 como o número máximo de quadros, neste caso 63. Em seguida, na linha 32, defina o deslocamento temporal como um nas linhas 33 a 35.

Digite os nomes dos arquivos de saída, os títulos dos mapas vetoriais de saída e o caminho do diretório de saída. Em seguida, defina o formato no qual as imagens dos mapas vetoriais devem ser salvas. Neste caso, png.

No ambiente de edição do MATLAB, abra o script. Execute o programa de um canal e carregue a série de imagens executando as linhas de um a 23 do script. Em seguida, execute as linhas de 29 a 35 do programa de um canal.

Para iniciar a análise dos sticks, siga a solicitação e selecione um polígono para definir uma região de interesse ou ROI, se desejado. Para exibir os mapas vetoriais, execute as linhas 38 a 52. Em seguida, execute as linhas 53 a 72 para plotar o histograma da magnitude da velocidade mostrado aqui, de uma célula T OT expressando GFP marcado para F-actina, que foi imagiada com o protocolo turf sim.

Discutido no texto cinco minutos após esta célula ter sido introduzida em uma lamínula revestida com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 destinados a estimular a formação de sinapses imunológicas. Foi realizado um curso temporal para que o fluxo molecular de F-actina pudesse ser visualizado. A análise subsequente desses dados utilizando o programa Sticks permitiu a quantificação do fluxo molecular de F-actina, conforme representado por este mapa de vetores correspondente à região delimitada da célula à esquerda, que representa uma porção da periferia da sinapse.

Um aumento adicional do mapa e da sub-região de células T esclarece a direcionalidade e a velocidade do fluxo de actina, que podem ser determinadas pelo comprimento do vetor, bem como pelo código de cores. Os dados de velocidade também podem ser plotados em um histograma, permitindo a análise estatística. Em conjunto, esses resultados mostram que na sinapse imunológica a actina F flui de maneira simétrica a partir da periferia em direção ao centro da célula. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como adquirir dados de ts e analisar a dinâmica da actina cortical utilizando espectroscopia de correlação de imagem.

Embora este método possa ser usado para obter informações sobre o fluxo de actina durante a migração de linfócitos T, ele também pode ser empregado em outros sistemas nos quais se presume que o fluxo molecular seja importante, como na migração celular.