Name: Un metodo del rendimento efficiente e di alta per lisolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Scopri un metodo ad alta efficienza per isolare sottopopolazioni di cellule dendritiche dalla milza murina usando il ligando Flt-3. Questa tecnica consente di ottenere elevate purezze per studi immunologici avanzati.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIAID concessione AI45889 a SAP di citometria a flusso studi sono stati effettuati utilizzando FACS strutture di base supportati dal Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) e Centro per l&#39;AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).

Gli esperimenti sugli animali sono fatte secondo le linee guida approvate dal comitato istituzionale cura e l&#39;uso di animali (IACUC). Tutte le procedure che richiedono la sterilità sono eseguite in un armadio biosicurezza. 1. Impianto di B16.Flt3L melanoma nei topi <ol><li> Culture l&#39;espressione B16 linea cellulare di melanoma Flt-3 in T25 fiasche di coltura tissutale con una densità di 0,5 x 10 6 cellule / ml in terreno DMEM completo con il 10% di CO 2 a 37 ° C. Crescere fino a quando le cellule raggiungono ~ 90% di confluenza (~ 20 ore). </li><li> Raccogliere le cellule dalla tripsina digestione. terreni di coltura delle cellule Aspirare e lavare le cellule aderenti con PBS. Aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina e incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere freddo 20 ml completo DMEM (4 ° C) contenente siero fetale di vitello (FCS) per spegnere la digestione proteasi. Sollevare le cellule off battendo leggermente seguita pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300xg per 10 min a 4 ° C. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore vitalità cellulare automatizzata. Risospendere ad una densità di 10 8 cellule / ml in PBS. </li><li> Topi Implant (C57BL / 6 o altro ceppo istocompatibili) con cellule tumorali per via sottocutanea come descritto da Machholz et al. 19 alla base del collo con 100 ml di sospensione cellulare (10 7 cellule). </li><li> Lasciare che il tumore di crescere fino palpabili o visibili (2 - 10 mm di diametro, solitamente 7 - 12 giorni) prima di sacrificare animali per l&#39;espianto di organi. </li></ol> 2. Preparazione di splenica cellulare Sospensione Singola da tumore Bearing Mice <ol><li> Anestetizzare i topi con una dose eccessiva di isoflurano (regolare flusso di isoflurano a&gt; 5% e continuare l&#39;esposizione di almeno 2 minuti dopo smette di respirare). Sacrificare il melanoma tumore del mouse Flt-3 cuscinetti da dislocazione cervicale secondo le linee guida istituzionali per l&#39;eutanasia. </li><li> disinfect la pelle con il 70% di etanolo e la raccolta della milza con tecnica asettica con l&#39;ausilio di forbici sterili 20. </li><li> Posizionare la milza in una piastra di Petri sterile per il trasporto al cabinet biosicurezza. Eseguire tutti i passi da qui in condizioni sterili. </li><li> Trasferimento milza per un piatto fresco di Petri e lavare con RPMI. Tagliare la milza in piccoli pezzi (~ 0,2 centimetri 2) utilizzando un bisturi. Incubare per 30 minuti a 37 ° C con 10 ml di soluzione di collagenasi / DNasi. </li><li> Versare la sospensione parzialmente digerito del tessuto della milza su un colino cella di 70 micron. Comprimere i frammenti di tessuto rimanenti attraverso le maglie del filtro utilizzando una siringa da 5 ml stantuffo. </li><li> Lavare il filtro a rete con 10 ml di mezzo fresco e gettare il filtro. Centrifugare la sospensione a 300 xg per 10 min a 4 ° C per sedimentare le cellule. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di lisi RBC. Incubare a RT Fo 10 min. Placare il tampone di lisi RBC con l&#39;aggiunta di 10 ml di terreno completo RPMI. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere in volume adeguato per raggiungere densità cellulare di 10 8 cellule / ml nella cella di smistamento tampone (ad esempio, MACS) contenente 20 mg / ml di anticorpi Fc-blocco (2.4G2). </li></ol> 3. Purificazione di plasmacitoidi DC, CD8α Pos DC e CD8α Neg DC da milza cellulare Sospensione Singola Nota: Isolamento dei sottoinsiemi DC spleniche di sospensione singola cellula è una procedura multi-step come illustrato in figura 1 eseguire tutte le fasi utilizzando tampone pre-raffreddato e un bagno di acqua ghiacciata per mantenere la temperatura a 4 - 8 ° C.. Tutti i volumi di reagenti nella sezione seguente del protocollo sono calcolati per un ingresso iniziale di 200 ml di sospensione cellulare della milza a 10 8 cellule / ml). Questo può essere scalata verso l&#39;alto ogiù in base alle proprie esigenze modificando il volume di sospensione cellulare (sempre ad una densità di 1 x 10 8 cellule / ml) e altri reagenti proporzionalmente nella fase iniziale (3.1.1 e 3.2.1). Regolare i volumi di reagenti in tutte le fasi successive di conseguenza. Ad esempio, se si parte con 100 ml di sospensione cellulare splenica a 1 x 10 8 / ml, utilizzare metà dei volumi di reagente indicati in tutti i passaggi. <ol><li> L&#39;isolamento di plasmacitoidi DC (PDC) <ol><li> Aggiungere 300 ml di cocktail di anticorpi biotina marcata con fornito nel plasmacitoidi Kit di isolamento DC a 200 ml di sospensione cellulare della milza. </li><li> Mescolare accuratamente e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo ogni 3 minuti per mantenere le cellule in sospensione, e per massimizzare legame dell&#39;anticorpo. </li><li> Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante per rimuovere gli anticorpi biotinilati non legati. </li><li> Risospendere cellapellet in 500 ml di buffer di ordinamento delle cellule. Aggiungere 300 ml di anti-biotina perline anticorpo-coniugato. Ripetere il passaggio 3.1.2 e 3.1.3. </li><li> Gettare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Eseguire tutti i passaggi da questo punto in poi a temperatura ambiente usando tamponi pre-raffreddato. </li><li> Posizionare una nuova cella di attivazione magnetico ordinamento colonna LS nel supporto magnetico. Lavare ed equilibrare colonna con 5 ml di tampone di ordinamento delle cellule. </li><li> Pipetta la sospensione cellulare in colonna, applicando delicatamente al centro della superficie del letto della colonna. Raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Lavare la colonna con 10 ml di tampone di ordinamento delle cellule. Raccogliere questo flusso attraverso e si combinano con il flusso attraverso dal punto 3.1.7. PDC sono arricchiti in questo flusso della colonna attraverso (FT1). </li><li> Agglomerare le cellule da FT1 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, risospendere in 2 ml di cellule tampone di smistamento e passare le cellule attraverso una colonna LS frescaripetendo i punti 3.1.6 - 3.1.8. Questo uso di due colonne sequenziali produce una maggiore purezza delle cellule isolate. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 2 ml di RPMI completo. Mettere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Isolamento di CD8α Pos e CD8α Neg DC Nota: Il primo passo in questa procedura è la deplezione delle cellule B, PDC, T e NK. <ol><li> A partire con tutta la sospensione di cellule della milza (1 ml di 10 8 cellule / ml ottenuti nella fase 2.8), aggiungere 100 ml di cocktail di anticorpi biotina coniugato fornito nel kit di isolamento CD8α Pos DC. </li><li> Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. Toccare il tubo delicatamente ogni 3 min per massimizzare il legame degli anticorpi biotina marcata con le loro cellule bersaglio. </li><li> Aggiungere 12 ml cell sorting tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare eccellentenatant per rimuovere gli anticorpi biotinilati legati. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di smistamento delle cellule e 100 ml di perline anti-biotina forniti nel kit di isolamento CD8α Pos DC. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 10 ml di cellule di smistamento tampone e agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 ml di cellule e passare sopra una colonna LS fresco in base alla procedura dei passi 3.1.6 tramite 3.1.8. </li><li> Raccogliere il flusso senza etichetta attraverso 2 (FT2) ed eliminare il retentato colonna. Questa frazione senza etichetta si arricchisce per CD8α Pos e CD8α Neg DC. </li><li> Agglomerare le cellule in FT2 per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule in tampone di smistamento 1 cella ml e aggiungere 200 ml di-CD8α anti-sfere magnetiche coniugate forniti nel kit di isolamento CD8α Pos DC. </li><li> rappresentantemangiare passi 3.2.2 tramite 3.2.6. Il flusso attraverso la colonna si arricchisce per CD8α Neg DC e impoverito per CD8α Pos DC. Questo è etichettato flusso attraverso 3 (FT3). </li><li> Per eluire il CD8α Pos PVS trattenuto in colonna, rimuovere la colonna dal magnete, aggiungere 5 ml di tampone di smistamento cellulare e spurgare la matrice colonna utilizzando lo stantuffo fornito con la colonna LS. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere in tampone di smistamento 1 ml di cellule. Per aumentare la purezza, eseguire le cellule eluiti nuovo attraverso una colonna LS fresca ripetendo i punti da 3.1.6 a 3.1.8, ad eccezione di scartare il flusso attraverso e raccogliere le cellule conservate come in 3.2.11. </li><li> Per purificare il CD8α Neg DC dalla sospensione FT3, pellet la FT3 mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere in 300 microlitri di tampone di ordinamento delle cellule. </li><li> Aggiungere 100 ml di anti-CD11c MAGperline tiche. Mescolare bene e incubare nel bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti. </li><li> Aggiungere smistamento cellule tampone e pellet 10 ml di cellule mediante centrifugazione a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Ripetere i passaggi 3.1.5 tramite 3.1.8. Il CD8α Neg DC vengono selezionati positivamente con perline CD11c e sono legato alla colonna. Il flusso attraverso può essere scartato. </li><li> Eluire le cellule conservate nella colonna come descritto al punto 3.2.11 per raccogliere il purificato CD8α Neg DC. </li></ol></li></ol> 4. Pulsing APC con gli antigeni e trasferimento di cellule <ol><li> Contare le cellule vive dopo la purificazione mediante trypan esclusione blu da 21 a distinguere le cellule vive e morte. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;antigene di scelta. Utilizzare analoghi di antigene glycolipid chiamato alfa-galactosyl ceramide (αGalCer) a 100 concentrazioni nM 13. In genere, la piastra 10 6 cellule vitali / bene in mezzo completo RPMI con ultra-low Attachment U-bottom piastre da 96 pozzetti per ridurre al minimo l&#39;adesione cellulare. Incubare le cellule in CO 2 atmosphere 5% a 37 ° C per 1 - 4 hr. </li><li> Celle di raccolta pipettando delicatamente diverse volte. Utilizzare ampi suggerimenti foro pipette per ridurre al minimo i danni cellulari da forze di taglio. Lavare i pozzetti con PBS e in comune questi lavaggi per massimizzare la raccolta delle cellule. </li><li> Agglomerare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere alla densità desiderata in PBS. In genere, iniettare 1 milione di cellule in 200 microlitri per destinatario degli animali. Mantenere le cellule in ghiaccio per massimizzare la redditività prima della somministrazione in animali ospiti. </li><li> Iniettare cellule per via endovenosa in topi sia attraverso il vano coda laterale o il plesso venoso retro-orbitale 19. Utilizzare un ago G 27 su una siringa da 1 ml e iniettare un volume massimo di 0,1 ml per topo. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le cellule dendritiche sono accettati per essere il principale antigene professionale, presentando le cellule coinvolte nella adescamento di risposte delle cellule T. La loro funzione principale è quella di rilevare il microambiente del tessuto riprendendo e l&#39;elaborazione di antigeni per la presentazione di cellule T. Al fine di studiare la funzione di specifiche sottopopolazioni DC, questi devono essere isolati in numero sufficiente usando un approccio che mantiene loro normale fenotipo e funzioni. La maggior part...

Le cellule dendritiche (DC) sono stati scoperti quasi quarant&#39;anni fa come il &quot;grande stellate (dendron greco) cella&quot; trovata negli organi linfoidi 1. Molti studi hanno dimostrato che le cellule dendritiche sono le uniche cellule che presentano l&#39;antigene in grado di stimolare efficacemente le cellule T naive 2. Una delle principali funzioni di queste cellule è l&#39;assorbimento e la presentazione di antigeni e la loro elaborazione efficiente e carico di questi su molecole presentanti l&#39;antigene. In milza del mouse, DC può essere separato in plasmacitoidi e sottoinsiemi convenzionali. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono caratterizzati da una bassa espressione di CD11c e alti livelli di B220 e Gr-1. Essi sono anche positivo per il marcatore mPDCA1 superficie ed interferone di tipo I in risposta a pedaggio like receptor 9 (TLR9) ligandi secernono. I DC convenzionali sono alti per CD11c e MHC di classe II espressione. Essi possono essere suddivisi in tre sottogruppi distinti in base alla superficie espressione di marcatori fenotipici quali CD4, CD8α, DEC205, CD11b e delle cellule dendritiche del recettore inibitorio 2 (DCIR2, riconosciuto dal anticorpo 33D1) proteine ​​3,4. I CD8α Pos DC sono noti anche come CDC1, sono positivi per DEC205, ma negativo per i marcatori mieloidi, come CD11b e 33D1. Il CD8α Neg DC, chiamato anche CDC2, sono positivi per 33D1, CD11b e CD4, ma mancano DEC205. Il sottoinsieme negativo doppio (vale a dire, negativo sia per CD4 e CD8α) è relativamente rara, ed è negativo per DEC205 e 33D1. È il sottoinsieme almeno caratterizzati e può essere una forma meno differenziata di CD8α Neg DC. Differenze fenotipiche nei diversi sottoinsiemi DC estendono anche alle loro funzioni in vivo. Il CD8α Neg DC sono altamente fagocitosi e si pensa di presentare l&#39;antigene esogeno principalmente attraverso MHC di classe II a cellule T CD4 3. Al contrario, i CD8α Pos DC sono specializzati per la presentazione dell&#39;antigene proteina solubile in MHC di classe Iin un meccanismo chiamato cross-presentazione. Il risultato di cross-presentazione dipende dallo stato di attivazione di queste cellule dendritiche 5, e può sia portare alla espansione delle cellule T citotossiche (CTL) o lo sviluppo di cellule T regolatorie 6 2,7. Targeting di antigene di CD8α Pos DC utilizzando i risultati di consegna anti-DEC205-mediata da anticorpi in gran parte nella eliminazione delle cellule T 8, mentre la presentazione di antigeni derivati ​​da cellule apoptotiche infettate induce una forte risposta CTL 9. Oltre al riconoscimento di antigeni peptidici, il sistema immunitario dei mammiferi è evoluto per riconoscere lipidico e antigeni glicolipidi. Questi antigeni sono presentati da molecole CD1, che sono MHC di classe proteine ​​di superficie cellulare i-like che esistono in molteplici forme legate in vari mammiferi. Nei topi, un unico tipo di molecola altamente conservata CD1 chiamato CD1d è responsabile per la presentazione di antigeni glicolipidi 10. Il sindaco<html> popolazione di cellule T che riconoscono CD1d / complessi glicolipidici è chiamato cellule NKT invarianti (cellule iNKT). Queste cellule esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T (TCR) composto da una catena TCRα invariante che è associato con catene TCRβ che hanno limitato la diversità 11. A differenza delle cellule T convenzionali che hanno bisogno di proliferare e differenziarsi per diventare cellule T effettrici attivate, le cellule iNKT esistono come una popolazione effettrici e iniziano a reagire rapidamente dopo la somministrazione glycolipid 12. L&#39;identificazione di cellule che presentano l&#39;antigene fisiologicamente rilevanti dei lipidi è un&#39;area attiva di ricerca, e di diversi tipi di cellule distinte, come B cellule, i macrofagi e le cellule dendritiche sono state proposte per svolgere questa funzione. Tuttavia, è stato dimostrato che il sottoinsieme CD8α Pos delle DC è la cellula primaria mediazione captazione e presentazione di antigeni lipidici alle cellule del mouse iNKT 13 e glycolipid mediata cross-priming di cellule T CD8 14. ove_content &quot;&gt; Per confrontare l&#39;efficienza di presentazione dell&#39;antigene da diverse cellule presentanti l&#39;antigene, un approccio semplice è quello di trasferire diversi tipi di APC purificate pulsate con quantità equivalenti di antigene in host naive. esperimenti di trasferimento cellulare di questo tipo sono spesso eseguite per studi immunologici. Tuttavia, l&#39;esecuzione di studi trasferimento con ex vivo antigene trattata DC è impegnativo, poiché queste cellule esistono popolazioni come rare in organi linfoidi in cui costituiscono meno del 2% delle cellule totali 15. è pertanto necessario migliorare lo sviluppo di queste cellule in animali donatori per aumentare l&#39;efficienza di protocolli di isolamento. E &#39;noto che il linfoide comune e progenitori mieloidi comuni, che sono necessari per la generazione di PDC CD8 Pos e sottoinsiemi CD8 Neg DC, fms legati espresso recettore tirosin-chinasi 3 (Flt-3). Al momento in vivo Flt-3 ligando (Flt-3L) amministrazione, emigratione di Flt-3 che esprimono cellule progenitrici del midollo osseo è aumentato, con conseguente aumento della semina organi linfoidi periferici e l&#39;espansione della loro progenie matura DC 16. L&#39;espressione di Flt-3 è perso durante impegno per la B, i percorsi di differenziazione delle cellule T o NK. Pertanto, solo alterazioni minime sono osservati in queste cellule con la somministrazione Flt-3L. Espansione simile nelle popolazioni DC è osservata in topi portatori di tumori generati da impianto di una linea di cellule di melanoma B16-secernenti murino Flt-3L, che fornisce un metodo semplice ed economico per fornire livelli sistemici sostenuti di Flt-3L 17,18. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato un protocollo basato su l&#39;impianto di cellule B16-melanoma secernenti Flt-3L per stimolare l&#39;espansione di tutte le normali sottoinsiemi DC nella milza del mouse, quindi aumentando notevolmente le rese di queste cellule che possono essere isolate per esperimenti successivi . Abbiamo costantemente troviamo che entro 10 - 14 giorni dopo im sottocutaneopiantagione del tumore secernente Flt-3, i topi sviluppano splenomegalia con marcata arricchimento delle DC per costituire 40 - 60% delle cellule totali milza. Da queste milza, diversi sottoinsiemi DC possono essere isolati con elevata purezza utilizzando standard di kit di purificazione delle cellule disponibili in commercio che utilizzano marcatori fenotipici specifici sottoinsieme.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I (polvere secca)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200 proof etanolo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td> Utilizzato per preparare il tampone di lisi RBC <td>al 70% di etanolo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 con terreno L-glutammina&nbsp;</td><td>Life Technologies, terreno DMEM Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>con L-glutammina&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutammina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>aminoacidi non essenziali MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoacidi essenziali&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita</td><td>11130-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS Ca2+ e Mg2+ pH 7.2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (DPBS con Ca2+ e Mg2+)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Soluzione di etilendiamminotetraacetato (EDTA)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue (polvere secca)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&nbsp;</td><td>Preparare lo 0,08% con PBS</td></tr><tr><td>Kit di isolamento di cellule dendritiche plasmacitoidi II, topo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnetiche coniugate con CD11c anti-topo.</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&alfa; Kit di isolamento CC per mouse Pos</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo bloccante il recettore Fc-gamma (Clone 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD11c-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo CD8&alfa;-PerCP&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo B220-PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 1 ml&nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1 ago</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti chirurgici&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare (70 &; micro; m)</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Grandi piastre di Petri&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione sottovuoto (500 ml (0,22 & micro; m))</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>colonne LS&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separatore MACS con supporto magnetico&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Foro largo 200 &mu; l puntali per pipette&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning con attacco ultrabasso Piastre a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>topi femmina C57BL/6 di 6-8 settimane</td><td>Jackson Research Laboratories, Jax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murine B16.Flt3L melanoma line</td><td></td><td></td><td>descritta da Mach et al., 2000</td></tr><tr><td>Serum free DMEM and RPMI media 500 ml di DMEM con L-glutammina, o 500 ml di RPMI-1640 con L-glutammina 5 ml di aminoacidi non essenziali MEM (100x, 10&nbsp; mM) 5 ml di tampone HEPES (1 M) 5 ml di L-glutammina (200&nbsp; mM) 0,5 ml di 2-mercaptoetanolo (5,5 x 10-2 M)</td>Mescolare tutti gli ingredienti in una cabina di biosicurezza con terreni DMEM o RPMI, <td></td><td></td><td>a seconda delle esigenze. Il filtro sterilizza il terreno passando attraverso un 0,22 &micro; m sistema di filtrazione sottovuoto.</td></tr><tr><td><forte>Completa i terreni RPMI e DMEM</td><td></td><td></td><td>Aggiungere 50 ml di siero fetale di vitello inattivato a caldo ai terreni RPMI o DMEM privi di siero per ottenere terreni completi.</td></tr><tr><td>tampone MACS</td><td></td><td></td><td>Aggiungere 2 ml di EDTA 0,5 M e 10 ml di siero fetale di vitello inattivato a caldo a 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, Ca2+ e Mg2+ Free, pH 7,2) e 2&nbsp; &micro; g/ml 2.4G2 (anticorpo Fc-Block).</td></tr><tr><td> tampone di colorazione FACS</td><td></td><td></td><td>Sciogliere l'azide di sodio allo 0,05% (0,25 g per 500 ml) nel tampone MACS per ottenere il tampone di colorazione</td></tr> <tr><td>FACS10x Collagenasi D e DNase 1 soluzione madre 
Sciogliere 1 g di collagenasi D e 0,2 ml di DNasi 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml di PBS contenente Ca2+ e Mg2+ per ottenere una soluzione di circa 1.000-2.000 unità di attività della collagenasi per ml.</td><td></td><td></td><td>Questa soluzione stock 10x può essere preparata in anticipo e conservata a -20 &deg; C per diverse settimane. Diluire 1 ml di questo con 9 ml di RPMI libero dal siero immediatamente prima dell'uso.</td></tr></tbody></table>

un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule professionali presentanti l&#39;antigene principalmente responsabili per l&#39;acquisizione, l&#39;elaborazione e la presentazione di antigeni sulla presentanti l&#39;antigene molecole di avviare l&#39;immunità T-cellulo-mediata. Le cellule dendritiche possono essere separati in diversi sottoinsiemi fenotipico e funzionalmente eterogenee. Tre sottogruppi importanti delle cellule dendritiche della milza sono plasmacitoidi, cellule CD8α Pos e CD8α Neg. Le cellule dendritiche plasmacitoidi sono produttori naturali di interferone di tipo I e sono importanti per l&#39;anti-virale immunità cellulo T. Il sottoinsieme CD8α Neg DC è specializzata per MHC di classe II presentazione dell&#39;antigene ed è coinvolto nel centro di adescamento cellule T CD4. Il CD8α Pos DC sono i principali responsabili per la cross-presentazione di antigeni esogeni e priming delle cellule T CD8. I CD8α Pos DC hanno dimostrato di essere più efficace in occasione della presentazione degli antigeni glicolipidici da molecole CD1d ad un cel T specializzataL popolazione noto come T (iNKT), le cellule natural killer invarianti. La somministrazione di Flt-3 ligando aumenta la frequenza della migrazione dei progenitori delle cellule dendritiche dal midollo osseo, in ultima analisi, con conseguente espansione delle cellule dendritiche in organi linfoidi periferici in modelli murini. Abbiamo adattato questo modello per purificare un gran numero di cellule dendritiche funzionali per l&#39;utilizzo in esperimenti di trasferimento di cellule per confrontare competenza in vivo di diversi sottoinsiemi DC.

L&#39;esito di questa procedura si basa sull&#39;espansione di sottoinsiemi DC da murino Flt-3L espressa dalle cellule di melanoma impiantati. Il tumore B16.Flt3L è stato derivato da un C57BL / 6 del mouse, e dovrebbe essere impiantato in animali con quello sfondo sforzo al fine di evitare il fallimento del tumore per stabilirsi a causa di rifiuto. In alcuni casi, può essere desiderabile utilizzare topi geneticamente modificati per derivare DC con difetti noti vie di segnalazione o recet...

Esistono sottogruppi distinti di cellule dendritiche come popolazioni rare negli organi linfoidi, e quindi sono difficili da isolare in numero e purezza sufficienti per esperimenti immunologici. Qui descriviamo un metodo ad alta efficienza e ad alta resa per l'isolamento di tutti i principali sottogruppi attualmente noti di cellule dendritiche spleniche di topo.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sviluppare un metodo ad alta efficienza e ad alto rendimento per la generazione di cellule dendritiche o DC, che riflettano fatalmente la loro divergenza fenotipica e funzionale in vivo. Le cellule dendritiche esistono come grandi popolazioni negli organi linfoidi. Pertanto, utilizziamo il ligando filtro per aumentare la frequenza di queste cellule essenziali nei tessuti dei donatori per facilitare l'isolamento.Il vantaggio principale di questa tecnica è che rimuove la generazione di tutti i sottoinsiemi DC in numeri adeguati per l'analisi utilizzando solo gli agenti disponibili in commercio. Per raccogliere cellule di melanoma B16 che esprimono il ligando flt-3 da una coltura confluente al 90%, prima lavare le cellule con PBS e incubare la coltura con tripsina allo 05% a 37 gradi Celsius. Dopo 5 minuti, spegnere l'attività della proteasi con 20 millilitri di terreno di coltura completo a 4 gradi Celsius e staccare lo strato del modello cellulare aderente con un leggero picchiettamento e un pipettaggio delicato.Raccogliere le cellule per centrifugazione e contarle. Quindi, risospendere la sospensione a singola cellula a 1 volte la concentrazione di 8 cellule per millilitro in PBS per la loro iniezione sottocutanea in topi riceventi C57 neri 6. Quando il tumore raggiunge un diametro compreso tra due e dieci millilitri, prelevare la milza dagli animali portatori di tumore e metterla in una capsula di Petri contenente terreno RPMI fresco.Usando un bisturi, tagliare i tessuti in pezzi di 0,2 centimetri quadrati, quindi incubare i frammenti in dieci millilitri di collagenasi e Dnasi a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, versare l'impasto di tessuto parzialmente digerito su un colino cellulare da 70 micron e utilizzare uno stantuffo da siringa da cinque millilitri per premere i frammenti di tessuto rimanenti attraverso la maglia del colino. Sciacquare il filtro con 10 millilitri di terreno fresco, unendo il lavaggio con il resto della sospensione a cella singola e pellettare le celle.Sospendiamo il pellet cellulare in 2 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare le cellule in 10 millilitri di terreno RPMI fresco e risospenderle a 1 volta da 10 a 8 cellule per millilitro nel tampone di selezione cellulare contenente il blocco FC. Per isolare le DC del citodo plasmatico, mescolare accuratamente 300 microlitri di cocktail di anticorpi marcati con biotina da un kit di isolamento delle DC del citodo plasmatico con 200 microlitri di sospensione splenica a singola cellula.Mettere le cellule in un bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti, picchiettando delicatamente ogni tre minuti. Quindi lavare le celle con 12 millilitri di tampone di selezione cellulare e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di selezione fresco. Successivamente, incubare le cellule in 300 microlitri di perle coniugate con anti-biotina e anticorpi per altri 15 minuti in acqua ghiacciata picchiettando regolarmente.Dopo aver lavato le celle in un nuovo buffer di selezione, risospendere il pallet in 2 millilitri di buffer di selezione delle celle e caricare una colonna magnetica di dimensioni adeguate sul magnete corrispondente. Equilibrare la colonna con cinque millilitri di tampone di smistamento cellulare fresco a 4 gradi Celsius. Quando tutto il tampone è stato drenato dalla parte superiore della colonna, aggiungere con cautela le celle al centro della superficie della testa della colonna e raccogliere il flusso.Quindi lavare la colonna con 10 millilitri di tampone di selezione fresco a 4 gradi Celsius e raccogliere il flusso nella stessa provetta. Dopo il passaggio attraverso una seconda colonna magnetica, ci si può aspettare una popolazione di cellule dendritiche con citodo plasmatico con una purezza superiore al 94%. Per isolare le CD8aplha+ e CD8alfa-DC, mescolare il resto della sospensione di cellule spleniche con 100 microlitri di cocktail di anticorpi coniugati biotion da un kit di isolamento di cellule CD8alfa+dendritiche per 15 minuti su ghiaccio con picchiettamento delicato, come appena dimostrato.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 12 millilitri di tampone di selezione cellulare a 4 gradi Celsius e risospendere il pellet in 150 microlitri di tampone di selezione cellulare fresco a 4 gradi Celsius. Quindi, mescolare le cellule con 100 microlitri del kit di isolamento delle cellule CD8alpha+dendritiche perline anti-biotina. Dopo 15 minuti sul ghiaccio picchiettando delicatamente, lavare le celle in 10 millilitri di tampone di selezione cellulare a 4 gradi Celsius e risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di selezione fresco a 4 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, smistare le cellule mediante separazione magnetica a bigelle, come appena dimostrato, raccogliendo il flusso e il primo lavaggio. Quindi, far girare le celle e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di selezione cellulare fresco a 4 gradi Celsius. Ora etichettare le cellule con 200 microlitri di perle magnetiche coniugate anti-CD8aplha dal kit e far passare le cellule attraverso una nuova colonna, raccogliendo il flusso di cellule CD8alfa-dendritiche.Per raccogliere i CD8alfa+DC, trasferire la colonna in una provetta conica da 15 millilitri e immergere 5 millilitri di tampone di smistamento cellulare fresco a 4 gradi Celsius attraverso la colonna. Dopo aver fatto passare le cellule attraverso una seconda colonna, ci si può aspettare una popolazione di cellule CD8alfa+dendritiche superiore al 96%. Per isolare le cellule CD8alfa, ruotare la sospensione cellulare CD8alfa-flow-through.Quindi etichettare le cellule con 100 microlitri di perle c-magnetiche anti-CD11 e raccogliere la popolazione cellulare positiva delle biglie magnetiche, come appena dimostrato, per ottenere una popolazione di sottogruppi di cellule CD8alfa-dendritiche superiore al 97%. Infine, determinare il numero di cellule vive, escludendo il blu di tripano. Una volta che il tumore diventa palpabile, i topi portatori di tumore con ligando B16 flt-3 mostrano costantemente un drammatico aumento della cellularità splenica che si correla con l'espansione dei sottogruppi di cellule dendritiche spleniche.È interessante notare che, mentre in questi animali si osserva un aumento da 15 a 20 volte del numero assoluto di cellule per le DC convenzionali, si osserva solo un aumento di circa 4 volte per il sottogruppo di DC del citodo plasmatico. I diversi sottogruppi di cellule dendritiche sono caratterizzati in base alla loro espressione di B220, CD11b, CD11c e CD8alfa. Tuttavia, le popolazioni cellulari mostrano anche altri marcatori di sottogruppi unici, con mPDCA1 espresso esclusivamente sulle DC del citodo plasmatico DEC205 altamente espresso sulle CD8alpa+DC e CD11b e 33D1 rilevati in modo più prominente sulle CD8alfa-DC.Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato che i CD8alpa+DC sono i più efficienti nella presentazione di antigeni da parte di molecole di legame CD a una popolazione specializzata di cellule T note come cellule NKT invarianti. La caratteristica più critica dell'isolamento DC è il mantenimento di una rigorosa sterilità e di condizioni prive di antidossanti. Durante le procedure, queste cellule T sono altamente sensibili agli antidoxant.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare le cellule con delicatezza, poiché la stimolazione meccanica ripetuta può alterare lo stato di maturazione delle cellule dendtritiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per isolare un numero elevato di tutti i principali sottogruppi di DC da una singola milza. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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