Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l'isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sviluppare un metodo ad alta efficienza e ad alto rendimento per la generazione di cellule dendritiche o DC, che riflettano fatalmente la loro divergenza fenotipica e funzionale in vivo. Le cellule dendritiche esistono come grandi popolazioni negli organi linfoidi. Pertanto, utilizziamo il ligando filtro per aumentare la frequenza di queste cellule essenziali nei tessuti dei donatori per facilitare l'isolamento.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che rimuove la generazione di tutti i sottoinsiemi DC in numeri adeguati per l'analisi utilizzando solo gli agenti disponibili in commercio. Per raccogliere cellule di melanoma B16 che esprimono il ligando flt-3 da una coltura confluente al 90%, prima lavare le cellule con PBS e incubare la coltura con tripsina allo 05% a 37 gradi Celsius. Dopo 5 minuti, spegnere l'attività della proteasi con 20 millilitri di terreno di coltura completo a 4 gradi Celsius e staccare lo strato del modello cellulare aderente con un leggero picchiettamento e un pipettaggio delicato.

Raccogliere le cellule per centrifugazione e contarle. Quindi, risospendere la sospensione a singola cellula a 1 volte la concentrazione di 8 cellule per millilitro in PBS per la loro iniezione sottocutanea in topi riceventi C57 neri 6. Quando il tumore raggiunge un diametro compreso tra due e dieci millilitri, prelevare la milza dagli animali portatori di tumore e metterla in una capsula di Petri contenente terreno RPMI fresco.

Usando un bisturi, tagliare i tessuti in pezzi di 0,2 centimetri quadrati, quindi incubare i frammenti in dieci millilitri di collagenasi e Dnasi a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, versare l'impasto di tessuto parzialmente digerito su un colino cellulare da 70 micron e utilizzare uno stantuffo da siringa da cinque millilitri per premere i frammenti di tessuto rimanenti attraverso la maglia del colino. Sciacquare il filtro con 10 millilitri di terreno fresco, unendo il lavaggio con il resto della sospensione a cella singola e pellettare le celle.

Sospendiamo il pellet cellulare in 2 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi lavare le cellule in 10 millilitri di terreno RPMI fresco e risospenderle a 1 volta da 10 a 8 cellule per millilitro nel tampone di selezione cellulare contenente il blocco FC. Per isolare le DC del citodo plasmatico, mescolare accuratamente 300 microlitri di cocktail di anticorpi marcati con biotina da un kit di isolamento delle DC del citodo plasmatico con 200 microlitri di sospensione splenica a singola cellula.

Mettere le cellule in un bagno di acqua ghiacciata per 15 minuti, picchiettando delicatamente ogni tre minuti. Quindi lavare le celle con 12 millilitri di tampone di selezione cellulare e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di selezione fresco. Successivamente, incubare le cellule in 300 microlitri di perle coniugate con anti-biotina e anticorpi per altri 15 minuti in acqua ghiacciata picchiettando regolarmente.

Dopo aver lavato le celle in un nuovo buffer di selezione, risospendere il pallet in 2 millilitri di buffer di selezione delle celle e caricare una colonna magnetica di dimensioni adeguate sul magnete corrispondente. Equilibrare la colonna con cinque millilitri di tampone di smistamento cellulare fresco a 4 gradi Celsius. Quando tutto il tampone è stato drenato dalla parte superiore della colonna, aggiungere con cautela le celle al centro della superficie della testa della colonna e raccogliere il flusso.

Quindi lavare la colonna con 10 millilitri di tampone di selezione fresco a 4 gradi Celsius e raccogliere il flusso nella stessa provetta. Dopo il passaggio attraverso una seconda colonna magnetica, ci si può aspettare una popolazione di cellule dendritiche con citodo plasmatico con una purezza superiore al 94%. Per isolare le CD8aplha+ e CD8alfa-DC, mescolare il resto della sospensione di cellule spleniche con 100 microlitri di cocktail di anticorpi coniugati biotion da un kit di isolamento di cellule CD8alfa+dendritiche per 15 minuti su ghiaccio con picchiettamento delicato, come appena dimostrato.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 12 millilitri di tampone di selezione cellulare a 4 gradi Celsius e risospendere il pellet in 150 microlitri di tampone di selezione cellulare fresco a 4 gradi Celsius. Quindi, mescolare le cellule con 100 microlitri del kit di isolamento delle cellule CD8alpha+dendritiche perline anti-biotina. Dopo 15 minuti sul ghiaccio picchiettando delicatamente, lavare le celle in 10 millilitri di tampone di selezione cellulare a 4 gradi Celsius e risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di selezione fresco a 4 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, smistare le cellule mediante separazione magnetica a bigelle, come appena dimostrato, raccogliendo il flusso e il primo lavaggio. Quindi, far girare le celle e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di selezione cellulare fresco a 4 gradi Celsius. Ora etichettare le cellule con 200 microlitri di perle magnetiche coniugate anti-CD8aplha dal kit e far passare le cellule attraverso una nuova colonna, raccogliendo il flusso di cellule CD8alfa-dendritiche.

Per raccogliere i CD8alfa+DC, trasferire la colonna in una provetta conica da 15 millilitri e immergere 5 millilitri di tampone di smistamento cellulare fresco a 4 gradi Celsius attraverso la colonna. Dopo aver fatto passare le cellule attraverso una seconda colonna, ci si può aspettare una popolazione di cellule CD8alfa+dendritiche superiore al 96%. Per isolare le cellule CD8alfa, ruotare la sospensione cellulare CD8alfa-flow-through.

Quindi etichettare le cellule con 100 microlitri di perle c-magnetiche anti-CD11 e raccogliere la popolazione cellulare positiva delle biglie magnetiche, come appena dimostrato, per ottenere una popolazione di sottogruppi di cellule CD8alfa-dendritiche superiore al 97%. Infine, determinare il numero di cellule vive, escludendo il blu di tripano. Una volta che il tumore diventa palpabile, i topi portatori di tumore con ligando B16 flt-3 mostrano costantemente un drammatico aumento della cellularità splenica che si correla con l'espansione dei sottogruppi di cellule dendritiche spleniche.

È interessante notare che, mentre in questi animali si osserva un aumento da 15 a 20 volte del numero assoluto di cellule per le DC convenzionali, si osserva solo un aumento di circa 4 volte per il sottogruppo di DC del citodo plasmatico. I diversi sottogruppi di cellule dendritiche sono caratterizzati in base alla loro espressione di B220, CD11b, CD11c e CD8alfa. Tuttavia, le popolazioni cellulari mostrano anche altri marcatori di sottogruppi unici, con mPDCA1 espresso esclusivamente sulle DC del citodo plasmatico DEC205 altamente espresso sulle CD8alpa+DC e CD11b e 33D1 rilevati in modo più prominente sulle CD8alfa-DC.

Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato che i CD8alpa+DC sono i più efficienti nella presentazione di antigeni da parte di molecole di legame CD a una popolazione specializzata di cellule T note come cellule NKT invarianti. La caratteristica più critica dell'isolamento DC è il mantenimento di una rigorosa sterilità e di condizioni prive di antidossanti. Durante le procedure, queste cellule T sono altamente sensibili agli antidoxant.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare le cellule con delicatezza, poiché la stimolazione meccanica ripetuta può alterare lo stato di maturazione delle cellule dendtritiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per isolare un numero elevato di tutti i principali sottogruppi di DC da una singola milza. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.