Name: Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri come sviluppare e caratterizzare cellule dendritiche tollerogeniche murine per la terapia immunologica delle malattie autoimmuni come la sclerosi multipla. Questo protocollo standardizzato facilita la ricerca sulle TolDCs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Reata Pharmaceuticals per la fornitura di CDDO-DFPA. Riconosciamo anche il supporto del Jane e Lee Seidman Chair in innovazione di cancro pediatrico (John Letterio). Questo lavoro è stato sostenuto dal dipartimento della difesa [W81XWH-12-1-0452]; l'iniziativa di ricerca cancro adulti Angie Fowler adolescente e giovane al caso Comprehensive Cancer Center; e il premio di studioso di Callahan laureato per Hsi-Ju Wei da F.J. Callahan Foundation.

Tutti gli studi sono stati effettuati nel rispetto delle procedure approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale della Case Western Reserve University School of Medicine.
1. preparare le cellule dendritiche derivate da midollo osseo (BMDCs)
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclave ed eseguire l'esperimento in classe II biologica sicurezza gabinetto con le procedure di sicurezza appropriate.</li>
	<li>Eutanasia topi C57BL/6 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Asportare le ossa tibia-perone e femore utilizzando una forbice chirurgica e metterli con etanolo al 70% in una piastra di coltura di 10 cm.</li>
	<li>Utilizzare lame chirurgiche e forcipe per dissecare tessuto via quanto possibile sul coperchio di 10 cm cultura piatto e isolare delle tibie e femori di inserirli con etanolo al 70% in una piastra di coltura di 6 cm.</li>
	<li>Utilizzare lame chirurgiche per tagliare entrambe le estremità delle tibie e femori. Utilizzare 3 mL di PBS in siringa da 3 ml con un ago di 23G per svuotare il contenuto del midollo da un'estremità delle ossa in una provetta conica contenente 12 ml di PBS. Ripetere questo passaggio 3x per ciascuna estremità delle ossa.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 1 ml di tampone lisante per ACK per 5 minuti rimuovere le cellule di anima rosse.</li>
	<li>Aggiungere 9 ml di PBS per diluire il tampone lisante ACK e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere con 10 ml terreno di coltura (RPMI-1640 plus L-Glutammina, 10% FBS, 1% non essenziali aminoacidi (100x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoetanolo e 5% di penicillina/streptomicina). Nota: Il livello dell'endotossina dev'essere inferiore a 0,1 EU/ml in FBS.</li>
	<li>Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 40 μm e prendere 20 µ l di sospensione cellulare e mescolare con 80 µ l di trypan blu per contare il numero di cellule vive di citometro.</li>
	<li>Regolare il numero di cellulare a 1 x 106 cellule/ml a 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4.</li>
	<li>Piastra 3 ml di 1 x 106 cellule/ml in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule al 95% di umidità nell'incubatore CO2 , 37 ° C e 5% CO2. Nota: Le cellule del midollo osseo da un mouse è intorno 3-5 x 107 cellule, indicando che può essere collocato da 2 a 3 piastre da 6 pozzetti.</li>
	<li>Il giorno 3, rimuovere tutti i 3 ml di terreno di cultura da ogni pozzetto, aggiungere 2 ml di PBS fresco in ciascun pozzetto e quindi ruotare delicatamente la piastra per garantire la rimozione di tutte le cellule non-aderenti.</li>
	<li>Sostituire 3 ml terreno di coltura nuovo con 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule al 95% di umidità nell'incubatore CO2 , 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Il giorno 5, aggiungere direttamente un altro 3 ml terreno di coltura fresco con 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37° C, 5% CO2 e 95% di umidità nell'incubatore CO2 . Nota: Il volume totale in ciascun pozzetto è ora 6 ml.</li>
	<li>Il giorno 7, mettere l'intera piastra in ghiaccio per 10 minuti. Pipettare delicatamente il terreno di coltura in ogni pozzetto per sloggiare il vagamente-aderente BMDCs come iDCs in sospensione. Nota: I macrofagi aderenti sono ancora collegati alla piastra. Procedure e delicatamente a bassa temperatura sono la chiave per evitare l'attivazione delle DC per interessare ulteriori esperimenti.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti e risospendere con terreno di coltura fresco per ulteriori esperimenti. Nota: BMDCs può essere identificato con anticorpo marcato con fluorescenza di CD11c tramite flusso cytometry e ci ha mostrato la nostra strategia di gating di BMDCs per ulteriori esperimenti in Figura 1.</li>
</ol>2. caratterizzare il Gene TolDC e profilo proteico
<ol><li>Piastra 2 ml di 1 x 106 BMDCs/ml per pozzetto in 6-piastra con terreno di coltura in presenza o assenza di 100-400 nM CDDO-DFPA per l'incubazione di 1 h a 37 ° C e 95% di umidità nell'incubatore CO2 e 5% CO2 . Nota: CDDO-DFPA, un triterpenoide sintetico, è un fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2) - come - 2 induttore di fattore (Nrf2) e fattore-κB nucleare (n-f-κB) inibitore. Applicare altri agenti per l'induzione di TolDCs da IDC, quali IL-10, vitamina D3, desametasone o BAY 11-7085 e modificare questo passaggio a una condizione ottima per ogni agente.</li>
	<li>Aggiungere 10 o 100 ng/ml di LPS per l'incubazione di 4-24 ore per indurre MDC (tempo di incubazione è diverso a causa della misura di mRNA e proteina).</li>
	<li>Delicatamente Pipettare il terreno di coltura in ciascun pozzetto e raccogliere la sospensione cellulare mediante pipetta da 1 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti raccogliere le cellule e il surnatante, rispettivamente.</li>
	<li>Analizzare i leganti di superficie dai pellet cellulare mediante citometria a flusso, come stimolatore ligandi: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL o inibitori ligandi: PD-L1, L2-PD, ILT3, ILT4.</li>
	<li>Isolare il RNA dai pellet cellulare e analizzare il RNA e il surnatante campioni per i livelli di profilo e gene e della proteina di cytokine di PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) ed ELISA, rispettivamente. Nota: per esempio, le citochine infiammatorie: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL 23 o anti-infiammatori citochine: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.</li>
</ol>3. valutare la funzione di TolDCs In Vitro e In Vivo
<ol><li>
Analisi di proliferazione Syngeneic della T-cellula
	<ol>
<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclave ed eseguire l'esperimento in classe II biologica sicurezza gabinetto con le procedure di sicurezza appropriate.</li>
		<li>Preparare il tampone di Mac utilizzando 0,5% albumina di siero bovino (BSA) e 2 mM EDTA in 500 ml di PBS. Sterilizzare il buffer filtrando attraverso un filtro da 0,2 µm. Nota: Mantenere il buffer sul ghiaccio durante il seguente esperimento.</li>
		<li>Per ottenere CD4+ T cellule, eutanasia topi transgenici di OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome utilizzando pinze e forbici chirurgiche.</li>
		<li>Mettere la milza con 2 ml di PBS in una piastra di coltura di 6 cm e utilizzare il retro della bacchetta di spinta della siringa da 3 ml per tritare la milza passando un colino di cella 40 μm.</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 400 μl di tampone di MACS.</li>
		<li>Aggiungere 100 μl di CD4 T Cell biotina-anticorpo Cocktail+ a 4° C per 5 minuti. Nota: L'anticorpo cocktail lega su altri tipi di cellule tranne CD4+ T cellule, quali CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC di classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.</li>
		<li>Aggiungere 300 μl di tampone di MACS e 200 μl di perline anti-biotina (Tabella materiali) a 4° C per 10 minuti.</li>
		<li>Luogo la colonna composto di sfere ferromagnetici (Tabella materiali) e filtro pre-separazione insieme in magnetico campo e sciacquarlo con 3 ml di tampone di MACS.</li>
		<li>Aggiungere 9 ml di buffer di Mac nelle cellule e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone di MACS e applicare sulla colonna. Raccogliere flusso-attraverso CD4 contenenti+ T cellule.</li>
		<li>Lavare la colonna con un altro 3 ml di tampone Mac e anche raccogliere il flusso continuo.</li>
		<li>Per ottenere il pan splenica DCs, eutanasia topi C57BL/6 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome utilizzando pinze e forbici chirurgiche. Mettere la milza in una piastra di coltura 6cm contenente 2 ml di soluzione della collagenosi D (collagenasi 2 mg/ml D disciolto in HBSS contenenti calcio, magnesio).</li>
		<li>Iniettare 1 ml di soluzione di collagenasi D alla milza due volte con una siringa da 1 ml e un ago 25G. Tagliate la milza a pezzetti con piccole forbici.</li>
		<li>Agitare ed incubare a temperatura ambiente per 25 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 500 μl di EDTA 0.5 M a temperatura ambiente per 5 minuti. Nota: I passaggi da 3.1.13-3.1.14 sono fondamentali per aumentare la resa di DCs.</li>
		<li>Ora è possibile utilizzare il retro della bacchetta di spinta della siringa da 3 ml per tritare il liquame di milza passando un colino di cella 40 μm e raccogliere la sospensione cellulare mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 350 μl di tampone MACS, 50 μl di Reagente Bloccante FcR e 100 μl di Pan dendritiche cella biotina-anticorpo Cocktail a 4° C per 10 minuti. Nota: L'anticorpo cocktail contro gli antigeni che non sono espressi da DCs.</li>
		<li>Lavare le cellule con l'aggiunta di 9 ml di buffer di MACS e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 800 μl di tampone di MACS e aggiungere 200 μl di anti-biotina perline a 4 ° C per 10 minuti.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.1.9-3.1.11 per raccogliere DCs.</li>
		<li>Lavare la colonna con un altro 3 ml di tampone di MACS due volte e anche raccogliere il flusso continuo.</li>
		<li>Trattare il 2 x 105 DCs/ml in presenza o assenza di cellule di T di 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C per 1 ora separatamente, etichetta il CD4+ (1 x 107/ml) con 1 μM CFSE a 37 ° C per 15 minuti, lavare con PBS e regolare il volume per ottenere la concentrazione finale a 2 x 106 T cellule/ml.</li>
		<li>Successivamente, in una piastra a 96 pozzetti, co-cultura 100 μl di cellule dendritiche trattate con lo stesso volume di CFSE-labeled CD4 cellule+ T, entrambi raccolti dai passaggi precedenti per ottenere 01:10 ratio. Ora aggiungere 100 ng/mL ovoalbumina (uova) peptide 323-329 al bene e misura l'intensità CFSE delle T cellule tramite flusso cytometry dopo 2-3 giorni di incubazione. Nota: I numeri di cellulare e rapporto di DCs e T cellule sono state ottimizzate dal nostro precedente lavoro37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Indurre il passivo EAE iniettando BMDCs pulsata con Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Piastra da 2 ml di 1 x 106 BMDCs/ml per pozzetto in 6-piastra con terreno di coltura in presenza o assenza di 100-400 nM CDDO-DFPA per l'incubazione di 1 ora.</li>
		<li>Aggiungere 10 ng/ml di LPS per incubazione 24 hrs.</li>
		<li>Aggiungere 100 μg/ml di MOG (35-55) per incubazione 4 hrs.</li>
		<li>Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare con PBS e contare le celle.</li>
		<li>Iniettare per via sottocutanea 200 μl di 2 x 106 cellule ai topi C57BL/6 femminili di 8-10 settimane vecchio (100 μl in ogni gamba posteriore).</li>
		<li>Il giorno dell'iniezione di BMDC e 48 hrs. più tardi, iniettare 200 ng di tossina della pertosse (PTX) in ogni mouse.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.2.6-3.2.7 una volta a settimana per 4 settimane consecutive.</li>
		<li>Valutare i sintomi clinici di EAE quotidianamente utilizzando criteri standard37 (0,5-zoppicare coda, coda 1-zoppicare, debolezza dell'arto posteriore di 2-moderato, 3-severa dell'arto debolezza, paralisi dell'arto posteriore 4-completare, stato 5-quadriplegia o moribondo, 6-morte).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Questo documento descrive un efficiente protocollo che può essere utilizzato per riproducibile per generare iDCs e successivamente li differenziano in TolDCs, e proponiamo che questo può essere applicato per valutare la capacità di nuovi agenti a bersaglio molecolare per indurre il TolDC fenotipo. Come descritto in questo rapporto, abbiamo seguito una sequenza in cui abbiamo analizzato prima TolDC espressione di leganti di superficie tramite flusso cytometry, seguito da una valutazione del profilo di citochina DC come mi...

Cellule dendritiche (DCs) sono parte integrante del sistema immunitario innato e sono stati scoperti e caratterizzate da Ralph Steinman e Zanvil Cohn nel 1973 come antigene professionale primario che presenta cellule1. DCs hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nell'attivazione del sistema immunitario con la presentazione di antigeni processati a cellule T e cellule di B via complessi di istocompatibilità (MHC) negli organi linfoidi secondari per collegare il sistema immunitario innato e adattivo2. Nel sistema immunitario mammifero, ci sono almeno due categorie di DCs che sono stati descritti come DCs mieloidi e plasmacytoid DCs (PDC)3. DCs mieloidi, noto anche come DCs convenzionali (cDCs), sono caratterizzati dall'espressione di CD11c e possono essere differenziati come immaturi DCs (IDC) in vitro da cellule progenitrici del midollo osseo o monociti del sangue periferico mediante del granulocyte-macrofago-colony-stimulating factor (GM-CSF) e IL-4 in specie murina o umano, rispettivamente4.
Segnali di attivazione «pericolo», come pattern molecolari associati (PAMP) o pattern molecolari associati danni (umido), guiderà iDCs maturazione verso immunogeno DCs come DC mature (MDC) via vincolanti per diversi recettori di riconoscimento di pattern la superficie di DC5. Proliferazione delle cellule T naive e differenziazione con il upregulation di MHCII2, ligandi costimolazione (CD80, CD86 e CD40)6, citochine e altri mediatori solubili7prime immunogeno DCs ulteriormente. Una cascata di produzione mediatore pro-infiammatorio da DCs immunogeno è essenziale per il differenziamento di citochina-mediata delle cellule di T. Ad esempio, sia di IFN-γ e di IL-12 sono necessari per Th1 differenziazione8 e il-1, IL-6 e IL-23 sono critici per ingenuo polarizzazione delle cellule T nei confronti di cellule Th179. Anche se DC mature reagire agli antigeni stranieri, attivazione incontrollata di DC di auto-antigeni può causare ablazione di tolleranza e favorire lo sviluppo delle malattie autoimmuni tramite la generazione di cellule T autoreattive cui attivazione porta alla distruzione del tessuto10 .
I rapporti recenti hanno fornito prove evidenti della plasticità DC, esemplificato dalla loro capacità di interagire con diversi spunti nel loro microambiente di tessuto e di differenziarsi in sottogruppi distinti dell'effettore/soppressore DC. I mediatori anti-infiammatori, quali IL-10,11, TGF-β12e13 di HO-1 hanno dimostrati di giocare un ruolo importante nella soppressione immune inducendo tollerogeniche DCs (TolDCs). Questi TolDCs acquisire funzioni di regolamentazione e sopprimere la proliferazione di cellule T14. Inoltre, la mancanza di co-stimolazione di DCs e la produzione di mediatori anti-infiammatori da TolDCs sia contribuire all'induzione di cellule T regolatorie (Treg) e anche efficacemente inibire la differenziazione e l'espansione sia Th1 e Th1715. In oltre due decenni, il potenziale terapeutico di TolDCs è stato segnalato da parecchi ricercatori. In questi studi, la somministrazione di ex vivo generata TolDCs non solo ha migliorato i sintomi patologici in diversi modelli preclinici di malattie autoimmuni16 ma inoltre ha condotto allo sviluppo della tolleranza immunitaria nei pazienti17 ,18. È interessante notare che, oggi la terapia TolDCs è stata considerata come un approccio alternativo o adjunctive per le malattie autoimmuni in diversi studi clinici, tra cui tipo 1 diabete mellito19, artrite reumatoide20, 21, sclerosi a placche (MS)22,23,24e di malattia di Crohn25.
Ci sono una varietà di protocolli che sono stati impiegati per sviluppare TolDCs e diversi laboratori sono segnalati i metodi per la generazione e caratterizzazione fenotipica di TolDCs. Questi metodi possono essere utilizzati per generare riproducibile TolDCs in vitro da progenitori ematopoietici e per mantenerli stabilmente in un tollerogeniche stato vivo26,27,28,29. Il iDCs può essere convertito in TolDCs tramite l'esposizione ai vari agenti farmacologici immunomodulatori o citochine antinfiammatorie. Ad esempio, la vitamina D3 è un noto agente farmacologico noto per aumentare la produzione di IL-10 e sopprimere la secrezione di IL-12 da DCs e quindi Spinta loro funzione immunosopressiva30. Inoltre, quando DCs sono esposte a stimoli infiammatori potenti, quali i lipopolisaccaridi (LPS), diversi agenti farmacologici quali desametasone31, rapamicina32e corticosteroidi33 sono stati indicati per indurre la Fenotipo TolDC riducendo l'espressione di superficie di CD40, CD80, CD86 e MHCII34DC. IL-10 e TGF-β sono le citochine antinfiammatorie più studiato per indurre tolleranza di DC35 e l'esposizione concomitante ad entrambe queste citochine sono state indicate per indurre un fenotipo tollerogeniche in DCs36.
Dal tollerogeniche DC è definito dalle caratteristiche funzionali piuttosto che di marcatori fenotipici, c'è un grande bisogno di sviluppare un metodo coerente per caratterizzazione cellulare e funzionale di TolDCs. Inoltre, occorre stabilire un protocollo rigoroso e coerenza per la costante valutazione e caratterizzazione del fenotipo di cellule DC tollerogeniche se siamo in modo efficace e riproducibile confrontare la capacità di nuovi agenti di indurre il fenotipo di TolDC nella laboratorio. Qui forniamo un protocollo dettagliato con metodi dettagliati per isolare iDCs da progenitori ematopoietici dei topi e successivamente analizzare l'efficacia di nuovi agenti nell'ambito della valutazione per la loro capacità di convertire iDCs in TolDCs, che fornisce un robusto caratterizzazione fenotipica e funzionale di TolDCs sia in vitro che in vivo. Questa descrizione include un metodo elaborato per caratterizzare il TolDCs da loro leganti di superficie, il profilo di citochina e funzioni immunosoppressive in vitro. Forniamo anche un esempio di un metodo per esplorare il potenziale applicazione terapeutica di questi TolDCs in un modello preclinico di MS, encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo stabilito aiuterà i ricercatori a valutare la capacità di nuovi agenti per promuovere l'induzione di TolDCs e faciliterà lo sforzo per ampliare l'ambito di sviluppo terapeutico TolDC.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>sintesi interna</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Topo GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>Differenziazione BMDC</td></tr><tr><td>Mouse IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td> Lipopolisaccaridi di <td>differenziazione BMDC</td></tr><tr><td>(LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Tossina della pertosse (PTX)</td><td>R& D systems</td><td>3097</td><td>EAE</td></tr><tr><td>induzione MOG (35&ndash; 55) peptide</td><td>21stCentury Biochemicals</td><td>in house sintesi</td><td>EAE</td></tr><tr><td>induzione Trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>RPMI-1640 più L-glutammina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Aminoacido non essenziale (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>40 &#956; filtro cellulare m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Isolamento cellulare</td></tr><tr><td>PE-coniugato CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>PE-coniugato CD86</td><td>BD Biosciences Biosciences</td><td>555665</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>PE-coniugato PD-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>MHCII Miltenyi Biotec coniugato APC</td> Inc<td>.</td><td>130-112-388</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>CD11c coniugato con APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Citometria a flusso</td></tr><tr><td>Isotipo abbinato PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Citometria a flusso</td></tr>: <tr><td>isotipo abbinato APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Citometria a flusso</td></tr>, <tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td>, <td>423801</td><td>Test di proliferazione delle cellule T</td></tr>, <tr><td>Kit di isolamento delle cellule dendritiche Pan</td>, <td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule</td></tr><tr><td>T Reagente bloccante FcR</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule</td></tr><tr><td>T Kit di isolamento delle cellule T CD4+</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>CD4+ Cocktail di anticorpi biotina</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Tampone di lisi ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>Differenziazione BMDC</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Siringa da 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>Differenziazione BMDC</td></tr><tr><td>Ago 25G</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Ago 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>differenziazione BMDC</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>Test di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Test di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>Filtro di pre-separazione</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>collagenasi D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>Test di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>Saggio di proliferazione delle cellule T</td></tr><tr><td>peptide dell'ovoalbumina (OVA) 323... 329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td>Saggio <td>di proliferazione delle cellule T</td> <td>O1641</td></tr><tr><td>IFN di topo-&gamma; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12a TaqMan sonda</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Mouse EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alpha; TaqMan sonda</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse TNF-&alpha; Kit ELISA Quantikine</td><td>R& D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan sonda</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan sonda</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan sonda ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 TaqMan sonda ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-eme ossigenasi 1 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-&beta;-actina</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSAnalizzatore cellulare di alibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citometria a flusso</td></tr></tbody></table>

sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

Il sistema immunitario opera mantenendo un equilibrio stretto tra coordinamento risposte contro antigeni estranei e mantenere uno stato non rispondono contro autoantigeni come pure gli antigeni derivati da organismi commensali. La rottura di questa omeostasi immunitaria può portare a un'infiammazione cronica e lo sviluppo dell'autoimmunità. Le cellule dendritiche (DCs) sono le cellule presentanti l'antigene professionale del sistema immunitario innato coinvolto nell'attivazione di cellule T naïve per avviare le risposte immunitarie contro antigeni estranei. Tuttavia, DCs possono essere differenziate anche in TolDCs che agiscono per mantenere e promuovere la tolleranza delle cellule T e di sopprimere le cellule effettrici che contribuiscono allo sviluppo di entrambi condizioni di infiammazione cronica o autoimmune. Il recente progresso nella nostra comprensione di TolDCs suggerisce che tolleranza DC può essere realizzato modulando le loro condizioni di differenziazione. Questo fenomeno ha portato ad una crescita enorme nello sviluppo di terapie TolDC per numerosi disturbi del sistema immunitario causati dovuto rompere in tolleranza immunitaria. Studio di successo in modelli murini di autoimmunità preclinici ulteriormente hanno convalidato l'utilità immunoterapia di TolDCs nel trattamento dei disordini autoimmuni. Oggi, TolDCs sono diventati uno strumento promettente immunoterapia nella clinica per reintegrare la tolleranza immunitaria in vari disordini immuni mirando ai patogene risposte autoimmuni mantenendo intatti l'immunità protettiva. Anche se una matrice delle strategie è stato proposto da vari laboratori per indurre TolDCs, c'è alcuna coerenza nel caratterizzare il fenotipo cellulare e funzionale di queste cellule. Questo protocollo fornisce una guida passo passo per lo sviluppo di derivate da midollo osseo DCs in gran numero, un unico metodo utilizzato per differenziarli in TolDCs con un triterpenoide sintetico 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acido-difluoro-propil-ammide (CDDO-DFPA) e le tecniche utilizzate per confermare il loro fenotipo, incluse le analisi di firme molecolari essenziali di TolDCs. Infine, vi mostriamo un metodo per valutare la funzione TolDC testando loro immunosopressiva risposta in vitro e in vivo in un modello preclinico di sclerosi multipla.

La differenziazione e la selezione di BMDCs:
Cellule progenitrici del midollo osseo sono state coltivate in terreno RPMI completo in presenza di GM-CSF e IL-4 di differenziarsi in IDC per 7 giorni (Figura 1A). Il giorno 1, cellule erano di piccole dimensioni ed ha mostrato la morfologia sferica. Lavaggio con PBS prima la sostituzione del mezzo fresco il giorno 3 aiutato cellule ai c...

Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sviluppare e caratterizzare cellule dendritiche tolerogeniche murine per la valutazione della loro utilità immunoterapica nel trattamento di malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia cellulare dendritica tollerogenica, fornendo un metodo standardizzato per lo sviluppo e la caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche. I principali vantaggi di questa tecnica sono che può essere utilizzata per lo sviluppo di cellule dendritiche tollerogeniche di successo e per i test di efficacia delle cellule dendritiche tollerogeniche funzionali.Le implicazioni di questa tecnica sono significative. Si estendono allo sviluppo dell'immunoterapia cellulare per le malattie autoimmuni, poiché le cellule dendritiche tollerogeniche possono ripristinare una risposta immunitaria anomala pur rimanendo soggette a meccanismi di regolazione immunitaria intrinseci. Dopo aver raccolto le ossa delle zampe posteriori da topi C57BL/6 di 8-10 settimane, secondo i protocolli standard, utilizzare lame chirurgiche e pinze per sezionare quanto più tessuto possibile e posizionare le tibie e i femori puliti in una piastra di coltura di sei centimetri contenente il 70% di etanolo.Tagliare entrambe le estremità delle ossa con una lama chirurgica e utilizzare una siringa da tre millilitri, dotata di un ago calibro 23, per lavare il midollo dal primo osso con tre millilitri di PBS in una provetta conica da 15 millilitri. Quando tutto il midollo è stato raccolto, centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi. Dopo cinque minuti, interrompere la lisi con nove millilitri di PBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Risospendere il pellet di cellule bianche del midollo osseo in 10 millilitri di terreno di coltura e filtrare le cellule attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una nuova provetta. Regolare le cellule a una concentrazione di una volta per 10 al sesto di cellule per millilitro in terreno di coltura integrato con GM-CSF e IL-4. E piastrate tre millilitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per un'incubazione di tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il terzo giorno, lavare le cellule in ogni pozzetto con due millilitri di PBS e agitare delicatamente per rimuovere le cellule non aderenti. Quindi nutrire le cellule con tre millilitri di terreno di coltura fresco integrato con GM-CSF e IL-4 e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare, aggiungendo altri tre millilitri di terreno di coltura fresco, integrati con citochine a ciascun pozzetto dopo due giorni. Il settimo giorno di cultura, metti il piatto sul ghiaccio.Dopo 10 minuti, pipettare delicatamente il terreno di coltura in ciascun pozzetto per rimuovere in sospensione le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo poco aderenti e immature. Quindi, raggruppare le cellule per la raccolta mediante centrifugazione e risospendere il pellet nel volume appropriato di terreno di coltura fresco per la successiva analisi a valle. Per misurare la proliferazione delle cellule T singeniche, utilizzare prima l'estremità posteriore di uno stantuffo da siringa da tre millilitri per schiacciare una milza da un topo OT2 C57BL/6 di 8-10 settimane attraverso un colino cellulare da 40 micrometri e sciacquare il filtro con PBS.Pellettare la sospensione cellulare raggruppata mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone di selezione cellulare magnetico e 100 microlitri di cocktail biotina-anticorpo di cellule T CD4 positive a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 300 microlitri di tampone di selezione e 200 microlitri di perle di anti-biotina alle cellule per un'incubazione di 10 minuti e quattro gradi Celsius e posizionare una colonna di microsfere magnetiche e un filtro di pre-separazione in un magnete di separazione cellulare di dimensioni adeguate. Sciacquare la colonna con tre millilitri di tampone di selezione e aggiungere nove millilitri di tampone di cernita alle celle.Dopo la centrifugazione, risospendere la cella e il pellet in tre millilitri di tampone di selezione e aggiungere la sospensione cellulare alla colonna per raccogliere l'eluato di cellule T CD4 positivo in un contenitore appropriato. Quindi lavare la colonna con altri tre millilitri di tampone di selezione, raccogliendo il flusso e posizionare le cellule T sul ghiaccio. Per l'isolamento delle cellule dendritiche pan spleniche singeniche, posizionare la milza di un topo C57BL/6 di otto-dieci settimane in un piatto di coltura di sei centimetri e utilizzare una siringa da un millilitro, dotata di un ago calibro 25, per iniettare due volte un millilitro di soluzione di collagenasi D nella milza.Quindi, usa le forbici per tagliare la milza in piccoli pezzi e incubare i pezzi agitandoli a temperatura ambiente per 25 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 microlitri di EDTA 0,5 molari all'impasto tissutale per un'incubazione finale di cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, utilizzare l'estremità posteriore di uno stantuffo da siringa da tre millilitri per schiacciare l'impasto della milza attraverso un colino cellulare da 40 micrometri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Risospendere il pellet in 350 microlitri di tampone di selezione delle cellule magnetiche, 50 microlitri di reagente bloccante il recettore Fc e 100 microlitri di cocktail di biotina-anticorpi a cellule pan dendritiche per un'incubazione di 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in nove millilitri di tampone di selezione e risospendere il pellet in 800 microlitri di tampone di selezione fresco con 200 microlitri di perle di anti-biotina a quattro gradi Celsius per 10 minuti per l'isolamento della popolazione di cellule dendritiche pan spleniche mediante selezione magnetica delle biglie , come appena dimostrato. Risospendere le cellule a una concentrazione di due volte 10 al quinto dendritico per millilitro e trattarle con l'appropriata concentrazione sperimentale del triterpenoide di interesse per un'ora a 37 gradi Celsius.Durante l'ultimo terzo dell'incubazione, risospendere le cellule T a una concentrazione di una volta 10-7 cellule per millilitro in un micromolare CFSE per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le cellule con PBS e regolare nuovamente il volume a una concentrazione finale di due volte 10 al sesto linfociti T per millilitro. Co-coltura di 100 microlitri di cellule dendritiche trattate con 100 microlitri di cellule T CD4 positive marcate con CFSE in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e aggiunta di 100 nanogrammi per millilitro di peptide OVA 323-329 alle cellule, misurando l'intensità CFSE delle cellule T mediante citometria a flusso dopo due o tre giorni di incubazione.Le cellule progenitrici del midollo osseo coltivate in terreno completo, in presenza di GM-CSF e IL-4, mostrano una morfologia di cellule dendritiche immature dopo sei giorni di coltura. L'analisi delle cellule dendritiche immature derivate dal midollo osseo del settimo giorno rivela la robusta espressione di CD11c, uno specifico marcatore di cellule dendritiche muvine, da parte della maggior parte delle cellule in coltura. Nonostante la mancanza di effetto sull'espressione dei marcatori di maturazione indotti da LPS, le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo mostrano un profilo di cellule dendritiche tolleranti in risposta al trattamento con CDDO-DFPA, come evidenziato da una significativa riduzione dell'espressione genica pro-infiammatoria e da una maggiore espressione genica delle citochine anti-infiammatorie, anche dopo la stimolazione di LPS.Inoltre, una significativa riduzione della proliferazione singenica delle cellule T specifiche per gli OVA è osservata in co-colture in vitro in cui l'OVA è presentato da cellule dendritiche trattate con CDDO-DFPA e in vivo, come evidenziato da una progressione ritardata verso l'encefalomielite autoimmune sperimentale dopo l'iniezione di cellule dendritiche trattate con CDDO-DFPA pulsate da MOG, confermando ulteriormente il fenotipo tollerogenico di queste cellule. Una volta padroneggiata questa tecnica, le cellule dendritiche tollerogeniche possono essere sviluppate entro otto giorni, se gli esperimenti vengono eseguiti correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le cellule dendritiche tollerogeniche non sono omogenee.Il loro fenotipo cellulare dipende dalla natura degli agenti utilizzati per l'induzione della loro tolleranza. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi dettagliata della citofluorimetria, per rispondere a ulteriori domande sull'energia delle cellule T antigenico-specifiche indotta da cellule dendritiche tollerogeniche o sull'apoptosi o sulla capacità di differenziazione delle cellule T. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare cellule dendritiche tollerogeniche funzionalmente attive utilizzando agenti noti o come testare la capacità di nuove sostanze di indurre queste cellule.

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questo video mostra la procedura per la differenziazione delle cellule dendritiche mieloidi dal midollo osseo dei topi. Isolamento di tibia e femore del mouse, e la lavorazione del midollo osseo sono dimostrati. Immagini che dimostrano morfologia cellulare prima e dopo la differenziazione, e le figure raffiguranti fenotipo delle cellule e IL-12 maturazione di produzione utilizzando i seguenti CpG sono mostrati.

Cultura di cellule dendritiche mieloidi dai precursori del midollo osseo

Presentazione dell'antigene in organi linfatici secondari da parte delle cellule dendritiche è cruciale per l'avvio della cellula T mediata risposta immunitaria adattativa. Qui mostriamo la cultura del midollo osseo derivate le cellule dendritiche murine, di attivazione e di etichettatura per 2-fotoni imaging.

Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l&#39;uso in 2-fotone Imaging

Questo video dimostra la generazione di cellule dendritiche immature, mature e tollerogeniche, o DC, da monociti umani. L'incubazione di monociti con fattori di crescita e citochine porta alla produzione di DC immature. In risposta alle molecole regolatorie immunitarie, le DC immature si differenziano in DC tollerogeniche e mature.

Generazione di cellule dendritiche immature, mature e tollerogeniche da monociti

Questo video mostra un metodo per convertire le cellule dendritiche (DC) in DC tollerogeniche (TolDCs) utilizzando un agente farmacologico immunomodulatore. Questa conversione è confermata dalla valutazione della funzione di TolDC attraverso il loro effetto immunosoppressivo sulle cellule T CD4+.

Effetto di un agente farmacologico immunomodulatore sull'interazione tra cellule dendritiche e cellule T CD4+

Questo protocollo descrive procedure sperimentali per valutare la differenziazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi in placche di Peyer da progenitori comuni cellule dendritiche, utilizzando tecniche che comportano l'isolamento FACS-mediata delle cellule, il trasferimento genico idrodinamico, e analisi del flusso di sottoinsiemi immuni in placche di Peyer.

Valutare lo sviluppo delle cellule murine plasmocitoidi dendritiche in placche del Peyer Utilizzando trasferimento adottivo di ematopoietiche Progenitori

In questo studio presentiamo un sistema di coltura in vitro in grado di generare in modo efficiente  pDC co-coltivando progenitori linfoidi comuni con cellule feeder AC-6 in presenza del ligando Flt3.

In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l&#39;AC-6 Alimentatore Sistema

Esistono sottogruppi distinti di cellule dendritiche come popolazioni rare negli organi linfoidi, e quindi sono difficili da isolare in numero e purezza sufficienti per esperimenti immunologici. Qui descriviamo un metodo ad alta efficienza e ad alta resa per l'isolamento di tutti i principali sottogruppi attualmente noti di cellule dendritiche spleniche di topo.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Le cellule dendritiche immature possono essere differenziate selettivamente in cellule dendritiche tolleranti o mature per regolare l'equilibrio tra immunità e tolleranza. Questo lavoro presenta un mezzo per generare da cellule dendritiche immature derivate da monociti (moDC), moDC in vitro tollerogeniche e mature che differiscono nei fenotipi metabolici.

Generazione di Immaturo, matura e tollerogenico dendritiche cellule con differenti fenotipi metabolica

Qui forniamo un protocollo per lo screening di potenziali fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo di cellule dendritiche (DC) utilizzando la trasduzione lentivirale di shRNA per ottenere linee cellulari di knockdown stabili per la differenziazione DC in vitro .

Studio dello sviluppo delle cellule dendritiche mediante knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in una linea cellulare ematopoietica e progenitrice in vitro

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Descriviamo una procedura per valutare la capacità degli agenti farmacologici di generare cellule dendritiche tollerogeniche da cellule dendritiche naive derivate da monociti in vitro e convalidare la loro potenza mediante la generazione di cellule T regolatorie autologhe.

Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14+ umani

Scopri come sviluppare e caratterizzare cellule dendritiche tollerogeniche murine per la terapia immunologica delle malattie autoimmuni come la sclerosi multipla. Questo protocollo standardizzato facilita la ricerca sulle TolDCs.

Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

Esplora altri video