Sviluppo e caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche murino

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sviluppare e caratterizzare cellule dendritiche tolerogeniche murine per la valutazione della loro utilità immunoterapica nel trattamento di malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della terapia cellulare dendritica tollerogenica, fornendo un metodo standardizzato per lo sviluppo e la caratterizzazione funzionale delle cellule dendritiche tollerogeniche. I principali vantaggi di questa tecnica sono che può essere utilizzata per lo sviluppo di cellule dendritiche tollerogeniche di successo e per i test di efficacia delle cellule dendritiche tollerogeniche funzionali.

Le implicazioni di questa tecnica sono significative. Si estendono allo sviluppo dell'immunoterapia cellulare per le malattie autoimmuni, poiché le cellule dendritiche tollerogeniche possono ripristinare una risposta immunitaria anomala pur rimanendo soggette a meccanismi di regolazione immunitaria intrinseci. Dopo aver raccolto le ossa delle zampe posteriori da topi C57BL/6 di 8-10 settimane, secondo i protocolli standard, utilizzare lame chirurgiche e pinze per sezionare quanto più tessuto possibile e posizionare le tibie e i femori puliti in una piastra di coltura di sei centimetri contenente il 70% di etanolo.

Tagliare entrambe le estremità delle ossa con una lama chirurgica e utilizzare una siringa da tre millilitri, dotata di un ago calibro 23, per lavare il midollo dal primo osso con tre millilitri di PBS in una provetta conica da 15 millilitri. Quando tutto il midollo è stato raccolto, centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi. Dopo cinque minuti, interrompere la lisi con nove millilitri di PBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere il pellet di cellule bianche del midollo osseo in 10 millilitri di terreno di coltura e filtrare le cellule attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una nuova provetta. Regolare le cellule a una concentrazione di una volta per 10 al sesto di cellule per millilitro in terreno di coltura integrato con GM-CSF e IL-4. E piastrate tre millilitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per un'incubazione di tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Il terzo giorno, lavare le cellule in ogni pozzetto con due millilitri di PBS e agitare delicatamente per rimuovere le cellule non aderenti. Quindi nutrire le cellule con tre millilitri di terreno di coltura fresco integrato con GM-CSF e IL-4 e rimettere le cellule nell'incubatore di coltura cellulare, aggiungendo altri tre millilitri di terreno di coltura fresco, integrati con citochine a ciascun pozzetto dopo due giorni. Il settimo giorno di cultura, metti il piatto sul ghiaccio.

Dopo 10 minuti, pipettare delicatamente il terreno di coltura in ciascun pozzetto per rimuovere in sospensione le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo poco aderenti e immature. Quindi, raggruppare le cellule per la raccolta mediante centrifugazione e risospendere il pellet nel volume appropriato di terreno di coltura fresco per la successiva analisi a valle. Per misurare la proliferazione delle cellule T singeniche, utilizzare prima l'estremità posteriore di uno stantuffo da siringa da tre millilitri per schiacciare una milza da un topo OT2 C57BL/6 di 8-10 settimane attraverso un colino cellulare da 40 micrometri e sciacquare il filtro con PBS.

Pellettare la sospensione cellulare raggruppata mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 400 microlitri di tampone di selezione cellulare magnetico e 100 microlitri di cocktail biotina-anticorpo di cellule T CD4 positive a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 300 microlitri di tampone di selezione e 200 microlitri di perle di anti-biotina alle cellule per un'incubazione di 10 minuti e quattro gradi Celsius e posizionare una colonna di microsfere magnetiche e un filtro di pre-separazione in un magnete di separazione cellulare di dimensioni adeguate. Sciacquare la colonna con tre millilitri di tampone di selezione e aggiungere nove millilitri di tampone di cernita alle celle.

Dopo la centrifugazione, risospendere la cella e il pellet in tre millilitri di tampone di selezione e aggiungere la sospensione cellulare alla colonna per raccogliere l'eluato di cellule T CD4 positivo in un contenitore appropriato. Quindi lavare la colonna con altri tre millilitri di tampone di selezione, raccogliendo il flusso e posizionare le cellule T sul ghiaccio. Per l'isolamento delle cellule dendritiche pan spleniche singeniche, posizionare la milza di un topo C57BL/6 di otto-dieci settimane in un piatto di coltura di sei centimetri e utilizzare una siringa da un millilitro, dotata di un ago calibro 25, per iniettare due volte un millilitro di soluzione di collagenasi D nella milza.

Quindi, usa le forbici per tagliare la milza in piccoli pezzi e incubare i pezzi agitandoli a temperatura ambiente per 25 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 500 microlitri di EDTA 0,5 molari all'impasto tissutale per un'incubazione finale di cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, utilizzare l'estremità posteriore di uno stantuffo da siringa da tre millilitri per schiacciare l'impasto della milza attraverso un colino cellulare da 40 micrometri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Risospendere il pellet in 350 microlitri di tampone di selezione delle cellule magnetiche, 50 microlitri di reagente bloccante il recettore Fc e 100 microlitri di cocktail di biotina-anticorpi a cellule pan dendritiche per un'incubazione di 10 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in nove millilitri di tampone di selezione e risospendere il pellet in 800 microlitri di tampone di selezione fresco con 200 microlitri di perle di anti-biotina a quattro gradi Celsius per 10 minuti per l'isolamento della popolazione di cellule dendritiche pan spleniche mediante selezione magnetica delle biglie , come appena dimostrato. Risospendere le cellule a una concentrazione di due volte 10 al quinto dendritico per millilitro e trattarle con l'appropriata concentrazione sperimentale del triterpenoide di interesse per un'ora a 37 gradi Celsius.

Durante l'ultimo terzo dell'incubazione, risospendere le cellule T a una concentrazione di una volta 10-7 cellule per millilitro in un micromolare CFSE per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi lavare le cellule con PBS e regolare nuovamente il volume a una concentrazione finale di due volte 10 al sesto linfociti T per millilitro. Co-coltura di 100 microlitri di cellule dendritiche trattate con 100 microlitri di cellule T CD4 positive marcate con CFSE in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e aggiunta di 100 nanogrammi per millilitro di peptide OVA 323-329 alle cellule, misurando l'intensità CFSE delle cellule T mediante citometria a flusso dopo due o tre giorni di incubazione.

Le cellule progenitrici del midollo osseo coltivate in terreno completo, in presenza di GM-CSF e IL-4, mostrano una morfologia di cellule dendritiche immature dopo sei giorni di coltura. L'analisi delle cellule dendritiche immature derivate dal midollo osseo del settimo giorno rivela la robusta espressione di CD11c, uno specifico marcatore di cellule dendritiche muvine, da parte della maggior parte delle cellule in coltura. Nonostante la mancanza di effetto sull'espressione dei marcatori di maturazione indotti da LPS, le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo mostrano un profilo di cellule dendritiche tolleranti in risposta al trattamento con CDDO-DFPA, come evidenziato da una significativa riduzione dell'espressione genica pro-infiammatoria e da una maggiore espressione genica delle citochine anti-infiammatorie, anche dopo la stimolazione di LPS.

Inoltre, una significativa riduzione della proliferazione singenica delle cellule T specifiche per gli OVA è osservata in co-colture in vitro in cui l'OVA è presentato da cellule dendritiche trattate con CDDO-DFPA e in vivo, come evidenziato da una progressione ritardata verso l'encefalomielite autoimmune sperimentale dopo l'iniezione di cellule dendritiche trattate con CDDO-DFPA pulsate da MOG, confermando ulteriormente il fenotipo tollerogenico di queste cellule. Una volta padroneggiata questa tecnica, le cellule dendritiche tollerogeniche possono essere sviluppate entro otto giorni, se gli esperimenti vengono eseguiti correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che le cellule dendritiche tollerogeniche non sono omogenee.

Il loro fenotipo cellulare dipende dalla natura degli agenti utilizzati per l'induzione della loro tolleranza. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi dettagliata della citofluorimetria, per rispondere a ulteriori domande sull'energia delle cellule T antigenico-specifiche indotta da cellule dendritiche tollerogeniche o sull'apoptosi o sulla capacità di differenziazione delle cellule T. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare cellule dendritiche tollerogeniche funzionalmente attive utilizzando agenti noti o come testare la capacità di nuove sostanze di indurre queste cellule.