Name: Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Scopri l'analisi di complementazione funzionale per studiare l'attività enzimatica nelle vie biochimiche usando cellule batteriche mutanti. Questo metodo valida le funzioni enzimatiche in condizioni fisiologiche in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AOH e MAS riconosce il College of Science e Thomas H. Gosnell School of Life Sciences presso il Rochester Institute of Technology per il supporto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Stati Uniti National Science Foundation (NSF) premio a AOH MCB-1.120.541.

NOTA: Gli autori sono disposti a fornire ceppi batterici e plasmidi ricombinanti per facilitare l&#39;inserimento di analisi complementazione funzionale a scopo didattico per gli individui che sono interessati. I plasmidi che sono stati utilizzati per facilitare esperimenti di complementazione funzionali sono elencati nella Tabella 1. 1. Costruzione di plasmidi per complementazione funzionale <ol><li> Clonazione di Diaminopimelate aminotransferasi (dapL) per complementazione funzionale. <ol><li> Amplificare il quadro di lettura aperto dapL (ORF) dal V. spinoso e cDNAs da A. thaliana e C. reinhardtii mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei 4 deossinucleotidi trifosfati, e 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di pfxDNA polimerasi. NOTA: La descrizione completa di pertinenza della clonazione ricombinante di tre ortologhi dapL dalla pianta A. thaliana (A -dapL), il batterio Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) e l&#39;alga Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) è stato pubblicato in precedenza. 2,18-20 NOTA: I primer utilizzati per la clonazione degli ortologhi dapL sono i seguenti: Vs dapL F- 5&#39;-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 &#39; Vs dapL R 5&#39;- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 &#39; A dapL F- 5&#39;-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 &#39; A dapL R-5&#39;-GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 &#39; Cr dapL F-5&#39;-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 &#39; Cr dapL R -5&#39;- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 &#39; </li><li> Clonare i frammenti di PCR in tegli plasmid pET30A per produrre i plasmidi ricombinanti, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: Al dapL e pET30A :: Cr dapL utilizzando i primer, enzimi di restrizione e ligasi T4 DNA. <ol><li> In breve, incubare 50 ng di inserimento e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 50 mg / ml -1 kanamicina incubando a 37 ° C per 24 ore. 18-20 </li></ol></li><li> Per creare il plasmide per complementazione funzionale, digerire pET30A :: Vs dapL e pET30A :: A plasmidi dapL con gli enzimi di restrizione XbaI e Sali e XbaI e HindIII per la pET30A :: Cr dapL. Legare gli inserti nelle pBAD33 plasmide utilizzando ligasi T4 DNA per produrre i plasmidi pBAD33 :: Vs dapL; pBAD33 :: Al dapL e pBAD33 :: Cr dapL. <ol><li> Incubare 50 ng di inserimento e 20 ngdel vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 34 mg / ml -1 kanamicina incubando 37 ° C per 24 ore. 20 </li></ol></li></ol></li><li> Clonazione di tirosina aminotransferasi (tyrB) da A. thaliana per complementazione funzionale. NOTA: I dettagli completi per quanto riguarda la clonazione del cDNA da A. thaliana annotato dai tag locus At5g36160 è stata descritta in precedenza. 4 <ol><li> Amplificare il cDNA mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, e 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi pfx DNA. NOTA: I primer utilizzati per la cldicazioni del At5g36160 sono i seguenti: A tyrB F- 5&#39;-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 &#39; AttyrB R- 5&#39;-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 &#39; </li><li> Clonare il frammento nel pET30A plasmide per produrre i plasmidi ricombinanti pET30A :: At5g36160 digerendo il frammento PCR con EcoR1 e SAL1; legare nel frammento in pET30A usando T4 DNA ligasi, come descritto di seguito. 4 </li><li> Per creare il plasmide complementazione funzionale, digerire il pET30A :: At5g36160 con gli enzimi di restrizione XbaI e HindIII, e legare l&#39;inserto in pBAD33 utilizzando gli stessi siti di enzimi di restrizione per produrre il plasmide ricombinante pBAD33 :: At5g3160 utilizzando ligasi T4 DNA. <ol><li> Incubare 50 ng di inserimento e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasformare la legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 34 mg / ml chlo -1ramphenicol incubando 37 ° C per 24 ore. 4 </li></ol></li></ol></li><li> Clonazione di UDP N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (Mure) da V. spinoso per complementazione funzionale. NOTA: La clonazione del Mure ORF da V. spinoso è stato descritto in precedenza. 18 <ol><li> Amplificare l&#39;open reading frame mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi pfx DNA. Poi clonare nel plasmide pET100D per produrre il plasmide pET100D :: Vs Mure. NOTA: I primer utilizzati per la clonazione del Vs Mure sono i seguenti: Vs Mure F- 5&#39;- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 &#39; vsMure R- 5&#39;-GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 &#39; </li><li> Per produrre il plasmide per complementazione funzionale, digerire il pET100D :: Vs Mure Con gli enzimi di restrizione XbaI e SAL1 e legare l&#39;inserto in pBAD33 per produrre il plasmide ricombinante pBAD33 :: Vs Mure utilizzando ligasi T4 DNA. <ol><li> Incubare 50 ng dell&#39;inserto e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x, insieme con 1 unità di T4 DNA ligasi, per una notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB addizionato con cloramfenicolo -1 34 mg / ml incubando 37 ° C per 24 ore. 8 </li></ol></li></ol></li><li> Clonazione di RelA / s pot (rsh) dal Novosphingobium sp per complementazione funzionale. NOTA:. La clonazione del rsh da Novosphingobium sp è stato descritto in precedenza 17. <ol><li> Amplificare la ORF rsh, oltre a 599 nucleotidi upstrisma di sito di inizio apertura e 46 nucleotidi a valle del sito di terminazione mediante PCR. Utilizzare 1 ciclo a 94 ° C per 2 min, seguiti da 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min. Include 12 pmoli di ciascun primer, 1 mM MgSO 4, 0,5 mM ciascuno dei quattro deossinucleotidi trifosfati, 0,5 ng di DNA stampo e 1 unità di polimerasi Taq DNA. Poi clonare nel plasmide pCR2.1 per produrre pCR2.1 :: Nsp rsh. <ol><li> Incubare 1 ml di amplificato frammento di PCR, 1 ml di pCR2.1 vettore, 1 ml di soluzione di sale e 1 ml di acqua. Incubare a 25 ° C per 5 minuti e 2 ml di legatura in E. coli, e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 50 mg / ml -1 kanamicina incubando 37 ° C per 24 ore. NOTA: I primer utilizzati per la clonazione del rsh sono i seguenti: rsh F- 5&#39;-GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 &#39; rsh R- 5&#39;-GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 &#39; </li><li> Per complementazione funzionale, digerire il plasmide pCR2.1 :: Nsp rsh con EcoR1 e legare l&#39;inserto nella vasta gamma di ospiti pRK290 per produrre il plasmide ricombinante pRK290 :: Nsp RSH utilizzando ligasi T4 DNA. <ol><li> Incubare 50 ng di inserimento e 20 ng del vettore in tampone ligasi 1x e 1 unità di T4 DNA ligasi durante la notte a 17 ° C. Trasforma legatura in E. cellule coli Dh5α e lo schermo per le colonie su piastre LB integrato con 10 mg / ml di tetraciclina -1 incubando 37 ° C per 24 ore. 17 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparazione di cellule batteriche Electro-competenti per facilitare la trasformazione NOTA: La preparazione di cellule elettro-competenti si basa sul protocollo 26 per 1,0 L di coltura che può essere ridotta a un volume più piccolo (cioè 250 ml). Si prega di notare che questo protocollo può be usato per fare tutti i ceppi che competenti descritti in questo manoscritto per facilitare FCA. 22 <ol><li> Seminare 50 ml di terreno liquido con una singola colonia in un pallone e crescere durante la notte, avendo cura di controllare il genotipo mutante prima di iniziare questo passaggio (Tabella 2). </li><li> Il secondo giorno, inoculare 1.0 L del mezzo appropriato (LB per E. coli mutanti e PD per Novosphingobium sp) con l&#39;50 ml della cultura durante la notte, e crescere per un OD 600 di 0,4-0,6 (fase log) a 30 ° C. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 5.000 xg per 15 min a 4 ° C, decantare il surnatante, e risospendere il pellet in 500 ml di sterile ghiacciata puro H 2 O. </li><li> Centrifugare le cellule a 5.000 xg per 20 min a 4 ° C, decantare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di sterile ghiacciata 10% glicerolo. </li><li> Centrifugare le cellule a 5.000 xg per 20 min a 4 ° C, decantare il supernatant, e risospendere il pellet in 2,0 ml di 10% glicerolo. </li><li> Aliquotare cellule trasferendo 50 microlitri in tubi micro-centrifuga e subito congelamento ponendo i tubi in un bagno di ghiaccio secco-etanolo. Conservare le cellule competenti a -80 ° C per elettroporazione. </li></ol> 3. elettroporazione di cellule batteriche con complementazione Plasmidi <ol><li> Per elettroporazione, aggiungere 1,0 microlitri (10-50 ng) del plasmide ricombinante ad una aliquota (50 ml) di cellule competenti e posto in ghiaccio per 5 min. </li><li> Trasferire la miscela tramite pipettamento a un cuvetta elettroporazione e impostare l&#39;apparato elettroporazione per la seguente impostazione: 25 uF capacità, 2,5 kV e 200 ohm resistenza e fornire un impulso. </li><li> Aggiungere 1,0 ml di supporti di ripristino (LB) alla cuvetta elettroporazione e trasferire con una pipetta ad un tubo da 15 ml. Recuperare con rotazione dolce per 60 minuti in un incubatore agitazione. </li><li> Piastra 100 ml di cultura dal recomolto passo sulle piastre di agar per selezionare per trasformanti pipettando e diffusione utilizzando una spatola sterile. NOTA: Assicurarsi di controllare Tabella 1 e Tabella 2 prima di iniziare questo passaggio per controllare i antibiotici e genotipi per rendere le piastre di agar corretto. </li></ol> 4. Trasformazione di AOH1 per Facilitare complementazione funzionale utilizzando L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) <ol><li> Per l&#39;analisi complementazione, trasformare AOH1 con il vettore vuoto (pBAD33), e con i vettori di espressione DapL in eventi di trasformazione separati utilizzando il protocollo di elettroporazione descritto nel paragrafo 3.0. </li><li> Selezionare trasformanti da placcatura su agar LB integrato con 50 mg / ml -1 DAP e 34 ug / ml cloramfenicolo -1 e 50 mg / ml -1 kanamicina. </li><li> Test per complementazione funzionale da colonie replica-placcatura strisciando su LB medium con 0.2% (w / v) arabinosio con e senza 50 ug / ml -1 DAP e 34 ug / ml -1 kanamicina. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° C per 24 ore e osservare i risultati. NOTA: Il risultato dovrebbe mostrare che il mutante è solo in grado di crescere su DAP supporto libero solo quando il gene è espresso dapL in background mutante rispetto al vettore unico controllo. </li></ol> 5. Trasformazione di TKL-11 a Facilitare complementazione funzionale utilizzando meso UDP N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamil-2,6- -diaminopimelate ligasi (Mure) <ol><li> Trasformare il mutante con il vettore vuoto (pBAD33) e con il vettore che esprime Mure (pBAD33 :: VsmurE) utilizzando il protocollo descritto nel paragrafo 3.0. </li><li> E selezionandone trasformanti su terreno LB agar integrato con 50 mg / ml timina -1 e 34 ug / ml -1 cloramfenicolo e incubare le piastre a 30 ° C per 24 ore. </li><li> Test per complementazione strisciando o placcatura colonie sia dal controllo e le trasformazioni sperimentali su due terreno LB più 0.2% (w / v) arabinosio e 50 ug / ml timina -1. </li><li> Incubare una piastra a 30 ° C e l&#39;altro a 42 ° C per 24 ore per valutare visivamente il fenotipo di crescita. NOTA: I risultati dovrebbero mostrare che il mutante è in grado di crescere a 42 ° C solo quando il gene è espresso Mure in background mutante rispetto al vettore unico controllo. </li></ol> 6. Trasformazione di DL39 per Facilitare complementazione funzionale utilizzando tirosina aminotransferasi (tyrB) <ol><li> Trasforma DL39 sia con pBAD33 o pBAD33 :: At5g36160, e selezionare trasformanti su piastre di agar LB integrato con 50 mg / ml tirosina -1, 50 mg / ml fenilalanina -1, e 34 mg / ml cloramfenicolo -1 utilizzando il protocollo descritto nella sezione 3.0. </li><li> Replicacolonie plate su terreno minimo (M9) con 50 mg / ml fenilalanina -1 e 50 mg / ml -1 tirosina, 50 mg / ml -1 aspartato, 50 mg / ml leucina -1, 50 mg / ml -1 valina, 50 ug / ml isoleucina -1, 10 ug / ml -1 uracile 0,5% (w / v) glicerolo, 0,2% (w / v) arabinosio. Anche colonie replica-piastra su piastre prive di fenilalanina e tirosina strisciando la stessa colonia di entrambe le piastre. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° C per 48 ore per osservare la crescita fenotipo. NOTA: Il risultato dovrebbe mostrare che il mutante è solo in grado di crescere su fenilalanina e tirosina media liberi, solo quando il gene è espresso tyrB in background mutante rispetto al vettore unico controllo. </li></ol> 7. Trasformazione di Hx699 per Facilitare complementazione funzionale del Hypomucoid fenotipo di Novosphingobium sp. Strain Hx699 </p&gt; <ol><li> Transform ceppo selvatico Novosphingobium sp. (Rr2-17) e il mutante Hx699 con pRK290 e pRK290 :: rsh Nsp in 2 eventi di trasformazione separati utilizzando il protocollo di trasformazione delineato nel paragrafo 3.0. </li><li> Piastra le trasformazioni di destrosio di patata (PD) agar integrato con 10 mg / ml -1 tetraciclina, e incubare per almeno 24 ore o fino a quando appaiono trasformanti. </li><li> Consecutive sia trasformazioni in un modello &quot;X&quot; su piastre di agar PD freschi e incubare a 30 ° C per almeno 4 giorni. Osservare i fenotipi di solo il vettore, ed esperimento esaminando visivamente il fenotipo di crescita di entrambe le piastre. NOTA: Il risultato dovrebbe mostrare che il fenotipo ipo-mucoide è completata quando rsh è espressa in background mutante rispetto al vettore unico controllo. </li></ol>

<ol><li>Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Candida+albicans+gene+for+orotidine-5%27-phosphate+decarboxylase+by+complementation+of+S.+cerevisiae+ura3+and+E.+coli+pyrF+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations.</a> Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).</li>
<li>Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+L%2CL-diaminopimelate+aminotransferase+defines+a+novel+variant+of+the+lysine+biosynthesis+pathway+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants.</a> Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).</li>
<li>Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJander%2C+G+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).</li>
<li>Prabhu, P., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+partial+characterization+of+an+L-Tyrosine+aminotransferase+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Research+International%22%5BJournal%5D)">Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana.</a> Biochemistry Research International. , 549572(2010).</li>
<li>Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+pathogenic+bacteria+in+molecular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).</li>
<li>McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+Characterization+of+UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate%3A+meso-2%2C6-diaminopimelate+ligase+%28MurE%29+from+Verrucomicrobium+spinosum+DSM+4136T%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T.</a> PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).</li>
<li>Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lysine+biosynthesis%3A+an+evolving+antibiotic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy.</a> Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).</li>
<li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28p%29ppGpp%3A+still+magical%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">(p)ppGpp: still magical.</a> Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).</li>
<li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+Conjures+Bacterial+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).</li>
<li>Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella+typhimurium%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Chatterji, D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+stringent+response%2C+ppGpp+and+starvation+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).</li>
<li>Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp%3A+stringent+response+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">ppGpp: stringent response and survival.</a> J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).</li>
<li>Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-UV+stress+in+Salmonella+typhimurium%3A+4-thiouridine+in+tRNA%2C+ppGpp%2C+and+pppGpp+as+components+of+an+adaptive+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response.</a> J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).</li>
<li>Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).</li>
<li>Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+alarms+and+cell+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).</li>
<li>Mittenhuber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+evolution+of+genes+encoding+bacterial+%28p%29+ppGpp+synthetases%2Fhydrolases+%28the+Rel%2C+RelA%2C+and+SpoT+proteins%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins).</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).</li>
<li>Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+rsh+Gene+from+a+Novosphingobium+sp.+Necessary+for+Quorum-Sensing+Signal+Accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation.</a> J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).</li>
<li>Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+biochemical+analysis+of+the+diaminopimelate+and+lysine+biosynthesis+pathway+in+Verrucomicrobium+spinosum%3A+Identification+and+partial+characterization+of+L%2CL-diaminopimelate+aminotransferase+and+UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2%2C6-meso-diaminopimelate+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase.</a> Front. Microbiol. 3, 183(2012).</li>
<li>Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+L%2CL-diaminopimelate+aminotransferase+%28DapL%29+from+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii.</a> Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).</li>
<li>Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L%2CL-Diaminopimelate+Aminotransferase+from+Chlamydomonas+reinhardtii%3A+A+Target+for+Algaecide+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development.</a> PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).</li>
<li>Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+pBAD+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular Cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+mutants+of+Escherichia+coli+K-12+with+low+activity+of+the+diaminopimelic+acid+adding+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme.</a> J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).</li>
<li>Mavrides, C., Orr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispecific+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli.</a> J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).</li>
<li>Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+mutants+deficient+in+the+aspartate+and+aromatic+amino+acid+aminotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases.</a> J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).</li>
<li>Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multispecific+quintet+of+aromatic+aminotransferases+that+overlap+different+biochemical+pathways+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).</li>
<li>Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+stringent+response+in+the+essential+function+if+the+conserved+bacterial+G+protein+CgtA+in+Vibrio+cholera%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).</li>
<li>Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+host+range+DNA+cloning+system+for+Gram-negative+bacteria%3A+construction+of+a+gene+bank+of+Rhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).</li>
<li>Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enzymatic+characterization+of+a+novel+%CE%B2-1%2C6-glucosidase+from+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae.</a> J Biosci Bioeng. , (2015).</li>
<li>Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+role+for+ALD1+in+activation+of+local+and+systemic+defenses+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis.</a> Plant J. 40, 200-212 (2004).</li>
<li>Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Celuular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Automatic prediction of protein function.</a> Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).</li>
<li>Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+the+Arabidopsis+pds1+mutation+with+the+gene+encoding+p-Hyrdoxyphenylpyruvate+dioxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase.</a> Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).</li>
<li>Mohler, W. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+cell+fusion+analyzed+by+lacZ+complementation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Molti dei corsi che sono parte integrante del Biotecnologie e Bioscienze molecolare curriculum presso il Rochester Institute of Technology hanno una componente di laboratorio in aggiunta alla quota lezione del corso. Il piano di studi per l&#39;anno accademico 2014-2015 contiene un totale di 48 corsi, 29 dei quali contengono una componente di laboratorio che rappresentano circa il 60%. Un tale corso è Fondamenti di piante Biochimica e Patologia (FPBP), una conferenza / corso di laboratorio miscelati e Bioseparations: pr...

complementazione funzionale nel contesto di chiarire la funzione (s) / ruolo (s) di un gene viene definita come la capacità di un particolare omologo o gene orthologous ripristinare un particolare mutante con un fenotipo osservabile allo stato wild-type quando l&#39;omologa o gene orthologous è introdotto in cis o trans in secondo piano mutante. Questa tecnica è stata ampiamente usata per isolare e identificare la funzione (s) / ruolo (s) di molti geni. Un esempio particolare è l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di orotidina-5-fosfato decarbossilasi da Candida albicans utilizzando il mutante URA3 di S. cerevisiae e il mutante pyrF di E. coli. 1 Gli autori hanno usato questa tecnica per chiarire la funzione dei geni che sono coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta rigorosi nei loro programmi di ricerca e hanno incorporato questa tecnica nei loro programmi di insegnamento in Biotechnology e Bioscience Molecolare (BMB) programma al Rochester Institute of Technology (RIT). Gli autori insegnano Fondamenti di Biochimica delle piante / Pathology (FPBP) (Hudson) e Bioseparations: principi e le pratiche (BPP) (Hudson / Savka), due corsi di base di divisione superiore di laboratorio elettiva nel programma BMB al RIT. Dal momento che alcuni degli argomenti che vengono discussi nei corsi sono affiliati con i loro interessi di ricerca, gli autori hanno incorporato molte delle tecniche e strumenti sperimentali che vengono utilizzati nei rispettivi programmi di ricerca in questi due corsi di laboratorio-based. Un esempio è complementazione funzionale come un esercizio di laboratorio per rinforzare i materiali delle lezioni relative al metabolismo degli aminoacidi da piante, peptidoglicano e la stringente metabolismo risposta da batteri. Tre dei percorsi di aminoacidi dalle piante che sono discussi nel corso FPBB sono quello della lisina (LYS), la tirosina(Tyr) e fenilalanina (phe). Il percorso lys è evidenziata in corso per l&#39;importanza degli aminoacidi come un amminoacido essenziale per tutti gli animali in particolare gli esseri umani poiché gli animali non hanno la macchina genetica di sintetizzare lys de novo. Inoltre, è stato recentemente scoperto che le piante utilizzano un percorso per la sintesi di lys che è significativamente diversa da quella dei batteri. Questa scoperta è stata parzialmente facilitato da complementazione funzionale del E. coli diaminopimelate (DAP) mutanti utilizzando un gene che codifica l&#39;enzima L, L-diaminopimelate aminotransferasi (DapL) dalla pianta modello Arabidopsis thaliana. 2 I percorsi varianti per la sintesi del lys attraverso la diaminopimelate intermedi sono mostrati in Figura 1. Oltre , la sintesi di lys facilita attraverso l&#39;aspartato derivato famiglia di amminoacidi che è altamente regolata. 3 Oltre alla loro importanza in synt proteineESI, i percorsi per tyr e phe sono evidenziate data la loro importanza nel servire come composti precursori per l&#39;anabolismo di composti fenilpropanoidi prevede la sintesi di composti difesa delle piante quali:. alcaloidi, lignine, flavonoidi, isoflavoni, acido idrossicinnamico tra gli altri 4 Il tyr e percorsi phe sono state evidenziate anche per mostrare la differenza tra l&#39;impianto e percorsi di anabolizzanti batteriche. Nei batteri, l&#39;aminotransferasi tirosina (TyrB) è coinvolto nella anabolismo dei due amminoacidi, che nelle piante, l&#39;enzima è principalmente coinvolto nel catabolismo di tyr e phe e non è coinvolta nella anabolismo di questi aminoacidi. (Figura 2). 4 Le differenze tra Gram positivi e Gram negativi per quanto riguarda la struttura del peptidoglicano (PG) sono evidenziati nel corso FPBP. Il PG dei batteri Gram negativi è di interesse rispetto patologia vegetale in base al fatto che la maggior partepatogeni delle piante sono Gram negativi. Una recente revisione per quanto riguarda i primi 10 batteriche fito-patogeni ha rivelato che tutti sono Gram-negativi. I batteri erano dalla generi:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya e Pectobacterium 5 Una delle differenze chimiche confrontando lo stelo PG di batteri Gram positivi negativi e Gram è la differenza tra la reticolazione amminico acidi di entrambi i tipi. Il primo scatto di tale diverso reticolazione PG si verifica nella fase citoplasmatica di PG anabolismo ed è facilitata dall&#39;enzima UDP N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (mûre) (Figura 3A). Mure catalizza l&#39;aggiunta di un particolare composto diammina in terza posizione dell&#39;asta peptide. 6 Nella maggior parte dei batteri Gram negativi, i lys penultimo precursore, meso -diaminopimelate ( <em&gt; m -DAP) funge reticolazione aminoacidi e lys serve lo stesso ruolo nel PG della maggior parte dei batteri Gram-positivi (Figura 3B). 7 Questo è dovuto al fatto che sia m -DAP e lys possiedono due ammina gruppi e sono in grado di formare due legami peptidici per stelo peptide cross-linking. Nei Bioseparations: Principles and Practices corso (BPP), le differenze tra i sistemi aperti e chiusi per la coltivazione di batteri e come nutriente livelli cambierà in modo significativo in entrambi i sistemi a causa di cambiamenti ambientali sono discussi. Questi eventi sono legati a cambiamenti normativi chiamato &quot;spostamento verso il basso&quot; o &quot;Shift up&quot; attivati ​​da fame o un adeguato apporto di aminoacidi o di energia. La risposta &quot;scalare&quot; può verificarsi quando una coltura batterica viene trasferito da un supporto ricco e complesso ad un mezzo chimicamente definito con una singola fonte di carbonio. Questo cambiamento nell&#39;ambiente porta alla rapida Cessazione della sintesi tRNA e rRNA. Questa cessazione comporta la mancanza di ribosomi, proteine ​​e la sintesi del DNA, anche se la biosintesi degli amminoacidi sono upregulated. Dopo la risposta &quot;scalare&quot;, i ribosomi esistenti siano utilizzati per produrre nuovi enzimi per sintetizzare gli amminoacidi non disponibili a medio o ambiente. Dopo un periodo di tempo, la sintesi rRNA e nuovi ribosomi sono assemblati e la popolazione di cellule batteriche comincia a crescere anche se ad un tasso ridotto. Il corso degli eventi è denominata &quot;risposta stringente&quot; o &quot;controllo rigoroso&quot; ed è un esempio di regolazione cellulare globale e può essere pensato come un meccanismo per la regolazione macchine biosintetica della cellula per compensare la disponibilità dei substrati necessari e fabbisogno energetico . 8 la risposta rigorosa consente quindi di batteri di rispondere rapidamente ai flussi di nutrienti nell&#39;ambiente e contribuisce e ENHANCES la capacità dei batteri di competere in ambienti che possono cambiare rapidamente quanto riguarda nutrienti eo disponibilità di substrato. 8-9 La risposta stringente ha un ruolo fondamentale nel espressione genica quando la disponibilità di aminoacidi, carbonio, azoto, fosfato e acidi grassi sono limitati. 8,10-14 Questa risposta stringente è coordinata da due nucleotidi, guanosina tetrafosfato (ppGpp) e guanosina pentafosfato (pppGpp) comunemente indicata insieme come il alarmone (p) ppGpp. Ad esempio, quando gli amminoacidi sono limitati-che può portare ad un collo di bottiglia di proteine ​​sintesi-la alarmone, guanosina 3,5- (bis) pirofosfato (ppGpp), derivato da anabolismo di guanosina difosfato 3-5-trifosfato (pppGpp) accumula nella cella. La variazione del livello di (p) ppGpp è coinvolto nella espressione dei geni che regolano la risposta a superare la mancanza di substrati per l&#39;ambiente che sono direttamente coinvolti nella crescita cellulare e SVILUPPOt. Due dei geni che sono coinvolti in questo processo sono chiamati RELA e Spot. RelA è un (p) ppGpp sintetasi ribosoma-associata che è coinvolto nella risposta all&#39;accumulo di tRNA caricate che è il risultato di limitazione aminoacidi. funzioni di punto come un bifunzionale (p) ppGpp sintetasi e idrolasi. L&#39;attività sintetasi di spot è coinvolto nella risposta alla mancanza di carbonio e acido grasso inedia. 8 Le omologhi RelA / SPOT sono diffusi nelle piante e batteri e sono indicati come Rsh per R ELA / S pot h omologs. 8,10 -12,16 un recente manoscritto dimostrato che vi è una specifica proteina Rsh coinvolto nella sintesi di questi alarmones dal batterio Novosphingobium sp Rr 2-17. 17 Qui vi presentiamo quattro vie biochimiche impastoiati ai saggi di complementazione funzionale. I saggi di complementazione delineati in questo manoscritto fornisce una strada per explminerale di impiegare questo test in vivo come un mezzo per identificare e caratterizzare o enzimi che sono previsti ad avere funzione sconosciuta / putativa (s) o come strumenti didattici per integrare l&#39;insegnamento di vie biochimiche.

<table><tbody><tr><td>E. coli mutanti</td><td>Hudson/Savka lab o CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)Electroporator</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Biorad-USA</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione</td><td>Biorad-USA</td><td>1652082</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a temperatura controllata</td><td>Microcentrifuga Generica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Agar</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Luria Brodo</td><td>Thermofisher Scientific 12795084</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63011</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio di Patate Medium</td><td>Fisher Scientfic&nbsp;</td><td>DF0013-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1377</td><td></td></tr><tr><td>Diaminopimelato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92591</td><td></td></tr><tr><td>Timina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>Aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Gylcerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10342-020</td><td></td></tr><tr><td>Platino pfx DNA polimerasi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11708-013</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15224-041</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Dh5-alfa</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>E. coli Top10</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C4040-03</td><td></td></tr><tr><td>pET100D/vettore topografico</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific K100-01</td><td></td></tr><tr><td>pCR2.1 Vettore</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>K2030-01</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi funzionale complementazione (fca): un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche pathways

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Saggio complementazione funzionale (FCA) è un test in vivo che è ampiamente utilizzato per chiarire la funzione / ruolo dei geni / enzimi. Questa tecnica è molto comune in biochimica, genetica e molte altre discipline. Una panoramica completa della tecnica per integrare l&#39;insegnamento delle vie biochimiche inerenti agli aminoacidi, peptidoglicano e la risposta stringente batterica è riportato in questo manoscritto. Due cDNAs dalla pianta modello thaliana organismo Arabidopsis che sono coinvolti nel metabolismo della lisina (L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) e tirosina aminotransferasi (tyrB) coinvolti nel metabolismo di tirosina e fenilalanina sono evidenziate. Inoltre, il peptidoglicano batterico pathway anabolizzante è evidenziato attraverso l&#39;analisi del -acetylmuramoyl-L-alanil-D-acido glutammico meso ligasi -2,6-diaminopimelate (MURE) gene UDP N dal batterio Verrucomicrobium spinosum coinvolti nella croce-libreria di peptidoglicano. La risposta stringente batterica è riportato anche attraverso l&#39;analisi del rsh (R ELA / s pot h Omolog) gene bifunzionale responsabile di un fenotipo iper-mucoide nel sp batterio Novosphingobium. Quattro esempi di FCA sono presentati. Nel video si concentrerà su tre di loro, vale a dire lisina, peptidoglicano e la risposta stringente.

I ceppi batterici che sono impiegati nelle varie analisi di complementazione funzionali sono riportati in Tabella 2. Analisi Funzionale complementazione: L, L-diaminopimelate aminotransferasi (dapL) Il E. coli doppio mutante AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) ospita una mutazione nel gene Dape e una delezione completa del gene D...

La convalida delle attività enzimatiche coinvolte in processi biochimici può essere chiarita utilizzando l&#39;analisi complementazione funzionale (FCA). Descritto in questo manoscritto è il saggio FCA dimostrare l&#39;attività enzimatica degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli amminoacidi, risposta stringente batterica e batterica biosintesi peptidoglicano.

Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

L'obiettivo generale del saggio di complementazione funzionale è chiarire l'attività di un enzima introducendo una copia funzionale del gene corrispondente in una cellula mutante per vedere se ripristina un fenotipo di tipo selvatico nel background mutante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in una varietà di campi, come la biochimica, la microbiologia, la genetica, la biologia vegetale, l'evoluzione e altri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che valuta la funzione, l'attività e/o il ruolo di un enzima, in condizioni in vivo, che sono normalmente di natura fisiologica, al contrario delle condizioni in vitro, che sono normalmente di natura artificiale.Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'identificazione e/o alla delucidazione della funzione di enzimi non caratterizzati e di quelli che hanno ancora funzioni putative o predette. A dimostrare questa procedura di complementazione funzionale è Taylor Harkness, laureato in biotecnologie e bioscienze molecolari, uno studente del mio laboratorio. Dopo il clonaggio dei geni DapL, TarB, MurE e RSH secondo il protocollo di testo, inoculare 50 millilitri di terreno liquido con una singola colonia di

functional-complementation-analysis-fca-laboratory-exercise-designed

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Noi applichiamo un'etichetta priva di analisi di interazioni proteina utilizzando X100 Biacore per la struttura-funzione di analisi del legame di mutanti diversi cistatina B di papaina attraverso la caratterizzazione cinetica. Calibrazione senza analisi concentrazione (ACCP) misura la concentrazione di proteine ​​con attività di legame mantenuto senza la necessità di una curva standard. Abbiamo dimostrato che la conferma delle concentrazioni utilizzando ACCP aumenta l'affidabilità delle analisi...

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

La localizzazione subcellulare delle proteine ​​è importante nel determinare la regolazione spazio-temporale di segnalazione cellulare. Qui, descriviamo biomolecolare complementazione fluorescenza (BiFC) come un metodo semplice per il monitoraggio delle interazioni spaziali delle proteine ​​all'interno della cellula.

Bimolecolari complementazione fluorescenza

Abbiamo sviluppato una tecnica per testare interazioni proteina-proteina in pianta. Una proteina fluorescente gialla (YFP) è divisa in due frammenti non si sovrappongono. Ogni frammento viene clonato in-frame ad un gene di interesse attraverso il sistema Gateway, consentendo l'espressione di proteine ​​di fusione. Ricostituzione del segnale YFP si verifica solo quando le proteine ​​interagiscono inchiesta.

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

13 C-isotopo etichettatura è una tecnica utile per determinare il metabolismo cellula centrale per vari tipi di microrganismi. Dopo che le cellule sono state coltivate con un substrato specifico etichettato, GC-MS di misurazione in grado di rivelare vie metaboliche funzionali basati su modelli di etichettatura unico nel proteinogenici aminoacidi.

Percorso di conferma metaboliche e scoperta attraverso 13 C-etichettatura dei proteinogenici Aminoacidi

Fitness Quantitative Analysis (QFA) è una serie complementare di metodi sperimentali e computazionali per la stima convenienze coltura microbica. QFA stima l'effetto di mutazioni genetiche, farmaci o altri trattamenti applicati sulla crescita microbica. Esperimenti di scala dall'analisi focalizzata di singole culture a migliaia di colture in parallelo possono essere progettati.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Sistematiche e su larga scala di sintesi genetica (gene-gene o epistasi) schermi di interazione può essere utilizzato per esplorare la ridondanza genetica e via di cross-talk. Qui, descriviamo un high-throughput quantitativa sintetica genetica tecnologia di retinatura array, definito eSGA che abbiamo sviluppato per chiarire i rapporti epistatiche ed esplorare reti di interazione genetici...

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

L'analisi citofluorimetrica di bimolecular complementazione fluorescenza fornisce un alto metodo quantitativo di throughput per studiare l'interazione proteina-proteina. Questa metodologia può essere applicata a siti di legame della proteina di mappatura e per lo screening di fattori che regolano l'interazione proteina-proteina.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Le proteine interagiscono tra loro e queste interazioni determinano in gran parte le loro funzioni. I partner di interazione proteica possono essere identificati ad alto rendimento in vivo utilizzando un saggio di fitness del lievito basato sul saggio di complementazione del frammento proteico diidrofolato reduttasi (DHFR-PCA).

Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

L'espressione e la purificazione delle proteine contenenti idrolasi fumarylacetoacetate sono descritte con esempi (espressione in E. coli, FPLC). Le proteine purificate sono utilizzate per la cristallizzazione e la produzione di anticorpi e impiegate per i saggi enzimatici. Vengono presentati alcuni saggi fotometrici per mostrare la multifunzionalità di FAHD1 come oxaloacetate decarboxylase e idrolasi acylpyruvate.

Espressione, purificazione, cristallizzazione e saggi enzimatici di Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Parti genetiche ben caratterizzate sono necessarie per la progettazione di nuovi circuiti genetici. Qui descriviamo un metodo economico e ad alto rendimento per caratterizzare rapidamente le parti genetiche. Il nostro metodo riduce costi e tempi combinando lisati privi di cellule, DNA lineare per evitare la clonazione e manipolazione acustica dei liquidi per aumentare la produttività e ridurre i volumi di reazione.

Caratterizzazione rapida di parti genetiche con sistemi cell-free

Un modulo di clonazione molecolare adattabile di Gibson Assembly è stato impiegato in un formato di esperienza di ricerca universitaria (CURE) basato su corsi per studenti di laboratori di biologia molecolare. La valutazione dei risultati di apprendimento degli studenti ha mostrato una migliore comprensione e fiducia nella clonazione molecolare dopo il completamento del CURE e nuovi plasmidi sono stati clonati per la ricerca sulla biosintesi di prodotti naturali.

Migliorare i risultati degli studenti con un'esperienza di ricerca universitaria basata su corsi di clonazione molecolare adattabile

Scopri l'analisi di complementazione funzionale per studiare l'attività enzimatica nelle vie biochimiche usando cellule batteriche mutanti. Questo metodo valida le funzioni enzimatiche in condizioni fisiologiche in vivo.

Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways (Video) | JoVE Journal

Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways

Esplora altri video