Analisi Funzionale complementazione (FCA): Un esercizio laboratorio progettato e realizzato per integrare la didattica di biochimiche Pathways

L'obiettivo generale del saggio di complementazione funzionale è chiarire l'attività di un enzima introducendo una copia funzionale del gene corrispondente in una cellula mutante per vedere se ripristina un fenotipo di tipo selvatico nel background mutante. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in una varietà di campi, come la biochimica, la microbiologia, la genetica, la biologia vegetale, l'evoluzione e altri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che valuta la funzione, l'attività e/o il ruolo di un enzima, in condizioni in vivo, che sono normalmente di natura fisiologica, al contrario delle condizioni in vitro, che sono normalmente di natura artificiale.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'identificazione e/o alla delucidazione della funzione di enzimi non caratterizzati e di quelli che hanno ancora funzioni putative o predette. A dimostrare questa procedura di complementazione funzionale è Taylor Harkness, laureato in biotecnologie e bioscienze molecolari, uno studente del mio laboratorio. Dopo il clonaggio dei geni DapL, TarB, MurE e RSH secondo il protocollo di testo, inoculare 50 millilitri di terreno liquido con una singola colonia di cellule batteriche mutanti da trasformare con un gene di interesse e crescere durante la notte.

Il secondo giorno, utilizzare la coltura notturna da 50 millilitri per inoculare 1 litro del terreno appropriato e crescere a 30 gradi Celsius fino alla fase di blocco, o a un OD600 compreso tra 0,4 e 0,6. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Quindi decantare il surnatante e utilizzare 500 millilitri di acqua distillata sterile, ghiacciata, per risospendere il pellet.

Centrifugare nuovamente le cellule e, dopo aver travasato il surnatante, utilizzare 250 millilitri di glicerolo sterile al 10% ghiacciato per risospendere il pellet. Dopo aver girato le cellule un'ultima volta, utilizzare due millilitri di glicerolo al 10% per risospendere le cellule. Trasferire aliquote da 50 microlitri in provette per microcentrifuga e congelare immediatamente mettendo le provette in un bagno di etanolo con ghiaccio secco.

Conservare le celle a meno 80 gradi Celsius per l'elettroporazione. Per effettuare l'elettroporazione, aggiungere 1 microlitro di plasmide ricombinante a un'aliquota di 50 microlitri di cellule competenti e porre su ghiaccio per cinque minuti. Trasferire le celle in una cuvetta di elettroporazione e impostare l'apparecchio di elettroporazione sulle seguenti impostazioni: capacità di 25 gradi Fahrenheit, 2,5 kilovolt e resistenza di 200 ohm.

Quindi, con la cuvetta nel dispositivo, erogare un impulso. Aggiungere 1 millilitro di terreno di recupero alla cuvetta e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Lasciare che le cellule si riprendano incubando la coltura in un'incubatrice vibrante con rotazione delicata per 60 minuti alla temperatura appropriata richiesta dal mutante.

Per selezionare i trasformanti, pipettare 100 microlitri di coltura su un terreno con piastre di agar e utilizzare uno spandiconcime sterile per distribuire la soluzione. Quindi, incubare per una notte alla temperatura appropriata. Per ulteriori dettagli, fare riferimento al protocollo di testo.

Per eseguire l'analisi di complementazione, trasformare AOH1 con il vettore vuoto pBAD33 o con vettori di espressione dapL utilizzando l'elettroporazione, come appena dimostrato. Piastra la miscela di trasformazione su terreno di agar LB, integrata con 50 microgrammi per millilitro di Dap, 34 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 50 microgrammi per millilitro di kanamicina. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore prima di osservare i risultati.

Con il vettore vuoto pBAD33 o con il vettore che esprime murE, trasformare il mutante TKL-11 utilizzando l'elettroporazione come dimostrato in precedenza in questo video. Piastra i trasformanti su agar LB, integrato con 50 microgrammi per millilitro di tiammina e 34 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo, e incuba le piastre a 30 gradi Celsius per 24 ore prima di verificare la presenza di trasformanti. Test per la complementazione mediante striature o piastre di colonie provenienti da entrambe le trasformazioni di controllo e sperimentali su due piastre di terreno LB, più 0,2% di arabinosio e 50 microgrammi per millilitro di tiamina.

Incubare una piastra a 30 gradi Celsius e l'altra a 42 gradi Celsius per 24 ore prima di valutare il fenotipo di crescita. Trasformare il ceppo mutante Hx699 e il ceppo selvatico Rr217 della specie di novosphingobium con il vettore vuoto pRK290, o un vettore contenente il gene nativo rshNsp in due eventi di trasformazione separati ciascuno, come dimostrato in precedenza in questo video. Piastra i trasformanti su destrosio di patata o agar PD integrato con 10 microgrammi per millilitro di tetraciclina e incuba per almeno 72 ore, o fino alla comparsa dei trasformanti.

Quindi, strisciare i trasformanti in un modello a X su piastre di agar PD fresche con tetraciclina. Dopo l'incubazione a 30 gradi Celsius per almeno quattro giorni, esaminare visivamente il fenotipo di crescita di entrambe le piastre. Il doppio mutante AOH1 di E.coli ospita una mutazione nel gene DapE e una delezione del gene DapD e non crescerà a meno che non venga fornito Dap.

Come si vede qui, il mutante AOH1 che esprime DapLs è in grado di crescere su terreno privo di LLDap convertendo THDP in LLDap nella via della lisi Dap. L'enzima MurE facilita l'aggiunta di m-DAP nel peptidoglicano dei batteri gram-negativi. Il mutante di E.coli MurE, TKL-11, non può crescere a 42 gradi Celsius.

In questo esperimento, solo le cellule TKL-11 trasformate con MurE crescono a 42 gradi Celsius. Una mutazione nel gene TyrB impedisce la sintesi di tirosina e fenilalanina. Tuttavia, come mostrato qui, quando il ceppo mutante TyrB DL39 esprime il gene A.thaliana At5g36160, cresce su terreno M9, privo di tirosina e fenilalanina, dimostrando che l'enzima può sintetizzare la tirosina.

Il mutante Hx699 nelle specie di novosphingobium ospita una proteina RSH non funzionale e produce fenotipo ipomucoidale. Tuttavia, la trasformazione con il gene nativo RSH produce polisaccaridi extracellulari più solubili nella striscia X multicellulare che è ipermucoidale. Al contrario, quando il mutante Hx699 viene trasformato con un vettore vuoto, produce un fenotipo ipomucoidale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 24-48 ore. Se eseguito correttamente, a seconda della crescita dell'organismo modello utilizzato, escludendo la clonazione, la competenza delle fasi di preparazione e trasformazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare i requisiti delle condizioni di crescita dei mutanti utilizzati nell'analisi della complementazione funzionale.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come le tradizionali caratterizzazioni assiomatiche in vitro, al fine di rispondere a ulteriori domande come la specificità del substrato, la temperatura e il pH ottimale, i tassi di velocità somatica, ecc. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della biologia e di molti campi di suddivisione, come la microbiologia, per chiarire la funzione in vivo, o ruolo, degli enzimi di una varietà di organismi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare cellule batteriche elettrocompetenti, come trasformare i batteri usando l'elettroporazione e come valutare la funzione di geni/enzimi usando la complementazione funzionale.

Non dimenticare che lavorare con organismi patogeni può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere le precauzioni necessarie.