Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell'angiotensina II

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di localizzare e quantificare anatomicamente l'espressione del recettore dell'angiotensina II nelle sezioni cerebrali utilizzando l'autoradiografia del recettore e l'identificazione istologica delle strutture cerebrali. Questo metodo identifica le regioni del cervello in cui l'angiotensina II influenza il comportamento, la funzione cognitiva e il sistema cardiovascolare, fornendo informazioni per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento delle malattie neurodegenerative e cardiovascolari. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è quantitativa, qualitativa e consente l'identificazione di recettori funzionali per l'Angiotensina II con maggiore specificità rispetto ad altri metodi.

Questo metodo può anche caratterizzare la funzionalità di altri sistemi di recettori ormonali in tutto il corpo, come i recettori correlati alle droghe d'abuso. Immediatamente dopo la raccolta, posizionare i tessuti cerebrali in stampi cerebrali che simulano l'interno del cranio e avvolgere gli stampi in un foglio di alluminio per una conservazione a meno 20 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, trasferisci i fazzoletti in un sacchetto sigillabile per congelatore e conserva il sacchetto a meno 80 gradi Celsius.

Prima del sezionamento, rimuovere delicatamente il cervello dalla muffa cerebrale. Per sezionare il tessuto cerebrale, trasferire il campione di interesse in un criostato impostato tra meno 10 e meno 18 gradi Celsius. Quando il tessuto si è bilanciato alla nuova temperatura, utilizzare un terreno a base di glicole e resina per incorporare verticalmente una piccola parte del campione in un supporto di tessuto per consentire il sezionamento del piano coronale.

Caricare il tessuto sul microtomo e serrare saldamente il supporto in posizione, quindi iniziare a tagliare il cervello allo spessore desiderato, quindi montare le sezioni sui vetrini del microscopio con orientamento verticale per applicare una superficie maggiore del tessuto al vetrino. Raccogli le sezioni in gruppi sequenziali di cinque. Quando tutte le sezioni sono state raccolte, lasciare asciugare i vetrini all'aria per un massimo di un'ora.

Quindi posizionare i campioni in una scatola di plastica per vetrini in un sacchetto per congelatore autosigillante per la conservazione a meno 20 gradi Celsius. Per etichettare via radio i campioni, rimuovere il primo e il secondo vetrino da ciascun set di cinque e montarli in impugnature per vetrini disponibili in commercio o stampate in 3D. I vetrini del trattino uno sono per il gruppo di trattamento non specifico e i vetrini del trattino due sono per il gruppo di trattamento totale.

Capovolgere i vetrini in 35-40 millilitri di AM5 a temperatura ambiente più i rispettivi inibitori negli appositi barattoli Coplin di pre-incubazione. L'esecuzione di più serie di diapositive può essere travolgente. Pertanto, è estremamente importante posizionare i vetrini nei barattoli di pre-incubazione a intervalli di quattro minuti per assicurarsi che non vi siano sovrapposizioni durante la fase di essiccazione.

Dopo 30 minuti, trasferire i vetrini in buste di incubazione contenenti 10 millilitri di AM5 integrati con la concentrazione appropriata di I125 SI angiotensina II e i rispettivi inibitori del gruppo di trattamento per 60-90 minuti a temperatura ambiente. Determinare l'esatta concentrazione di 125I SI Ang II è fondamentale per consentire di confrontare i recettori dell'angiotensina II da un giorno all'altro. Al termine dell'incubazione, rimettere i vetrini nelle impugnature dei vetrini, bloccare i vetrini e farli roteare delicatamente per uno o due secondi in due contenitori separati da 400 millilitri di acqua distillata.

Dopo il secondo lavaggio con acqua, sciacquare i vetrini con quattro lavaggi sequenziali di un minuto in 30-40 millilitri di AM5. Dopo il quarto lavaggio, agitare delicatamente le sezioni per uno o due secondi in quattro cambi di acqua distillata ghiacciata. Quindi utilizzare quattro asciugacapelli posizionati ad angolazioni diverse per asciugare i vetrini con aria fredda per quattro minuti.

Quando tutte le sezioni sono asciutte, trasferire i vetrini su un tovagliolo di carta. Quindi utilizzare del nastro biadesivo per montare i vetrini, con il fazzoletto rivolto verso l'alto, su un pezzo di cartone per pellicola radiografica in posizione e comprendente almeno un vetrino standard di calibrazione allo iodio 125 per gruppo. Per filmare esporre le sezioni, in una camera buia, posizionare i vetrini di cartone all'interno di una cassetta radiografica con cinturino posteriore e spegnere le luci.

Accendi la luce di sicurezza e apri con cautela una scatola di pellicola radiografica. Posizionare una pellicola, con il lato lucido rivolto verso l'alto con il bordo frastagliato nell'angolo in basso a destra sopra le diapositive nella cassetta. Quindi chiudere con cura la cassetta con le barre di bloccaggio attorcigliate per sigillare la luce e conservare la cassetta a meno 20 gradi Celsius.

Dopo l'appropriato periodo di esposizione, trasferire la pellicola nella soluzione di sviluppo per due minuti seguiti da 30 secondi in bagno di arresto, doppia acqua distillata con acido acetico e quindi cinque minuti in soluzione fissatrice. Lavate la pellicola in una vaschetta di acqua corrente per 20 minuti. Trasferirlo in un refrigerante per circa 10 secondi e appendere la pellicola ad asciugare.

Per l'analisi istologica delle sezioni di tessuto cerebrale, scongelare il cruscotto in tre sezioni in una rastrelliera per vetrini. Successivamente, lavare le sezioni in acqua deionizzata per un minuto, seguito da un'incubazione di 10 minuti in una soluzione di colorante di tionina e tre immersioni in un contenitore di acqua deionizzata. Immergere i vetrini per un ulteriore lavaggio con acqua deionizzata di 30 secondi.

Quindi lavare i vetrini in lavaggi sequenziali con etanolo come indicato. Dopo l'ultimo lavaggio con etanolo al 100%, lavare i vetrini in due contenitori di xilene per tre e cinque minuti consecutivi. Al termine del secondo lavaggio con xilene, coprire il bordo superiore di un vetrino alla volta con un mezzo di montaggio a base di resina, solvente inorganico.

Montare vetrini coprivetrini da 24 x 60 millimetri sui vetrini e lasciare asciugare i vetrini per 48 ore. Quindi scansiona le diapositive e la pellicola nel computer in scala di grigi a 2400 DPI. Per analizzare il film mediante densitometria, dopo la scansione, delineare empiricamente le aree di interesse su ciascun film.

Questa è l'immagine pseudo-colore generata dopo l'apertura della pellicola scansionata nel programma di analisi delle immagini. Includi la densità, l'area di scansione e l'area target totale nelle misurazioni. Regolare le barre dell'area di scansione per assicurarsi che ogni regione di interesse rientri tra i parametri dell'evidenziazione.

Quindi esporta i dati in un foglio di calcolo per determinare l'associazione specifica presente per ogni campione. Le unità standard di calibrazione per la quantificazione sono determinate in base alla data in cui è stato eseguito il saggio. Dopo la scansione delle pellicole, i valori di calibrazione vengono utilizzati per generare una curva basata sulle concentrazioni variabili di standard di iodio 125 per quella specifica pellicola.

La calibrazione e i valori standard sono registrati in triplice copia per garantire la precisione. Le distinzioni tra il legame non specifico e i gruppi totali, nonché le marcature dei tessuti, sono stabilite assegnando ogni insieme di dati ai sottogruppi appropriati. Un valore di soglia più alto deve essere impostato regolando i parametri da rosso a nero, mentre il valore di soglia più basso deve essere impostato vicino allo zero per consentire una misurazione più accurata dell'intera area di interesse scansionata.

Ad esempio, qui le aree finali misurate del nucleo paraventricolare dell'ipotalamo nel gruppo di legame totale rispetto a quelli non specifici vengono confrontate con una sezione colorata con tionina per la conferma anatomica. Il legame non specifico è la quantità di radioligando legato ai recettori non dell'angiotensina in presenza di una concentrazione saturante di ligando non radioattivo del recettore dell'angiotensina I, mentre il legame totale è la quantità di radioligando legato in assenza di ligando non radioattivo del recettore dell'angiotensina I. I valori di legame non specifici possono quindi essere sottratti dai valori di legame totali per ottenere i valori di legame specifici per i recettori dell'angiotensina I.

Una volta padroneggiata, la fase di autoradiografia del recettore può essere completata in circa quattro ore, mentre la fase di sviluppo della pellicola richiede circa 30 minuti per pellicola. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante tenere traccia del tempo per assicurarsi che tutti i vetrini vengano incubati, risciacquati e asciugati esattamente per la stessa durata. A seguito di questa procedura, possono essere eseguiti ulteriori studi sulla morfologia cerebrale per valutare i cambiamenti nelle dimensioni delle regioni che mostrano l'espressione del recettore dell'angiotensina II.

Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori che studiano la farmacologia dei recettori per determinare in che modo le diverse regioni del cervello sono influenzate da vari neuroormoni, neurotrasmettitori e farmaci. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire con successo un test di autoradiografia del recettore, vetrini colorati istologicamente e valutare gli autoradiogrammi per localizzare i recettori in specifiche regioni del cervello. Ricorda che lavorare con la radioattività può essere pericoloso e che per evitare la contaminazione radioattiva è necessario prendere sempre precauzioni come un'adeguata schermatura, contenimento, monitoraggio dell'esposizione e smaltimento.